방법 논문

Chromatin Immunoprecipitation을위한 Cross-linked Skeletal Musculus로부터 고품질 핵을 준비하기위한 Filtration 기반 방법

DOI:

10.3791/56013

⸱

2017년 7월 6일

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas Health Science Center at Houston

이 논문에서

요약

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우리는 cross-linked 마우스 골격근으로부터 고품질의 핵을 분리하기위한 여과 기반의 프로토콜을 제시했습니다. 우리는 초 원심 분리의 필요성을 제거하여 쉽게 적용 할 수있게했습니다. 우리는 핵에서 준비한 염색질이 염색질 면역 침전 및 염색질 면역 침전 시퀀싱 연구에 적합 함을 보여줍니다.

초록

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Chromatin immunoprecipitation (ChIP)은 염색질 DNA에 결합하는 단백질을 결정하는 강력한 방법입니다. 그러나, 섬유가 풍부한 골격근은 근원 섬유의 오염을 최소화하면서 고품질의 핵을 분리하는 기술적 어려움으로 인해 ChIP에 대한 도전 과제였습니다. 이전의 프로토콜은 가교 결합 전에 핵을 정제하려고 시도했는데, 이는 연장 된 핵 준비 과정 동안 DNA- 단백질 상호 작용의 변화를 초래할 위험이있다. 현재의 프로토콜에서, 우리는 먼저 쥐에서 수집 한 골격 근육 조직을 교차 결합시키고, 조직을 다듬고 초음파 처리 하였다. 우리는 초 원심 분리가 교차 결합 된 근육 조직을 사용하여 근원 섬유에서 핵을 분리 할 수 ​​없다는 것을 발견했기 때문에 중요한 근섬유 오염이없는 고품질의 핵을 얻기 위해 순차 여과 절차를 고안했습니다. 우리는 초음파 장비를 사용하여 염색질을 준비하고, 항 -BALAL1 항체로 ChIP 분석을 실시하여 강력한 일사 항 결합유전자 발기인을 표적으로하는 BMAL1의 패턴. 이 여과 프로토콜은 cross-linked 골격근 조직으로부터 고품질의 핵을 분리하는 데 쉽게 적용 할 수있는 방법으로, 일주기 및 기타 시간에 민감한 연구에 일관된 시료 처리가 가능합니다. 차세대 시퀀싱 (NGS)과 함께, 우리의 방법은 골격 근육 기능에 초점을 맞춘 다양한 기계 및 게놈 연구를 위해 배치 될 수 있습니다.

서론

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골격근은 생리학 및 행동에 중요한 역할을합니다. 다핵 근섬유는 액틴과 미오신이 수축력을 생성하는 근육 절개 (sarcomeres)라고 불리는 기능 단위를 형성하는 근원 섬유 (myofibrils)로 구성됩니다. 골격근은 체내에서 가장 큰 대사 기관이기도하며, 식후 80 %를 초과하는 포도당 섭취량과 인슐린 반응과 대사 항상성을 조절합니다 1 , 2 . 근육 생리와 신진 대사는 24 시간 내내 시계에 의해 밀접하게 조절되며, 본질적인 생물학적 타이머 인 3 , 4 , 5 , 6 . 예를 들어, 생체 시계 핵심 구성 요소 중 하나 인 Bmal1 의 골격 근육 특이 적 결실은 인슐린 저항성을 초래하고 골격근에서의 포도당 섭취를 감소 시켰으며 동물은 제 2 형 당뇨병을 발생시키는 것으로 밝혀졌습니다. 나는또한 골격근은 전신 대사 및 생리를 조절하기 위해 myokines를 분비하는 내분비 기관으로 점차 인식되고 있습니다. 골격근에서의 이러한 조절 기능을 완전히 이해하려면 역학 연구가 필요합니다.

