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방법 논문

끄 덕 임에서 부분 Hepatectomy 후 Hepatocytes의 intrasplenic 이식 SCID 마우스

14K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56018

⸱

2018년 2월 10일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Institute of Immunology

이 논문에서

요약

우리는 끄 덕의 부분 hepatectomy (PHx) 및 비장을 통해 세포 이식 수행을 위한 프로토콜을 설명 했습니다. SCID (끄 덕 임. CB17-Prkdcscid/J) 쥐. 이 프로토콜에서 절 개 노출 하 고 셀의 intrasplenic 이식에 대 한 또 다른 절 개에 의해 따라 간 좌 엽 resect 이루어집니다.

초록

부분 hepatectomy 간 재생 및 다양 한 병 적인 조건에서 세포 기반 치료제의 효과 공부 하는 다양 하 고 재현할 수 방법입니다. 또한 부분 hepatectomy에 간 쪽으로 가속 neovascularization 및 셀에 의해 증가 engraftment와 이식된 세포의 증식 촉진 한다. 여기, 우리 immunodeficient 끄 덕을 결합 하 여 비만 아닌 당뇨병/심한의 비장에 30 %hepatectomy 이식 세포의 수행에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. SCID (끄 덕 임. CB17-Prkdcscid/J) 마우스.

이 절차에서는 두 개의 작은 절 개 만들어집니다. 첫 번째 절 개 노출 하 고, 간 좌 엽을 resect 하는 것입니다 그리고 또 다른 작은 절 개 비장 세포의 intrasplenic 이식에 대 한 폭로 이루어집니다. 이 절차는 어떤 전문된 외과 기술이 필요 하지 않습니다 그리고 그것은 5-7 분 더 적은 스트레스와 고통, 빠른 복구, 및 더 나은 생존에에서 완료 될 수 있다. 우리 마우스 (유전자 변형 C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), 뿐만 아니라 부분적으로 hepatectomized 끄 덕에에서 인간의 기원 (NeoHep)의 세포 처럼 hepatocyte 표현 녹색 형광 단백질 (GFP)에서 절연 hepatocytes의 이식 설명 했다. SCID 쥐입니다.

서론

현재, hepatocyte 이식 데 심한 간 장애 환자 치료에 대 한 전체 장기 이식의 대 안으로 제시 된다. 그것은 전체 장기 이식1환자 다리 수 믿 었 다. Allogenic hepatocytes2뿐만 아니라 xenogenic hepatocytes3 및 줄기 세포4 에서 파생 된 hepatocytes는 또한 되 고 조사 동물 모델에서. 이 컨텍스트, 추적 및 engraftment 받는 사람에서 이식된 세포의 잠재력 급성 간장 장애 (AHF)에 따라 셀 치료에 대 한 중요 한 기준입니다.

조사 hepatocytes 또는 hepatocyte 같은 셀5의 이식, AHF 수술6 또는 약리학7 절차, 뒤에 세포 이식 동물 모델에서 만들어집니다. 약리학 적인 시 약, 많은 hepatotoxins d galactosamine8, 아 세트 아미노 펜9, 사염화 탄소10, thioacetamide11, Concanavalin A12, lipopolysaccharide13 AHF 동물 모델을 , 등., 사용 되었습니다. 이 목록에서 모든 시 약 AHF, 독특한 기능 집합이 생성 하지만 불행히도 아무 단일 시 약 인간의 AHF 모방. 또한, hepatotoxins에 의해 유도 된 AHF는 시간이 오래 걸립니다, 만성 스트레스는 동물을 박 았, 그리고 재현성 결과 얻기 어렵다.

