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방법 논문

기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍

8.8K 조회수

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DOI:

10.3791/56003

⸱

2017년 11월 27일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Mitchell Cancer Institute, University of South Alabama, 2College of Medicine, University of South Alabama, 3Institute for Regenerative Medicine, University of Zurich, 4Department of Dermatology, University Hospital Zurich, 5Center for Applied Biotechnology and Molecular Medicine (CABMM), University of Zurich - Irchel Campus

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 기본 양수 액체와 막 중간 엽 줄기 세포의 화학적으로 완벽 하 게 정의 된 조건에서 비 통합 episomal 접근을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 설명 합니다. 추출, 문화, 프로그래밍, 그리고 엄격한 방법으로 결과 유도 만능 줄기 세포의 특성의 절차 자세히 나와 있습니다.

초록

자가 세포 기반 요법 유도 만능 줄기 세포의 소개와 함께 현실로 한 걸음 더 가까이 있어. 양수 등 막 중간 엽 줄기 세포, 태아 줄기 세포는 독특한 조직 공학에서 및 iPSC 미래 소아 개입 및 줄기 세포 은행으로 프로그래밍에 대 한 약속을 가진 미 분화 세포의 종류를 나타냅니다. 여기에 제시 된 프로토콜 추출에 대 한 최적화 된 절차를 설명 하 고 기본 양수 액체와 막 중간 엽 줄기 세포를 배양 하 고 episomal 생성 유도 만능 줄기 세포 화학적으로 완전히 정의 된 문화에서이 세포에서 인간 재조합 형 vitronectin 고 E8 매체를 이용 하는 조건. -Cytometry, confocal 영상, 기형종 형성과 transcriptional 프로 파일링-엄격한 방법을 적용 하 여 새로운 라인의 특성은 또한 기술 된다. 새로 생성 된 라인 SSEA-1 표식에 대 한 부정 되 고 있는 동안 배아 줄기 세포-Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4-마커를 표현 한다. 줄기 세포 라인 teratomas scid 베이지색 쥐에 6-8 주에 고 teratomas는 포함 모든 3 개의 세균 층의 대표적인 조직. 따라서이 방식은 동물 테스트 하는 매력적인 대안 그리고 모든 라인 만능 간주 bioinformatic pluripotency 평가 알고리즘 글로벌 식 microarray 데이터 전송 라인의 transcriptional 프로 파일링. 새로운 iPSC 라인 차별화 및 조직 공학의 최적화를 포함 하는 다운스트림 실험에서 쉽게 사용할 수 있습니다.

서론

유도 만능 줄기 세포 (iPSC)의 기술 발달 모델링, 잠재적인 세포 대체 요법, 질병 및 약물 및 독물학 심사1,2,3에 대 한 제공합니다. 대체 요법 개념적 세포 주입에 의해 달성 될 수 있다, 체 외에서 분화 (심장 패치) 등 조직 이식 또는 조직 공학에 의해 재생을 유도 합니다. 양수 (AFSC)와 막 줄기 세포 (AMSC)도 이러한 개입에 대 한 셀의 훌륭한 소스가 직접4,5,,67 또는 프로그래밍에 대 한 시작 셀 인구 로 pluripotency8,,910,,1112.

정의 되지 않은 문화 시스템을 사용 하는 초기 접근 또는9,10,,1112생성 방법의 수반 게놈 통합을 요구 하는 프로그래밍. 더 최근의 연구 iPSC 양수 유체 상피 세포에서 생성 하는 덜 정의 된 지하실 멤브레인 첨부 매트릭스 (BMM) 사용 되었다 하더라도 이종 무료 매체를 채택. 그러나, 기형종 형성 분석 결과 시험관 및 분자 데이터 함께 연구에 포함 되지. 양수 내 유체 상피 세포는 신생아 fibroblasts13에 비해 한 약 원죄 높은 재활 효율성이 있다을 발견 했다. 또 다른 연구에서는 양수에서 중간 엽 줄기 세포 또한 iPSC는 훨씬 더 높은 효율12로 재설정을 발견 했다.

만능 줄기 세포 조직 대표자 모든 3 세균 층으로 분화 될 수 있다 하 고 따라서 광범위 한 잠재력을가지고. 소아 환자 prenatally 수확, 프로그래밍, 그리고 그들의 헌 양수 액체 줄기 세포의 조직 공학에서 혜택을 수 있는 그리고 양수 막 줄기 세포 perinatally. 또한, 태아 줄기 세포 (성체 줄기 세포14,15보다 낮은)의 상대적으로 낮은 수준의 수 이론적으로 iPSC16소스 셀에서 관찰된 고정 후 바이어스의 해결에 도움이 됩니다.

여기에 우리가 현재 양수 프로그래밍에 대 한 프로토콜 및 막 줄기 세포의 pluripotency 화학적으로 재조합 vitronectin17 (VTN)18episomal 플라스 미드 사용 하 여 이종 무료 E8 매체를 정의. 프로그래밍에 대 한 셀의 원천으로 양수 액체와 막 셀의 주요 이점은 그들의 가용성을 사전에 속이 고 이렇게 주로 소아 조직 공학에 연구를 도움이 될 것 이라고 perinatally 및 따라서.