ChIP는 DNA 결합 단백질의 프로모터 모집을 묘사하는 강력한 접근법입니다. ChIP는 처음에 염색질 DNA 9 , 10 에서 뉴 클레오 솜 조직을 확인하기 위해 개발되었습니다. 포름 알데히드, 디메틸 설페이트 또는 자외선 조사 (UV) 11,12를 사용하여 다양한 방법으로 단백질과 염색질 DNA를 가교 결합시키는 것으로보고되었습니다. 포름 알데히드 교차 결합은 가장 일반적으로 사용되는 것으로, 염색질 구조와 DNA- 단백질 상호 작용을 보존합니다 9 , 13 , 14 . 교차 결합 크로마토 그래피in은 sonication에 의해 파쇄되고 관심의 특정 DNA 결합 단백질 15 , 16 에 대한 항체와 immunoprecipitated입니다. 최근 몇 년 동안 ChIP와 NGS가 결합 된 ChIP-sequencing (ChIP-seq)이 게놈 차원의 전사 인자 바인딩 17 을 조사하고 경우에 따라 시간 경과에 따른 동적 변화를 모니터링하기 위해 개발되었습니다 18 , 19 , 20 . 예를 들어 circadian ChIP-seq 연구는 circadian clock 구성 요소와 히스톤 마커의 게놈 결합의 고도로 조율 ​​된 서열을 밝혀 냈습니다.이 마커는 ~ 24 시간 circadian cycle 18 동안 일시적으로 정확한 유전자 발현을 유도합니다.

가장 많이 사용되는 ChIP 프로토콜은 연조직 ( 예 : 간, 뇌 등 ) 용으로 설계되었으며, 골격활 근육. 섬유가 풍부한 골격근을 균질화하고 고품질 핵 21을 분리하는 것은 기술적으로 어렵습니다. 특히 교차 결합이 필요한 ChIP 실험의 경우 더욱 그렇습니다. 최근 근육 ChIP 연구 22에서 , 위성 세포는 근섬유로부터 분리되었고, 핵은 조직 소화를 포함하는 장기간의 절차를 통해 양 세포 유형으로부터 준비되었다. 격리 된 핵에서 포름 알데히드 가교 결합을 수행하기까지 전체 공정을 완료하는 데 약 3 시간이 걸렸습니다. 이 절차로 인해 근육 조직이 근육 조직을 효율적으로 균질화되지 못하도록 만들었으며 고품질의 핵을 생성 할 수 있었지만 조직 수집에서 핵 가교로의 상당한 시간 지연으로 인해 DNA가 변경 될 위험이 있습니다 - 단백질 상호 작용. 대조적으로, 대부분의 연구는 실시간 DNA-protei를 보존하기 위해 실험적 치료 또는 조직 수집 직후 가교 결합을 수행했다바인딩 12 . 가교 결합 이전의 핵 분리의 두 번째 단점은 전형적으로 3 ~ 4 시간 간격으로 발생하는 24 시간 샘플 수집과 같이 시간에 민감한 애플리케이션을 배제한다는 점입니다. 핵을 가교 결합시키지 않으면 절개 직후에 분리가 진행되어야하며, 시간이 경과 된 후에 가교 샘플을 함께 처리 할 수 ​​있으므로 실험 일관성이 향상됩니다.

미가공 골격근으로부터의 핵 분리에 대한 다른 프로토콜도보고되었다. 두 개의 연구는 잔류 근원 섬유 및 세포 잔해로부터 핵을 분리하기위한 구배 초 원심 분리의 사용을 기술하고있다 23 , 24 . 수크로오스 또는 콜로이드 성 구배 초 원심 분리가 미가 교 근육 조직에 효과적이지만, 본 발명자들의 실험에 의하면 가교 결합 후 구배 초 원심 분리가 세포를 세포로부터 분리 시키는데 실패했다그라디언트에 ebris.