다른 한편으로, 부분 hepatectomy (PHx)의 수술은 기술 종속, 고 재현성 결과 필요한 능력 개발 후 얻을 쉽습니다. 혼자 외 과적으로 AHF을 유도, 간 70% 이상의 절제가 필요; 그러나, 70 %hepatectomy 여전히 engraftment의 확산을 공부 하 고 이용 될 수 있다 보다는 더 적은 셀 간 손상14동안 그들의 치료 용량을 분석 하기 위한 간 이식. Hepatocytes의 이식 복15, 꼬리 정 맥16,17간 정 맥 또는 비장18통해 수행된 게시물 hepatectomy 되었습니다. 현재, 간 정 맥 주입 및 hepatocytes의 intrasplenic 이식으로 재현 하기 쉬운 기본 절차입니다.

이 문서에 우리는 30% 부분 hepatectomy 끄 덕에 대 한 절차를 설명 했습니다. SCID (끄 덕 임. CB17-Prkdcscid/J) 마우스의 왼쪽된 엽 excised입니다. 그것은 이식의 0.2 백만 GFP 표현 마우스 (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) hepatocytes 인간의 기원 NeoHep19 비장에 옵니다. 이 절차에에서 이식된 세포의 engraftment 이끌어 낸다. 이 절차는 최소한 침략 적 및 최소한 고통 스러운 기술.

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프로토콜

이 프로토콜에서 제시 하는 절차는 면역학, 뉴델리의 국립 연구소의 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다. 승인의 직렬 참조 번호는 IAEC #319/13.

참고: 일반 외과 절차20 및 설치류 수술21에 대 한 특정 프로토콜에 우수한 자원 있습니다. 그는 처음으로 동물 수술을 하 고,이 좋습니다 광범위 하 게 연습을 인형에 수술 동물에 작동 하기 전에.

1입니다. 준비

  1. 실험, 계속 하기 전에 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 또는 염 분 준비.
  2. 가 위, 톱니 모양의 집게, 집게를 조직, 면, 면봉, 나일론 스레드, 그리고 다른 마이크로 바늘 홀더 수술 키트를 조립 한다. 압력솥 수술 키트입니다. 특별 한 주의 경우는 면역 손상 끄 덕 취해야 한다. SCID 마우스 프로토콜에 포함 됩니다.
  3. 수술의 끝에 준비에서 완전 한 실험 절차를 수행, 생물 안전에서 캐비닛 클래스 I.
  4. 무게는 끄 덕 임. 수술 하기 전에 오래 된 6-8 주간의 SCID 마우스. 14-18 g 사이 무게 쥐가이 연구에 사용 됩니다.
  5. 헤어 트리머 마우스의 상단 중앙과 증 복 부 영역을 면도. 머리 잘린된 머리카락을 완전히 제거 하려면 주걱으로 크림 지역에 걸쳐 균등 하 게 제거를 적용 합니다. 2-5 분 후 젖은 메 마른 목화의 조각의 도움으로 부드럽게 머리카락을 제거 합니다.
  6. Isoflurane 챔버에 마우스를 놓고 산소 실린더의 밸브를 잠금 해제 합니다. 4 L/min의 속도로 산소 흐름 및 마 취 유도를 4%에서 isoflurane 증발을 유지 합니다.
    1. 마우스는 부드러운 발가락 곤란 하 여 제대로 anesthetized 되었습니다 확인 하십시오.
  7. 장소는 biosafety 내부 수술 보드 장. 마우스의 복 부 부분 직면 하 고 마우스의 앞쪽 부분 isoflurane 및 산소 공급 장치에 연결 하는 코 콘 내부 배치는 그런 동물 수술 보드에 놓습니다.
  8. 2%, isoflurane 증발을 감소 하 고 수술을 통해 그것을 유지.
  9. 마우스의 피부를 소독 하 고 절 어 70% 에탄올 소독 면으로 닦아 하 여 소독.