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프로토콜

프로토콜 인간 연구에 대 한 윤리 위원회의 기관 지침을 따릅니다. 환자 서 면된 동의 연구는 양수를 사용 하 여 얻은 했다.

이 프로토콜의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의는 남쪽 알라바 마의 대학 정책을 따릅니다.

1. 격리와 기본 양수 중간 엽 줄기 세포의 문화

  1. 양수 내 유체 세포의 도금
    1. 의사에 의해 amniocentesis 과정에서 수확 하는 양수의 2.5 mL의 최소 얻을.
      참고: 라이브 세포와 조직의 모든 처리 살 균 조직 문화 내각에서 수행 해야 하 고 적절 한 개인 보호 장비를 사용 해야 합니다. 기본적인 세포 배양 및 메 마른 기술 숙련도 필요 합니다.
    2. 양수 및 막 셀 (AFMC) 문화 매체를 준비: EBM-2 기저 매체, 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), bFGF의 20 ng/mL, EGF, IGF의 10 ng/mL의 25 ng/mL. 기본 양수 양수 뿐만 아니라 유체 막 줄기 세포의 문화에 대 한 항생제 antimycotic 솔루션으로 매체를 보충 한다.
    3. 0 일에 혼합 양수의 2.5 mL AFMC 문화 매체와 접시의 3.5 mL T25 플라스 크로. 적어도 48 h 식민지의 존재에 대 한 확인 하기 전에 그대로 37 ° C, 5% CO2 에서 품 어.
    4. 5 일에 부착 세포의 식민지 존재 해야 합니다. 부드럽게 바위는 완전히 파편에 준수 한 진공-aspirate 보낸된 중간/양수 내 유체 혼합 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 셀을 꺼내 려 플라스 크. 신선한 AFMC 매체의 5 mL을 바꿉니다.
    5. 또 5 일에 대 한 문화입니다. 중간 단계 1.1.4에에서 설명 된 대로 매일 변경 합니다.
  2. 인간 amnion에서 기본 중간 엽 줄기 세포의 분리
    1. 반응과를 세포 무결성을 최대화 하기 위해 늦어도 24 시간 이내 출생, 최대한 빨리 다음을 얻습니다. amnion의 9 cm2 세그먼트를 잘라, 혈전을 제거 하 고 항생제 antimycotic 솔루션으로 보충 하는 PBS의 30 mL 50 mL 원심 분리기 튜브에 씻어.
    2. 멸 균 10cm 조직 문화 접시에 조각을 벌금 scalpels의 한 쌍을 사용 하 여 막 말하다. 세포 막의 소화와 세포의 추출 조직 분리 시스템을 사용 하 여 달성 될 것입니다. 제조 업체의 프로토콜을 따릅니다.
      참고: 닦지 후 조직의 미세한 조각, 더 높은 셀 번호 소화 후 회복.
    3. 한 조직 분리 관으로는 메스를 사용 하 여 다진된 막 조직 대량 전송 및 RPMI 1640 매체의 4.7 mL와 혼합. ( 재료의 표참조) 분리 효소에 혼합.
    4. 조직 dissociator에 튜브를 장착 하 고 프로그램 "h_tumor_01"를 실행 합니다. 30 분 동안 락 플랫폼에서 37 ° C에서 튜브를 품 어.
    5. 또한 RPMI 1640의 35 mL와 함께 정지를 희석 하 고 50 mL 수집 원심 분리기 튜브 위에 70 µ m 여과기에 적용 합니다.
    6. 원심 분리기 실내 온도에, 폐기 상쾌한 200 x g에서 5 분 RPMI 1640의 5 mL에 펠 릿을 resuspend, hemacytometer를 사용 하 여 셀의 개수와 갓 조직 문화 치료와 혈관으로 10000 셀/c m2 의 조밀도에 접시에 대 한 준비 AFMC 매체 항생제 antimycotic 솔루션으로 보완입니다.
      참고: 불완전 한 소화의 경우 조직의 작은 조각 존재 되며 단일 셀 부족 될 것입니다. 다시 아래로 회전 하 고 한 T75 플라스 크에 전체 펠 릿 접시.
  3. 1 차 AFSC 및 AMSC의 문화
    1. 진공 발음에 의해 AFSC/AMSC의 통로 식민지 보냈다 중간 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 플라스 크에 세포 분리 효소의 2 개 mL를 추가. 5-8 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    2. 셀을 꺼내 려 하 고 정지 AFMC 매체의 동등한 양으로 혼합 데 플라스 크에 누릅니다 (항생제 antimycotic 보충 하셔야 합니다이 시점에서 필요한). 4-5 분 제거 중 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 상쾌한 또는 튜브를 거꾸로 하 고 폐기물 콘테이너로 그것을 비우는 의하여 단순히 200 g에서 원심.
    3. 액체의 나머지 드롭에서 단일 셀 서 스 펜 션으로 펠 릿 헤어 하 도금 AFMC 매체와 혼합 원심 분리기 튜브의 하단을 터치 합니다. 2, 500와 5000 셀/cm2사이 조밀도에 T-플라스 크에 격판덮개.
    4. 변경 매체 매일입니다. 통로 6 넘어 셀 라인 문화 하지 마십시오. 목적으로 프로그래밍에 대 한 낮은 사용 가능한 통로.
    5. 냉동 매체를 사용 하 여 백업으로 AFSC와 AMSC 냉동된 주식을 준비 합니다. 문화는 셀 분리 효소, 4 ° c 5 분 동안 200 g에서 원심 분리기를 사용 하 여 수확.
    6. 상쾌한 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 펠 릿에 셀을 단 수로 바꾸기에 튜브의 하단 터치. Cryovials에 1 × 106/mL 및 약 수의 밀도에 완전 한 동결 매체에 resuspend. -80 ° c.에 하룻밤 냉동 컨테이너에 저장 장기 저장을 위한 액체 질소 다음 이동 합니다.