따라서 우리는 가교 된 마우스 골격 근육 조직을 이용하여 고품질의 핵을 분리하는 절차를 개발했습니다. 그라디언트 초 원심 분리보다는 핵을 파편과 효과적으로 분리하기 위해 연속 여과 방식을 고안했습니다. 초음파 처리 후, 염색질 샘플은 표적 프로모터에 결합하는 BMAL1 단백질의 일주기 패턴을 나타내는 ChIP 연구에 성공적으로 적용되었다. 우리의 방법은 근육 조직에 대한 다양한 기계 연구에 광범위하게 적용될 수 있습니다.

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프로토콜

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동물 보호는 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 지침에 따라 수행되었으며, 절차는 휴스턴에있는 텍사스 보건 과학 센터의 승인을받은 동물 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 가교 골격근에서의 핵 분리

  1. 이전에 자세하게 설명 된 바와 같이, 약 20 주령의 C57BL / 6 수컷 마우스에서 단리 된 뒷다리 골격 근육을 체중을 줄이고 빙냉 인산 완충 식염수 (PBS)에서 말린 것.
    참고 : 우리는 일반적으로 하나의 마우스에서 1.0 - 1.5 g의 골격근을 얻습니다.
    1. 얼음에 10 ML PBS를 포함 50 ML 원추형 튜브에 다진 골격 근육 조직을 놓으십시오.
  2. 4 X에서 300 XG에서 5 분 동안 원심 분리하십시오.
  3. 조심스럽게 흡인으로 PBS 상등액을 제거합니다.
  4. 1, 2, 3 및 4 mL의 물을 가진 참조 튜브를 사용하여 각 50 mL 튜브의 펠릿 체적을 측정합니다.
  5. 7 권 추가빙냉 된 1 % 포름 알데히드를 PBS에 넣고 프로브 조직 균질기를 사용하여 얼음 위에서 시료를 균질화합니다 ( 표 2 참조).
    참고 : 선택 사항 : 균질화 절차는 차가운 방에서 수행 할 수 있습니다.
  6. 실온에서 10 분간 배양하여 샘플을 교차 결합시킨다.
  7. 1 M 글리신을 0.125 M의 최종 농도로 첨가하여 가교 결합 반응을 켄 칭하고 실온에서 5 분 동안 배양한다.
  8. 4 ° C에서 5 분 동안 3,000 xg에서 샘플을 원심 분리하십시오. 포부를 통해 상징액을 제거하십시오.
  9. 새로 첨가 된 프로 테아 제 억제제 (0.2 mM 페닐 메틸 술 포닐 플루오 라이드 (PMSF))를 함유하는 얼음 - 차가운 염기 완충액 (pH 7.3의 10 mM HEPES-KOH, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT) , 및 10 μg / mL leupeptin). 4 ℃에서 5 분간 3,000 g으로 원심 분리하고주의 깊게 흡인에 의해 상등액을 제거한다.
  10. 6 ML의 용해 버퍼 (10 MM HEPES-KOH에서 p에서 펠렛을 Resuspend새로 첨가 된 프로테아제 억제제 (0.2 mM PMSF, 10 μg / mL leupeptin)가 포함 된 2 차 항체 (H 7.3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 0.5 mM DTT, 1 % Triton X-
  11. prechilled 15 ML Dounce 호모 제 나이저에 샘플을 전송하고 얼음에 10 분 동안 품어. 핵을 해제하기 위해 꽉 유봉과 15 스트로크 다음 느슨한 유봉을 사용하여 15 슬로우 스트로크와 얼음에 각 샘플을 균질.
  12. 셀 스트레이너 (기공 크기 : 100 μm)를 통해 균질 액 (6 mL)을 여과하고 4 mL의 용해 완충액으로 헹구십시오. 4 ° C에서 10 분 동안 1,000 xg에서 샘플을 원심 분리하십시오. 얼음처럼 차가운 염기 완충액 5 mL에 Resuspend하고 단단한 유봉으로 핵을 방출하기 위해 10 회 dounce합니다.
    1. 분광 광도계 (OD260 / OD280)로 DNA 농도 측정을 위해 20 μL의 분취 량을 제거하고 필요한 경우 트리 판 블루로 현미경으로 관찰합니다 (아래 참조) ( 그림 1A ).
  13. 서스펜션을 통해 필터링셀 스트레이너 (기공 크기 : 70 μm), 튜브를 헹구고 상기와 같이 2 mL베이스 완충액으로 다시 여과한다.
  14. 점차적으로 감소 된 구멍 크기 (40 μm, 30 μm, 20 μm 및 10 μm)의 세포 여과기로 단계 1.13 에서처럼 여과를 반복하십시오.
    참고 : 총 6 개의 구멍 크기의 여과기가 1.12-1.14 단계에서 사용되었습니다.
  15. 4 ℃에서 1,000g에서 10 분간 원심 분리한다. 뜨는을 제거하고 500 μL 기본 버퍼에서 펠렛을 resuspend.
  16. 위와 같이 DNA 농도를 측정하십시오.
    참고 : 한 동물의 두 가지 뒷다리를 결합하여 약 200 μg의 핵 DNA를 얻었습니다. 선택적으로 트리 판 블루 얼룩 (재고 농도 0.4 %, 1시 5 분 희석)과 현미경 관찰 20 μL 저장; 핵은 파란색으로 얼룩지게됩니다 ( 그림 1B ).
  17. 4 ℃에서 1,000g에서 10 분간 원심 분리하고 상등액을 버린다. -80 ° C에 저장 펠렛.