2. 수술

  1. 부분 Hepatectomy
    1. 칼 과정을 바로 운영가 위의 도움으로는 흉 곽에 평행한 수직, 흉 골 바로 아래 피부에 약 1 ㎝의 가로 절 개를 확인 합니다.
    2. 부드럽게 집게 또는 피부와 복 부 근육 층 사이 구별을 무 균 moistened 면 팁 베인된 지역 주변 복 부 근육 층으로 연결 된 피부를 구분 합니다. 건조를 피하기 위해 메 마른 면 팁을 사용 하 여 PBS를 가진 피부 영역을 만끽해 보세요.
    3. 바로 아래에 칼 복 층 가로 절 개를 하 여 원활 하 게 왼쪽된 엽의 영역을 노출. 폭로 하 고 들어 간 좌 엽 두 moistened 면 팁을 사용 합니다.
    4. 컷의 복 부 측에 면화 팁 중 하나를 배치 하 고 격 막에 다른 면 팁을 배치. 부드럽게 팁, 횡 경 막 쪽으로 배치를 누르고 들어 간 좌 엽에 다른 팁으로 슬라이딩 밀어 줄.
    5. 슬립 해제 왼쪽된 엽 통해 루프와 나일론 스레드를 마이크로 포 셉 또는 면 팁의 도움으로 고 hilum 가까이 왼쪽된 엽의 기지를 향해 루프. 부드럽게 왼쪽된 엽의 기지에 나일론 스레드 루프 아래로 밀어.
    6. 미세 바늘 홀더 및 마이크로 집게를 사용 하 여 왼쪽된 엽 위에 나일론 스레드의 두 끝을 묶어. 다른 쪽에 두 개의 추가 노트를 확인 합니다.
    7. 가 위의 도움으로 묶인된 엽 개 해 부. 스레드 가까이 매우 잘라 하지 마십시오. 경우에 절차는 5 분 이상 지속, 계속 복 막 구멍 및 장기 액체 손실로 인해 건조를 피하기 위해 무 균 PBS와 촉촉한.
    8. 연속 봉합을 사용 하 여 4-0 다 봉합 복을 바느질. 그 후, 최대한 빨리 불연속 봉합 하 여 피부를 닫습니다.
  2. 세포 이식
    참고: GFP 표현 hepatocytes 유전자 변형 GFP 마우스에서 고립 되었다 (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J),이 외에 의해 설명 된 절차에 따라. 22 와 쉔 외. 23 hepatocyte 같은 셀 (NeoHep) 인간의 기원 monocytes24 에서 분화의 이식도 사용 되었다. 그러나, 다른 소스에서 파생 된 세포 프로토콜에도 사용할 수 있습니다.
    1. 약 50 µ L의 Iscove의 수정 Dulbecco의 매체 (IMDM), 0.2 백만 가능한 셀을 일시 중단 하 고 1 mL 인슐린 주사기 30 G 바늘 출장에서 발음. 얼음에 그것을 배치 하 여 주사기 차가운 유지.
    2. 왼쪽된 측면 부분에 수술을 수행 하는 사람을 향해 직면 하는 방식으로 마우스를 놓습니다. 비장 영역을 식별 하 고 transversely 노출 비장을 복 층을 통해 짧은 절 개 뒤 증 지역 근처 피부를 해 부.
    3. 부드럽게 비장 들어올린 두 PBS의 도움으로 구멍 밖에 서 면 팁을 습 하 게 잡고.
    4. 한 손에 두 면 팁으로 신중 하 게 비장을 누른 주사기의 바늘을 비장에 정확 하 게 수직 배치 합니다. 부드럽게 비장을 관통 하 고 바늘을 밀어 안으로 매우 느리게; 바늘 2 m m 보다 더 받아야 하지.
    5. 비장 세포를 주입 하 천천히 주사기의 피스톤을 아래로 밀어. 이식 후 주사기의 바늘을 안정적으로 유지 하 고 천천히 출혈 방지 하려면 비장 또는 셀의 손실에서 그것을 제거 합니다.
    6. 면 팁으로 복 막 구멍으로 비장을 배치 후 연속 4-0 다 봉합으로 봉합 하 여 복 층을 닫습니다. 바느질 같은 봉합으로 불연속으로 피부. 닫는 피부;에 대 한 상처 클립을 사용 하지 마십시오 대신, 4-0 봉합 하 여 그것을 닫습니다. 상처 클립 마우스의 자연 스러운 움직임을 제한 하 고 종종 클립 느슨하게 되 고 신속 하 게 밖으로 나와.