2. 프로그래밍 Pluripotency에

  1. 재활 플라스 미드를 얻기
    1. 비영리 플라스 미드 저장소를 통해 재활 플라스 미드를 구입. 자료 전송 계약 필요 합니다.
    2. 대장균 유능한 세포는 플라스 미드를 변환 하 고 상용 플라스 미드 추출 키트를 사용 하 여 플라스 미드를 분리. 제조업체의 지침을 따릅니다.
    3. 플라스 미드는 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA의 농도 측정 합니다. 높은 결과 농도, transfection 동안 샘플의 희석을 피하기 위해 이상적으로 1 µ g / µ L 플라스 미드에 대 한 목표.
    4. UV 분 광 광도 계 및 약 수를 사용 하 여 개별 플라스 미드의 농도 측정을 개별적으로.
    5. 믹스 함께 3 µ g, 3 µ g, EN2K, ET2K, M2L 플라스 미드의 2 µ g 각각. 이 재활 플라스 미드 솔루션입니다. 플라스 미드 솔루션의 금액 1 x 106 세포 transfect에 충분 하다. 이러한 여러 aliquots를 준비 합니다.
    6. -80 ° c.에 모든 aliquots를 저장
  2. 대상 문화 접시를 준비
    1. Vitronectin와 함께 한 6 잘 플레이트 코트-각 우물에 vitronectin 희석 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 40 µ L VTN 재고 솔루션 (1 µ g/c m2)의 혼합. 실내 온도 (RT)에 또는 1 시간에 대 한 37 ° C에서 인큐베이터에 둡니다.
    2. 진공-aspirate 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 솔루션 고 각 잘에서 AFMC 매체의 2 개 mL를 바꿉니다. 도금을 셀 때까지 37 ° C에서 저장 합니다.
      참고: 중요 한:이 단계에서 사용 되는 AFMC 매체 어떤 항생제 또는 antimycotic 솔루션 포함 하면 안.
  3. 기본 교양된 AFSC/AMSC 수확
    참고: 문화 충분히 낮은 통로 번호에서 냉동된 주식 고 프로그래밍에 대 한 하나의 T-75 플라스 크 바치에 AFSC/AMSC를 확장 합니다. 몇 가지로부터 100000 세포는 충분 한 실험, 수확을 목표로 약 500000 세포 손실에 대 한 보상에 대 한 transfection 매개 변수 또는 다른 문화 조건 최적화는 테스트를 합니다.
    1. 낮은 통로에 초기 편의에 AFSC/AMSC 1.3.1 1.3.2 단계에서 설명한 대로 셀 분리 효소 혼합을 사용 하 여 수확. 후 셀 centrifuged 되었습니다, 다음 단계를 진행 합니다.
    2. Resuspend 펠 릿 1 ml에서 PBS와 섞어 잘 씻어 혈 청 구성 요소. hemacytometer을 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 100000/mL의 PBS와 약 수를 셀 밀도 조정 합니다. 이 셀과 transfection 사용 되는 버퍼 사이 최소한의 접촉 시간을 보장 합니다.
    3. 5 mL 폴리스 티 렌 튜브 위에 microcentrifuge 관 배치 (어댑터로 하면 원심 일반 스윙으로 터) 및 실 온에서 4 분 x g 200에서 원심 분리기. 튜브를 반전 하 고 폐기물 컨테이너에는 상쾌한 삭제. 고정 각으로 터를 사용 하지 마십시오.
    4. 실 온에서 3 분 200 x g에 추가 원심 분리 단계를 수행 합니다. 이것은 나머지 수 하단에 수집 하는 튜브의 벽에서 액체. 신중 하 게 모든 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 그것의 발음.
  4. Transfection 프로그래밍 플라스 미드와
    1. 실험, 프로그래밍에 대 한 transfection 시스템 ( 재료의 표참조) 사용 됩니다 셀에 재활 플라스 미드를 제공 하. 조직 문화의 장으로 transfection 팁, transfection 튜브, 물의 resuspension 버퍼 및 전해 버퍼를 놓습니다. 키트 시 약에 보관 됩니다 RT, 열 때까지 4 ° c.에 저장 된 다음
      참고: 우리는 10 µ L 버전의 키트를 사용합니다.
    2. Transfection 장치 가까이 관 역 그것의 캐비닛에 직접 배치 수 있도록 이동 합니다. 전해 버퍼의 3 mL와 함께 한 transfection 튜브를 슬롯 안에 모든 방법으로 그것을 추진 하 여 역으로 튜브를 탑재.
    3. 재활 플라스 미드-80 ° C 저장에서 2.1.5 단계에서 준비 하는 솔루션 aliquots 고 문화 캐비닛에 RT에 녹여 수 있도록.
    4. Transfection 장치에서 다음 transfection 매개 변수 선택: 950 V, 40 ms, 그리고 1 펄스.
    5. 100000 셀 10 µ L 물의 resuspension 버퍼에 포함 된 펠 릿 resuspend 신속 하 게이 시점에서에서 작동 때문에 물의 resuspension 버퍼 약간 독성 증가 노출 시간 눈에 띄게 낮은 세포 생존 능력에 있는 결과.
    6. 믹스 (aliquot 솔루션 1 x 106 세포의 총에 대 한 준비를 했다.) 재활 플라스 미드 솔루션의 1/10에.
    7. Transfection 피 펫에 transfection 팁을 탑재 합니다.
    8. 발음 세포 현 탁 액 transfection 팁으로 신중 하 게, 공기 방울의 형성을 방지. 거품은 관찰 하는 경우 정지를 추방 하 고 포부를 반복 합니다. 공기 방울 transfection를 방해 합니다.
    9. Transfection 피펫으로 transfection 튜브에 삽입 하 고 transfection 장치의 화면에서 "시작" 버튼을 누릅니다. Transfection는의 성공에 대해 알리는 화면 메시지를 기다립니다 고 튜브에서 피펫으로 즉시 제거 합니다.
    10. 대상 6 잘 플레이트 섹션 2.2에에서 준비의 1 정지를 추방. 매체는 이웃을 잘 혼합 하 고 두 웰 스 (결과 셀 밀도 50000/잘 될 것입니다)에 정지를 동등 하 게 배포.