2. 초음파 처리

  1. SDS 용해 버퍼 500 μL에서 샘플을 해동하고 부드러운 pipetting와 resuspend.
  2. 얼음에 유리 바이알에 핵 DNA 현탁액을 전송합니다.
  3. 접시 모양의 변환기에서 초음파 음향 에너지의 초점을 맞춘 버스트로 초음파 처리를 실행하십시오. 장비 세부 사항은 표 자료 를 참조하십시오. 다음 설정을 사용하십시오 : 버스트 당 사이클 : 200; 강도 : 5; 듀티 사이클 : 20; 온도 4 - 6 ° C; 30 초 온 / 오프.
    참고 : sonication 효능을 평가하는 예제가 그림 2에 나와 있습니다.
  4. sonicated 염색질을 1.5 ML 튜브로 전송하십시오. 15 분 12,000 XG에서 원심 분리기 및 새로운 튜브로 뜨는을 전송하십시오. 65 ° C에서 하룻밤 역방향 crosslinking위한 새로운 1.5 ML 튜브에 sonicated 샘플 (~ 7-10 μg / 근육 샘플) 50 μL를 전송합니다. -80 ° C에서 나머지 샘플을 고정 시키십시오.

3. 초음파 및 정량 평가

  1. 1.0 추가보존 50 μL sonicated 샘플에 RNase A (500 U / ML RNase A : 20,000 U / ML RNase T1) μL과 37에서 30 분 품어 ° C.
  2. 프로 테아 제 K (10 MG / ML) 8 μL를 추가하고 55에서 30 분 품어 ° C.
  3. DNA 추출 키트를 사용하여 DNA를 수확하십시오.
    1. 결합 버퍼 5 부피를 추가하고이를 회전 컬럼에 가하고 4,000 xg, 10 분간 원심 분리한다.
    2. 패스 스루를 같은 컬럼에 넣고 다시 원심 분리하십시오.
    3. 13,000 xg, 1 분에 2 회 세척 완충액으로 씻으십시오.
    4. 13,000 xg, 1 분에 다시 원심 분리하여 컬럼을 건조시킨다.
    5. H 2 O 50 μL를 넣고 13,000 xg에서 1 분간 원심 분리하여 DNA를 용리한다.
    6. 패스 스루를 같은 컬럼에 넣고 다시 원심 분리하십시오.
  4. 분광 광도계 (OD260 / OD280)로 DNA 양을 정량하십시오. 초음파 처리 된 제품 ( 그림 2 )의 크기와 양 (1 μg)을 평가하기 위해 0.8 % 젤에서 샘플을 실행하십시오.
    참고 : 평균 염색질 수율은 약 ~ 20 %입니다.