3. 수술 치료

  1. 피부를 닫은 후 주변을 요오드 솔루션 (betadine) 살 균 면 팁을 사용 하 여 두 봉합 사이트 닦아냅니다.
  2. 600 mg/kg 몸 무게 (일반적으로 염 분/마우스의 100 µ L에서 12 mg cefotaxime) intraperitoneally cefotaxime 항생제의 복용량을 주사 1 mL 주사기를 사용 하 여.
  3. 진통 Meloxicam의 매일 복용량으로 줄 1 mg/kg 몸 무게 (일반적으로 12 µ g Meloxicam의 식 염 수/마우스 100 µ L에서) 동물에 intraperitoneally, 수술 후 최대 3 일 동안.
  4. 수술의 완료 후 isoflurane 가스의 흐름을 중지 하 고 개별적으로 통풍이 장에 다시 마우스를 놓습니다.

4. euthanization 및 Characterizations

  1. 실험적인 종점 (1 일 및 10 일 후 수술) 후 기관 동물 윤리 지침에 따라 마우스를 안락사.
  2. 말기 출혈 눈 터미널 총 puncturing 동물에 의해 혈액을 수집 합니다.
  3. 혈액에서 혈 청을 분리.

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결과

30% 부분 hepatectomy 후 hepatocyte 확산: 간 30 %hepatectomy 후 남은 hepatocytes의 확산 immunohistochemical (IHC) 세포 확산 표식 기-67에 대 한 얼룩에 의해 시험 되었다. 하루 게시물 hepatectomy 쥐 했다 안락사, 나머지 간 엽 excised 했다, 및 파라핀 섹션 가져온. 섹션은 뒤에 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 활용 된 이차 항 체와 라벨 기-67 항 체와 스테인드 했다. 디 아미노 Benzidine (한 덩어리)으로 사용 되었다 기판 HRP에 대 한 갈색 색상의 개발에 대 한 스테인드 셀을 식별 하기 위해. 핵 카운터 되며 물과 20 X 객관적인 현미경 아래에서 본 했다. 그림 1 간 섹션의 대표적인 IHC 이미지를 보여준다. 약 13% 셀 (13.66 ± 0.317, N = 3)의 기-67 했다 30 %hepatectomy 마우스 간에서 hepatocyt...

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토론

부분 hepatectomy 조사 간 재생에 대 한 설립된 기술 이며 과도 한 hepatectomy AHF 모델을 모방 하기 위해 보고. AHF의 동물 모델 중 특히 쥐, 설치류는 가장 연구 모델입니다. 최대 70 %hepatectomy 쥐에서 간 상해 모델을 얻기 위해 좋은 생존 율25,26보고 되었습니다. 그러나 누드 및 다른 immunodeficient 마우스, 70 %hepatectomy 치명적으로 알려졌다 고 동물2724 시간 안에 죽 었 다.