    11. 모든 microcentrifuge 튜브 AFSC/AMSC를 개별적으로 포함 하 여 transfection를 반복 합니다. 37 ° C, 5% CO2인큐베이터에 접시를 놓습니다.
  5. Transfected AFSC/AMSC의 문화
    1. 2-5 일 동안 transfected 세포 문화. 다음 E8 나트륨 낙 산 염의 100 µ M와 3 일에 보충 구성 된 재활 매체 전환 합니다.
      참고: 보조 통로 소스 AFSC/AMSC의 전면에 자라 난을 피하기 위해 수행할 수 있습니다. 그러나,는 뿌리고 관심의이 매개 변수는 올바르게 재활 효율을 계산 하는 옵션을 비활성화 됩니다.
    2. 10 일 동안 매일 매일 재활 매체를 변경 합니다. 10 일에서 매일에 매체를 변경 합니다.
  6. 클론 확장을 위해 완전히 reprogramed 식민지의 수동 따기
    1. 완전히 재설정된 식민지 하루 14 나타납니다. 식민지를 크기에서 확장 하 여 압축 될 수 있습니다. 그들은 수 수동으로 선택 되며 빠르면 하루 15-16 신선한 격판덮개 전송.
    2. 따기 절차 전에 1 h 코트 잘 (1 µ g/c m2) 당 vitronectin 희석 버퍼의 300 µ L에 VTN의 8 µ L 24-잘 접시와 RT 또는 37 ° C에서 품 어 나트륨 낙 산 염 없이 E8 매체에 솔루션을 바꿉니다.
    3. 메 마른 문화 캐비닛에 충분 한 크기 (직경에서 이상적으로 400 µ m)의 식민지를 선택 합니다. 단계 대조 현미경 또는 stereomicroscope를 사용할 수 있습니다.
    4. 따기, 캐비닛에 배치 하는 LCD 영상 현미경의 모니터 oculars 필요가 이후 사용 됩니다. 현미경 단계 70% 에탄올으로 소독.
    5. 셀 문화 일반 단계 대조 현미경을 사용 하 여, 선택, 표시, 그리고 식민지 하의 수 있습니다. 이 실제 수확 하는 동안이 프로세스에 대 한 시간 낭비 되지 않습니다 있는지 확인 해야 합니다.
    6. 즉, 0.5 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 30 µ L로 하는 식민지의 수 이상의 PBS PCR 튜브의 수를 입력 합니다. 식민지는 도금 하기 전에 부분 분리가이 관에 배치 됩니다.
    7. 5 선택 하려는 2 µ L. 설정 10 µ L 피 펫을 사용 하 여 접시에서 한 번에 식민지 식민지 가장자리에 각도에서 피 펫 팁을 보유 하 고 신중 하 고 점차적으로 표면에서 전체 식민지를 다쳤어요. 즉시 피 펫 팁에 전체 식민지를 발음 하 고 EDTA 준비 PCR 튜브 중 하나에 그것을 전송.
    8. 나머지 4 식민지와 반복. 4-6 분 RT에서 품 어.
    9. 피펫으로 식민지를 작은 덩어리로 분해 하는 큰 피 펫 팁을 사용 하 여 부드럽게 위아래로 정지. 단일 세포 현 탁 액을 만들지 마십시오.
    10. 정지 단계 2.6.2에서에서 준비 하는 24-잘 접시의 대상에 직접 접시. 나머지 식민지와 반복.
    11. 5 개 이상의 식민지 하 하지만 한 번에 5 개 이상의 식민지를 선택 하지 않는 경우 2.6.6 2.6.10 통해 단계를 반복 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.
  7. 클론 확장 및 iPSC의 성숙
    1. 식민지 성장 하 고 압축 될 수 있습니다. 3-6 일은 충분. 매일 문화 매체를 변경 합니다. 400 µ L의 E8 셀 밀도에 따라 1 mL 사이 사용 합니다.
    2. 충분 한 식민지 밀도 24-잘 접시의 우물 6 잘 플레이트에 확장 될 것입니다. 1 시간 전에 뿌리고, 코트 (2.2.1 단계)로 VTN와 6 잘 플레이트. 다음에 잘 솔루션을 바꿉니다 잘 당 E8 매체의 2 mL.
    3. 1 mL 피 펫을 사용 하 여 소스 우물에서 보낸된 중간 발음 하 고 0.5 m EDTA 씻어 m의 300 µ L를 바꿉니다. 즉시 동일한 피 펫 팁을 사용 하 여 aspirate 다시, 0.5 m EDTA의 300 µ L를 바꿉니다 다음 5 분 발음 1 mL 피 펫을 사용 하 여 모든 액체에 대 한 RT에서 품 어.
    4. 용량 1 mL 피 펫을 설정 하 고, 그것에 1 mL 넓은 구멍 팁을 탑재 대상에서 E8 중간 끝에 발음. 매체의 스트림 소스 iPSC 문화를 씻어.
    5. 대상 잘 헤어 20-50 셀의 덩어리에 식민지를 여러 번 왔다 갔다 피펫으로에 정지를 전송 합니다. 그들은 부드러운 락 및 접시를 떨고에 의해 우물에서 균등 하 게 배포 얻을 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 품 어 다는 것을 확인 하십시오.
    6. 매일 매체와 통로 3 ~ 4 일 마다 변경 합니다. 어떤 차별화 식민지 단계 대조 현미경 아래 표시 될 수 있습니다 및 캐비닛 문화에 피 펫 팁을 사용 하 여 제거. 높은-품질 순수 iPSC 문화의 선택적 전파 수 있습니다.
    7. 뿌리고, 전에 1 h 단계 2.2.1 에서처럼 VTN로 6 잘 플레이트의 웰 스 코트. 다음 솔루션을 바꿉니다 잘 당 E8 매체의 2 ml.
    8. 일상적인 뿌리고는 초기 뿌리고 다 0.5 m EDTA (단계 2.7.2 2.7.5)를 사용 하 여 비슷합니다. 6 잘 플레이트의 한 잘에서 보냈다 매체를를 씻어 버리고 EDTA의 1 mL에 바꿉니다.
    9. EDTA의 1 mL을 추가 하 고 5-7 분 부분 분리에 대 한 RT에서 품 어. 보육 시간 최적화 경우의 정지를 확인 하 고 필요한 주위 20 ~ 50 셀 덩어리 생산 됩니다. 단일 세포로 분리를 하지 마십시오.
    10. EDTA 솔루션을 삭제 하 고 대상에서 1 mL 피 펫을 사용 하 여 넓은 구멍 피 펫 팁에 E8 매체의 1 mL를 발음.
    11. 그것의 원하는 부분을 표면에서 릴리스된 때까지 E8 매체의 스트림 소스 iPSC 문화에서 반복 세척 하 고 잘 전송 대상으로. 이 부분 분할 비율을 나타냅니다 (예를 들어, 1/8는 문화의 옮겨질 수 있다 1:8 비율에 대 한.)
    12. 통로 마다 3-4 일입니다. 다운스트림 실험에 그들을 사용 하기 전에 적어도 15 구절에 대 한 그들을 배양 하 여 성숙 iPSC 라인 허용