4. 칩

  1. 이전에 저장된 염색질을 -80 ° C에서 녹이고 튜브 당 ~ 100 - 120 μg로 염색질을 분액합니다. 방사 면역 침전 분석 (RIPA) 버퍼 (20mM 트리스 -HCl (pH 7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM NaF, 1mM Na3VO4, 1mM PMSF, 1x 프로테아제 억제제 칵테일 (PIC), 0.1 % Na- 데 옥시 콜레이트 w / v), 1 % 트리톤 X-100).
    1. 각 그룹에 여러 개의 샘플이있는 경우, 같은 양의 염색질 DNA를 ~ 100 - 120 μg / sample의 최종 양으로 합치십시오. 10 %를 입력으로 저장하십시오.
  2. BSA 사전 차단 (~ 2 시간, 4 ° C) 단백질 A / G 아가로 오스 (비 치킨 항체) 또는 IgY 비드 (치킨 항체) 40 μL (RIPA 완충액에 50 % v / v 슬러리)를 첨가하고 4 ° C에서 3 시간 동안 회전기.
  3. 1,000 xg, 10 분에서 원심 분리기로 신중하게 상청액을 새 튜브로 옮긴다.
  4. ~ 1 μg 항체 당 항체를 ~25 - 100 μg 염색질 DNA.
  5. 4 ° C에서 약 15 rpm으로 하룻밤 부드럽게 회전시킨다.
  6. BSA - 사전 차단 (~ 2 H, 4 ° C) 단백질 A / G 아가로 오스 (비 치킨 항체) 또는 IgY 구슬 (치킨 항체) 믹스 10 μL를 추가하고 차가운 방에서 2 시간 동안 회전합니다.
  7. 구슬을 다음과 같이 씻으십시오. RIPA 완충액 1 mL 씩으로 2 회 3 분간 씻고 고염 완충액 (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 % Triton X-100) 1 분간 LiCl 완충액 (20mM Tris-HCl (pH 7.4), 250mM LiCl, 2mM EDTA, 1mM PMSF, 1 % Na- 데 옥시 콜레이트, 0.5 % NP40)로 3 분간 두 번 씻는다.
    1. 1 분간 Tris-EDTA (TE) 완충액 (10mM Tris-HCl (pH 7.4), 1mM EDTA)으로 3 분간 씻는다. 그런 다음 용리 완충액 (20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA 및 0.5 % SDS)으로 DNA를 용리한다.
  8. 1,000 g에서 1 분간 원심 분리하고 조심스럽게 상층 액을 제거한다.
  9. 용리 버퍼 50 μL로 비드를 Resuspend.
  10. 10 시간 동안 품어 라.65 ℃에서 분.
  11. 5 분 동안 12,000 g에서 원심 분리하십시오.
  12. 새 튜브에 뜨는을 전송, 또 다른 50 μL를 추가하고 5 분 12,000 g에 다시 한번 원심 분리기. 최종 용리 부피는 100 μL입니다.
  13. 역 가교 결합 및 DNA 용리.
    1. 65 ° C에서 밤새 용리 된 염색질을 배양한다.
    2. 37 ℃에서 30 분 동안 배양하고 RNase A 1.0 μL를 첨가한다.
    3. 프로 테아 제 K (10 MG / ML) 8 μL를 추가하고 55에서 30 분 품어 ° C.
    4. 제조 업체의 프로토콜에 따라 50 μL에서 용출 볼륨과 PCR 청소 키트를 사용하여 DNA를 수확.
  14. 이전에 설명한대로 실시간 qPCR로 프로파일을 분석하십시오 25 , 26 .
    참고 : 프라이머 서열은 그림 3 범례에 나와 있습니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다 ( 그림 3 ).