미첼과 Willenbring28 2/3 부분 hepatectomy 쥐에 대 한 재현 하 고 잘 용납 방법 설명 했다. 에 끄 덕 임. SCID 쥐는 우리는 hepatectomy 총 간 질량의 30%는 왼쪽된 간 엽 절제술까지 제한 되었다 때 1...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 학과 생명 공학, 면역학, 뉴델리의 국립 연구소에 인도 정부에서에서 받은 코어 그랜트에 의해 지원 되었다. 박사 Bhattacharjee의 현재 주소는 사단의 위장, 간장 학과 및 영양, 아동 병원 로스 앤젤레스.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
가스 마취 시스템Ugo Basile; 이탈리아211000
계량 기계Goldtech; 인도현지 조달
생물 안전 캐비닛 (클래스 I)카르토스 국제;   인도현지 조달
헤어 트리머파나소닉;   일본 ER-GY10 
날카롭고 날카로운 칼날이 있는 직선 작동 가위주요 외과; 인도현지 조달
집게, 톱니 모양,주요 외과 용품; 인도현지 조달
마이크로 니들 홀더  스트레이트 & 커브 메르시안 ;   영국 BS-13-8
1 ml 인슐린 주사기와 30G *5/16 바늘 디스포 밴; 인도
1 ml 주사기 26 G * 1/2 바늘BD; 미국 REF 303060
나일론 실   힘센; 인도(1-0) 현지 조달
MERSUTURES 4-0 멸균 외과 바늘 봉합Ethicon, Johnson & Johnson, IndiaNW 5047
TRUGUT 76cm 4-0 흡수성 외과 봉합봉합사 India Pvt. Ltd; 인도SN 5048멸균 외과 바늘 봉합사 Catgut 크롬
면봉순수 면봉 Pvt Ltd;   인도현지 조달
수술 테이프3M 인도 ; 인도1530-1Micropore 수술 테이프
MicrotomeHisto-line Laboratories, 이탈리아MRS3500
Shandon Cryotome E CryostatThermo Electron Corporation ; 미국
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경Carl Zeiss ; 독일 LSM 510 META
명시야 현미경올림푸스, 일본LX51
자동 분석기튤립, 알토 산트라크루즈, 인도Screen Maaster 3000간 기능 테스트 용 생
화학 분석기 유세포 분석기BD ; 미국 BD FACSverse이식 후 세포의 존재 평가
Veet 제모 크림 Reckitt Benckiser , 인도
FORANEAbbott ; 미국이소플루란 USP 99.9% 
탁심알켐 ; 인도세포탁심 나트륨 주입
포비돈-요오드 용액 윈 메디 케어;   인도베타딘
파라포름알데히드히메디아; 인도GRM 3660
Iscove의 IMDM(Modified Dulbecco's Medium)Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US12200-036
설탕시그마 ; USS0389
티슈 텍사쿠라; 미국25608-930O.C.T 화합물
DAPIHimedia; 인도MB 097
항알부민 염소 PolyclonalThermo Scientific,Pierce, USPA126081
anti-connexin 32/GJB1 Polyclonalabcam, 영국ab64609-500
항GFP 토끼 다클론 산타 크루즈 생명 공학; USSC 8334
Alexa Fluor 594 당나귀 안티-염소  분자 프로브, Thermo Fisher Scientific ;   USA11058
Alexa Fluor 488 당나귀 안티-양  분자 프로브, Thermo Fisher Scientific ;   USA11015
Alexa Fluor 594 치킨 안티 토끼  분자 프로브, Thermo Fisher Scientific ;   USA21442
염소 안티 토끼 IgG HRPInvitrogen, Thermo Fisher Scientific; 미국 65-6120
anti-Ki67 항체abcam, 영국ab15580
항원 마스킹 해제 용액, 구연산 염기벡터 실험실, USH-3300
ProLong 다이아몬드 퇴색 방지 마운트런Life technologies, Thermo Fisher scientific ; USP36966
SGOT(ASAT) KIT산호 임상 시스템, 인도
SGPT (ALAT)KIT 산호 임상 시스템, 인도
알칼리성 인산분해효소 키트(DEA)산호 임상 시스템, 인도
Hematoxylin Solution, Mayer'sSigma ; USMHS16
Eosin Y 용액, 알코올 시그마 ; 미국HT110132
DPX 마운트앤트 시그마; US6522
Melonex(진통제)Intas Pharmaceuticals Ltd; 인도Meloxicam 주사 
DAB 강화 액체 기판 시스템 테트라 하이드로 클로라이드시그마; 미국D3939
, 사 사 트

참고문헌

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