3. 특성화 및 Pluripotency의 확인

참고: cytometry confocal 현미경 검사 법에 대 한 자세한 내용은 추가 파일을 참조 하십시오.

  1. 기형종 형성 분석 결과
    1. 기형종 형성 분석 결과 의해 모든 3 개의 세균 층의 대표적인 조직으로 차별화 하는 iPSC의 용량을 확인 하려면 다음과 동물 관리 및 사용, 적절 한 프로토콜을 제출에 대 한 시간을 허용 하도록 미리 계획에 관한 제도적 정책 문서입니다. 쥐에서 기형종 형성 6-10 주가 소요 됩니다.
    2. 4 일 동안 4 우물 iPSC 라인 당 6 잘 플레이트의 문화. 마우스의 한 측면에 주입 하는 세포의 대략 수는 0.5 ~ 1 x 106 셀. 선택 사항: 추가 잘 수 전념 셀 분리 효소로 단일 셀 분리에 의해 잘에서 대표 휴대폰 번호를 확인 하 고 계산.
    3. IPSC 덩어리에서 일시 중지 됩니다 E8/BMM 혼합물의 볼륨 계산: 마우스의 두 측면은 주입, 각각 수 풀 서 스 펜 션의 150 µ L. 3 마우스는 기형종 1 iPSC 라인의 형성을 테스트 하기에 충분. 죽은 볼륨 손실에 대 한 보상 결과 볼륨에 바늘 당 추가 150 µ L를 포함 합니다. 마우스 당 1 바늘 사용 됩니다. 총 볼륨 이므로 3 * (150 µ L * 2 + 150 µ L) = 1350 µ L
    4. 2.7.8 2.7.10 단계에 설명 된 대로 passaged 될 그들이 마치 EDTA와 iPSC 식민지를 부분적으로 해리. 그것은 식민지 수 풀으로 해리 하 고 단일 세포로 분리 되지입니다.
    5. 워시 (3.3.3 단계에서 계산 된 양의 절반), E8 매체의 675 µ L와 iPSC 식민지에서 넓은 구멍 팁을 사용합니다. 5 mL 폴리스 티 렌 튜브에 덩어리 정지를 전송 합니다. 얼음에 놓습니다.
    6. BMM의 675 µ L를 결합 합니다. 주사까지 얼음에 결과 정지를 유지.
    7. Anesthetize 그들을 무력화 하 쥐 isoflurane를 사용 하 여. 이 수행 해야 또는 물고기의 숙련 된 인력에 의해 유도.
    8. 소용돌이 5 mL 폴리스 티 렌 튜브를 짧게 하 고 한 인슐린 주사기 22 G 바늘으로 장착으로 수 풀 서 스 펜 션 (마우스 당 450 µ L)를 발음. 세포 현 탁 액의 150 µ L를 피하 주사. 이 볼륨에는 약 1 × 106 셀을 (단계 3.1.2 참조) 포함 되어 있습니다.
    9. IPSC 라인 당 3 쥐를 주입. 모든 절차에 대 한 적절 한 동물 보호 연습을 따릅니다.
    10. 매일 쥐의 상태를 모니터링 합니다.
    11. Teratomas는 1.5 ~ 2 cm의 끝점 직경에 도달, 쥐를 안락사, explant, teratomas 고 24 h에 대 한 조직 고정을 위한 포 르 말린 용액에 그들을 저장 합니다.
    12. 얼룩 (H & E) 되며 오신 조직학 핵심 시설에 고정된 teratomas를 가져와. 병리학 자는 모든 3 개의 세균 층의 조직의 존재를 학년 것 이다.
      Karyotyping에 대 한 참고: 문화를 제공 해야 하는 라이브 iPSC cytogenetic 실험실은 karyotype의 무결성의 테스트에 대 한 전문. 이 테스트 수행을 하는 것이 좋습니다 모든 5 구절.
  2. Transcriptional 프로 파일링
    1. 2 웰 스 한 RNA 샘플을 얻기 위해 3-4 일 동안 6 잘 플레이트의 문화. 만 높은-품질 문화를 사용 하 여, 세포 분화와 작은 오염 된다고 피펫으로 팁을 사용 하 여 해결할 수 있습니다.
    2. IPSC 문화 상용 키트 다음 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여에서 RNA를 분리. 전문된 게놈 핵심 시설에 샘플 제공.
    3. IPSC 라인 microarrays (지원된 선택에 대 한 테이블의 자료 를 참조) 또는 RNA 시퀀싱의 글로벌 transcriptional 프로필을 가져옵니다.
    4. Coriell 연구소에서 온라인 인터페이스를 통해 pluripotency의 bioinformatic 평가 대 한 "*.idat" 파일을 제출 합니다. 또는 제출 "*.cel" pluripotent 줄기 세포, 존스 홉킨스 대학에서 온라인 인터페이스를 통해 포함 하는 셀 형식의 bioinformatic 식별에 대 한 파일. 개별 bioinformatic 분석 허용 하는 데이터의 종류에 대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오.

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결과

정보 서 면된 동의 유전자 테스트 및 연구에 대 한 액체의 작은 약 수를 누리고 양수를 수확 하기 전에 환자 로부터 얻은 것입니다. 아무 동의 태 반 의료 폐기물을 나타냅니다 연구에 양수 막의 사용에 대 한 필요 합니다. 양수 및 막 줄기 세포는 전형적인 엽 속성을 표시, 형태학 상으로 그들의 세포는 스핀 들-모양 및 위상-밝은. 프로그래밍, 셀 엽-상피 (메트로) 전환 받을 고 조약돌 모양의 형태와 공간 조직 상피 속성을 나타내는 식민지의. 이 과정은 48-72 h episomal 플라스 미드를 프로그래밍의 도입에 따라 일찍 시작 됩니다. 하루 5 프로그래밍의 이러한 식민지의 부재 실험의 실패를 나타내는 것 이다. 메트로 식민지의 세포 증식 하 고 결과적으로 식민지 될 소형 주 5와 14 사이. 소형 메트로 식민지는 개별적으로 쉽게 인지할 수 (그림 1A) 있지 않은 셀의 구성 되어 있습니다. 하루 14, 완전히 재...