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결과

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여기에서는 실시간 DNA- 단백질 상호 작용을 보존하기 위해 조직 수집 직후에 포름 알데히드 가교 결합을 수행했습니다. 그러나, 우리는 핵 분리 23 , 24에 일반적으로 사용되는 자당이나 콜로이드 그라디언트가 근원 섬유에서 핵을 분리하는 데 효과적이지 않음을 발견했습니다 (데이터는 표시되지 않음). 그 이유는 교차 결합이 핵과 근원 섬유에 대해 비슷한 중력을 부여했기 때문일 수 있습니다. 따라서, 우리는 핵 모서리로부터 큰 근원 섬유 및 다른 부스러기를 효과적으로 제거하기위한 직렬 여과 공정을 개발했습니다. 100 μm 여과 후, 여전히 큰 조직 파편과 근원 섬유가있었습니다 ( 그림 1A ). 대조적으로, 순차 여과가 끝나면 대다수의 큰 조직 파편, 손상되지 않은 세포 및 큰 근원...

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토론

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여기서 우리는 가교 결합 된 골격 근육 조직이 고품질의 핵을 분리하는 데 사용되는 견고한 방법을 설명합니다. 순차적 인 여과가 파편으로부터 핵을 효과적으로 분리하기 위해 수행되었고, 접시 형 변환기의 초음파 음향 에너지가 ChIP 분석을 위해 염색질을 전단했다. 그 결과는 표적 프로모터에 BMAL1의 24 시간 특정 결합을 보여 주었다.

ChIP는 가교 결합이 일어날 때 게놈 DNA에서 실시간 단백질 점유를 포착하기 위해 사용될 수 있습니다. 이 잠재력을 이용하기 위해 우리는 조직 해부시 골격근의 교차 결합을 허용하고 구배 초 원심 분리없이 핵 분리를 간소화하는 방법을 개발하는 것을 목표로 삼았습니다. 간과 같은 연조직에 비해 섬유가 풍부한 골격근을 균질화하는 어려움으로 인해 우리는 얼음처럼 차가운 PBS에서 근육 조직을 다진 한 다음 샘플을 포름 알데히드 완충액으로 균질화했습니다. 담금질 후 조직 현탁액원심 분리하고 얼음 - 차가운 염기 완충액으로 헹구어 남아있는 모든 포름...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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도움을 청하기 위해 Karyn Esser, Nobuya Koike, Noeon Park에게 감사드립니다. 이 작품은 부분적으로 NIH / NIGMS (R01GM114424)가 S.-HY에, Robert A. Welch Foundation (AU-1731)과 NIH / NIA (R01AG045828)가 ZC

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강한>재료
포름알데히드 용액시그마 알드리치F8775 
GlycineFisher ScientificBP381-5
Trypan Blue 용액 (0.4%)Fisher Scientific15250061
RNase ASigma Aldrich10109142001
Protease KSigma Aldrich3115887001
Chicken Anti-BMAL1 항체항원 aa 318 - 579에 대해 닭고기(Cocalico Biologicals)에서 생성되었으며 IgY는 동일한 항원을 사용하여 친화성 정제되었습니다. 
치킨 IgY 침전수 레진GenScriptL00405
Equipment
KINEMATICA  Polytron PT2100 벤치탑 균질화기Fisher Scientific08-451-178
15 mL Dounce 조직 분쇄Whearton357544
Falcon Cell Strainers 100 µ mFisher Scientific08-771-19
팔콘 세포 여과기 70 &마이크로; mFisher Scientific08-771-1
팔콘 세포 여과기 40 &마이크로; m피셔 사이언티픽08-771-2
pluriStrainer 30 µ mPluriSelect43-50030-03
pluriStrainer 20 &마이크로; mPluriSelect43-50020-03
pluriStrainer 10 &마이크로; mPluriSelect43-50010-03
Covaris S2 집중-초음파 발생기Covaris모델 S2
Labquake Thermo ScientificC415110
CCD 현미경 카메라  Leica MicrosystemsDFC3000 G
Reagent Kit
DNA 추출 키트Thermo ScientificK0691
Buffers
모든 완충액 성분은 프로토콜에 설명되어 있습니다. 각 구성 요소는 Sigma Aldrich
기 에서 구입했습니다.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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