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토론

태아 줄기 세포에서 iPSC 생성의 초기 단계 태아 조직, 그들의 문화, 확장, 및 episomal 재활 플라스 미드의 소개에서 원본 셀의 추출 수반. 이 단계 뒤에 문화 기간 약 14 ~ 18 일 전에 첫 번째 완전히 재설정된 식민지 확장 될 수 있다. 마지막 단계는 iPSC 클론의 성숙. 양수 막 줄기 세포의 초기 추출은 amnion의 결합 된 기계 및 효소 소화에 의해 이루어집니다. 우리는 30 분의 부 화 시간이 결과 높은 생존 능력으로 추출 셀 수가 가장 발견. 소화 절차 조직 및 세포 덩어리의 작은 조각을 생성할 수 있습니다. 단일 셀을 기준으로 이들의 비율이 높은 경우, 이후 모든 부착 셀 outgrowths에 기여할 수 있는 한 그릇에 모든 덩어리와 단일 세포를 도금 하는 것이 좋습니다. 셀만 문화 매체와 혼합 하 고 알을 품을 부착 셀의 식민지는 충분 한 크기에 도달할 때까지 액체 양수 줄기 세포를 도금 하는 것은 간단 합니다. 일반 조직 문화 취급 plasticware 완벽 하 게 적합 한 고도 불구 하 고 이...

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공개 사항

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

이 작품은 대학 취리히, 취리히 대학, 동호회 10.216 및 12.176에 스위스 사회의 심장, 스위스 국가 과학의 SCIEX NMS채널 의 Forschungskredit Fonds Medizinische Forschung에 의해 지원 되었다 재단 보조금 [320030-122273] 아래와 [310030-143992], 7 프레임 워크 프로그램, 생활 밸브, 그랜트 [242008], 올가 Mayenfisch 재단, EMDO 재단, 대학 병원 취리히 시작 그랜트 2012 유럽 위원회 및 미첼 암 연구소의 내부 자금입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
종양 해리 키트, 인간Miltenyi Biotec130-095-929조직 해리 시스템, 시약 키트, 조직 해리 튜브 및 조직 해리 효소
포함 gentleMACS 해리기Miltenyi Biotec130-093-235조직 해리 시스템, 해리기
Thermo Scientific ™ Shandon™ 일회용 메스 No. 10, 멸균, 개별 포장, 5.75 (14.6cm)Thermo-Fisher3120032
70 µ m 세포 여과기Corning10054-456
RPMI 1640 매체Thermo-Fisher32404014 
흔들 플랫폼VWR40000-300
50 ml 원심분리기 튜브Thermo-Fisher339652
15 ml 원심분리기 튜브Thermo-Fisher339650
EBM-2 기초 매체LonzaCC-3156AFMC 매체용 기초 매체
FGF 2 Human (E. coli, non-glycosylated로 표현)Prospec BioCYT-218bFGF, AFMC 매체
EGF Human, PichiaProspec BioCYT-332 보충제;EGF, AFMC 배지용 보충제
LR3 인슐린 유사 성장 인자-1 인간 재조합Prospec BioCYT-022IGF, AFMC 매체
Fetal Bovine Serum 보충제, 배아 줄기세포 자격이 부여된Thermo-Fisher10439024FBS
항생제-항진균제 (100X)Thermo-Fisher15240062 원발성 AFSC/AMSC의 경우, 일상적인 AFSC/AMSC의 경우 필요하지 않으며, 형질주입된 세포의 경우 배지에서 사용하지 마십시오!
Accutase 세포 분리 솔루션StemCell Technologies07920세포 분리 효소
CryoStor™ CS10StemCell Technologies07930완전 동결 매체
PBS, pH 7.4Thermo-Fisher Scientific10010023 
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)Qiagen12362for plasmid isolation
pEP4 E02S EN2KAddgene20925EN2K, 리프로그래밍 인자 Oct4+Sox2, Nanog+Klf4
pEP4 E02S ET2KAddgene20927ET2K, 리프로그래밍 인자 Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4
pCEP4-M2LAddgene20926M2L, 리프로그래밍 인자 c-Myc+LIN28
NanoDrop 2000c UV-Vis 분광 광도계Thermo-FisherND-2000C분광 광도계
Neon® Transfection SystemThermo-FisherMPK5000Transfection System, 구성품:
Neon 피펫 - Transfection 피펫
Neon device - Transfection device
Neon®reg; 형질주입 시스템 10 &마이크로; L KitThermo-FisherMPK1025Neon Transfection System용 소모품 키트, 포함 사항:
Neon tip - transfection tip
Neon tube - transfection tube
buffer R - resuspension buffer
buffer E - 전해 완충액
Stemolecule™ 나트륨 부티레이트StemGent04-0005의 소분자 강화제
;StemCell Technologies07180VTN, 재고 농도 250 &마이크로; g/ml, 1 µ에서 코팅에 사용; g/cm2 in vitronectin 희석 (CellAdhere) 완충액
CellAdhere™ 희석 완충액StemCell Technologies07183vitronectin 희석 완충액
UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0Thermo-Fisher15575020 사용 전에 PBS로 0.5 mM까지 희석
EVOS® FL 이미징 시스템Thermo-Fisher ScientificAMF4300LCD 이미징 현미경 시스템
CKX53 반전 현미경Olympus위상 대조 세포 배양 현미경
피어스&트레이드; 16% 포름알데히드 (w/v), 메탄올-프리Thermo-Fisher28908사용 전에 PBS로 4%로 희석, 희석된 경우 2-8°C에서 저장할 수 있습니다; C 1 주 동안
Perm Buffer IIIBD Biosciences558050투과 완충액, -20 °로 냉각; C 마우스
IgG1을 사용하기 전에κ 이소타입 컨트롤, Alexa Fluor® 488BD Biosciences557782Oct3/4A, Nanog
Mouse IgG1, &kappa에 대한 동형제어; 이소타입 컨트롤, Alexa Fluor® 647BD Biosciences557783isotype control for Sox2
Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488BD Biosciences561628
Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488BD Biosciences560791
Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647BD Biosciences562139
마우스 IgGM, κ 이소타입 컨트롤, Alexa Fluor® 488BD Biosciences401617TRA-1-60 마우스 IgGM에 대한 isotype control
, κ 이소타입 컨트롤, Alexa Fluor® 647BD Biosciences401618이소타입 제어 TRA-1-81
마우스 항-인간 TRA-1-60, Alexa Fluor® 488BD Biosciences330613
마우스 항-인간 TRA-1-81, Alexa Fluor® 647BD Biosciences330705
Mouse IgG1, κ 이소타입 컨트롤, Alexa Fluor® 488BD Biosciences400129SSEA-1
Mouse IgG3에 대한 동형, κ 이소타입 컨트롤, Alexa Fluor® 647BD Biosciences401321이소타입 제어 SSEA-4
마우스 안티-휴먼 SSEA-1, Alexa Fluor® 488BD Biosciences323010
마우스 안티-휴먼 SSEA-4, Alexa Fluor® 647BD Biosciences330407
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488Jackson Immunoresearch115-606-0681:600의 희석으로 사용 또는
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647Jackson Immunoresearch115-546-0681:600의 희석으로 사용 또는
DAPIThermo-Fisher ScientificD21490원액 10mM을 추가로 최적화, 작업 용액 Corning®reg의 경우 1:12.000으로 추가 희석
; 마트리겔® 성장 인자 감소, Phenol Red-FreeCorning356231기저막 매트릭스 (BMM)
scid 베이지 마우스, 암컷TaconicCBSCBG-F
RNeasy Plus Mini Kit (50)Qiagen74134RNA 분리 키트
T-25 플라스크, 조직 배양 처리된 Thermo-Fisher156367
T-75 플라스크, 조직 배양 처리Thermo-Fisher
Nunc™ 조직 배양 접시Thermo-Fisher12-567-650 10cm 조직 배양 접시
6-웰 플레이트, 조직 배양 처리된Thermo-Fisher140675
Neubauer 계수 챔버(혈구계)VWR15170-173
Mr. Frosty™ 냉동 용기Thermo-Fisher5100-0001 냉동 용기
FACS 튜브, 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관, 5ml코닝3520585ml 폴리스티렌 튜브
Eppendorf 튜브, 1.5mlThermo-Fisher05-402-961.5ml 마이크로 원심분리기 튜브
PCR 튜브, 200 µ lThermo-Fisher14-222-262
피펫 팁, 100 - 1250 &마이크로; lThermo-Fisher02-707-407좁은 구멍 1 mL 팁
피펫 팁, 5-300 &마이크로; lThermo-Fisher02-707-410
피펫 팁, 0.1 to 10 µ lThermo-Fisher02-707-437
광경 피펫 팁, 1000 &마이크로; lVWR89049-166광각 1mL 팁
유리 파스퇴르 피펫Thermo-Fisher13-678-20A
에탄올, 200 증거Thermo-Fisher04-355-451
와류 믹서VWR10153-842
챔버 커버 유리, 8-well, 1.5mm 붕규산 유리Thermo-Fisher155409유리 바닥 공초점 등급 cultureware
22G 바늘VWR82002-366
인슐린 주사기Thermo-Fisher22-253-260
포르말린 용액, 중성 완충, 10%Sigma-AldrichHT501128-4L이식된 기형종 고정
Illumina HT-12 v4 Expression BeachChipIlluminaBD-103-0204발현 마이크로어레이, PluriTest에서 지원, 제조업체에서 단종
PrimeView Human Genome U219 Array PlateThermo-Fisher901605발현 마이크로어레이(이전의 Affymetrix 브랜드), 곧 PluriTest
; Human Genome U133 Plus 2.0 ArrayThermo-Fisher902482expression microarray(이전 Affymetrix 브랜드), CellNet에서 지원, 곧 PluriTest
PluriTest®Coriell Institutewww.pluritest.org, 다능성의 생물 정보 평가를 위한 무료 서비스, 곧 U133, U219 마이크로어레이 및 RNA 시퀀싱 데이터 CellNet Johns Hopkins University cellnet.hms.harvard.edu 를 지원하기 위해 HT-12 v4 플랫폼에서 마이크로어레이 데이터 - *.idat 파일을 수락
데이터 염기서열분석
재프로그래밍 TeSR-E8 StemCell Technologies 05940 E8 매체 Vitronectin XF&trade은 156499GeneChip&trade에 의해 지원될 예정에서 지원;합니다.

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