초음파에 쥐 실험 생식 조사에

요약

이 원고는 여성 쥐 생식 및 부인과 조사에 대 한 실험 모델을 설계 하에 수행 하는 초음파의 유틸리티를 설명 합니다. Ultrasonographic 평가 수행 하는 방법에 대 한 단계별 설명을 표시 됩니다.

초록

보조 생식 기술 개발, 인 간에 대 한 연구의 윤리적 한계 쥐 동물 모델 생식 의학에서 널리 사용 되어 왔습니다. 과거에는, 설치류에 생식 개발의 연구 조직 삭제의 일회성 조직학 검사에 기반 되었습니다. 최근, 고해상도 transabdominal 초음파의 발달로, 높은-품질 초음파 이제 생식 시스템을 공부 하는 새로운 방법을 수 있도록, 쥐의 생식 기관 평가를 수행할 수 있습니다. 이미지는 고해상도 ultrasonographic 시스템을 사용 하 여 얻은 했다. 부인과 초음파 28 8 주 오래 된 비 임신 쥐와 5 임신 Sprague-Dawley 쥐에서 수행 되었다. 우리는 생식 기관을 인식 하는 방법을 설명 하 고 전형적인 보기는 발 정기의 여러 단계에서 관련된 구조 주기. 컬러 플로우 도플러는 자 궁 동맥 혈 류를 측정 하 고 임신의 다른 단계 동안 자 궁 혈액 흐름 패턴 변화를 평가 하는 데 사용 되었다. 우리는 초음파 탐사 내부 생식 기관에 변화를 평가 하기 위한 유용한 방법 임을 증명 하고있다. 그것의 사용 의료 또는 수술 절차를 포함 하 여 추가 실험의 가능성을 제기 하 고 동물을 희생 하지 않고 내부 장기의 sonographic 변경 내용을 모니터링 하는 기능을 제공 합니다.

서론

쥐 동물 모델 생식 의학, 태아 난소 이식^1,2등에서 널리 사용 되었습니다. 그러나, 과거에는, 설치류에 생식 개발의 연구 삭제 조직의 일회성 조직학 검사에 기반 하고있다 그리고 일상적인 생식 기관 변경의 종 적 연구 쥐³가능한 되지 않았습니다. 초음파 널리 이용 되는 인간의 보조 생식 기술에 30 년 동안, 하지만이 귀중 한 기술만 적용 된 쥐에 최근.

우리의 목표는 복제 및 산부인과 조사에 대 한 실험 모델을 디자인 하 고 있기 때문에 절차를 설명 Sprague-Dawley 쥐의 생식 기관 평가 위한 ultrasonographic 접근을 설정 했다 우리의 지식, 이 절차에 대 한 없음 현재 시각된 간행물을 확인 하 고 있습니다. 우리는 해부학과 고해상도 초음파를 사용 하 여 자 궁 동맥 혈액 흐름에 여성 쥐의 생식 시스템 및 현재 ultrasonographic 결과의 ultrasonographic 검사의 절차를 설명 합니다. 우리는 자궁내 막 두께, 난소의 형태와 자 궁 혈액 흐름에 중요 한 차이 평가 하기 위해 발 정기 주기의 여러 단계에서 endometrium, 난소 및 자 궁 동맥 혈 비 임신 동물에서의 특성을 모니터링 발 정기 주기, 여성에 게 유사한의 서로 다른 단계. 우리 70 MHz 주파수와 30 µ m. 의 해상도 수준 높은-품질 초음파 장비를 사용 우리의 다른 목표 임신 쥐의 자 궁 혈의 저항에 변화를 평가 했다. 이 기술은 동물을 희생 하지 않고 매일 변화 생식 기관에서의 연구에 대 한 수 있습니다.

쥐에 초음파를 이용 하 여에 몇 가지 기술적인 문제가 있다. 이러한 어려움을 포함: 쥐 endometrium 인간의 여성⁴보다 훨씬 얇은입니다. 쥐의 난소를 이미징에 어려움 두꺼운 피부와 가까운 완전 한 감쇄 초음파⁵의 결과, 쥐에 복 벽 근육에 기인 했다 및 자 궁 동맥은 훨씬 더 어려운 비 임신에서 찾을 수 쥐입니다. 절차, 많은 기술적인 문제를 해결 하는 우리 하 고 남아 있는 그 문제에 대 한 우리가 그들을 최소화 하는 방법을 보여줍니다.

Sonographic 변화 동물을 희생 하지 않고도 쥐의 생식 기관에서의 성공적인 모니터링 생식 의학의 미래 동물 모델 및 다른 수술 절차의 가능성을 열 것 이다.

프로토콜

이 연구는 권장 사항 가이드 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 건강의 국가 학회 그리고에 도착에 따라에서 실시 됐다 (동물 연구: Vivo 실험에서 보고) 지침. 프로토콜 준수 지침 2010/63/EU 승인 번호 A13170404 (네오 1) 동물 실험에 대 한 라이센스를 받았다. 모든 실험 (RD 53/2013, EU 지침 63/2010) 동물의 윤리 치료에 대 한 국가 지침에 따라 유럽 연합 인증 실험실에서 수행 했다. 프로토콜은 무르시아의 대학의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 동물 준비

참고: 모든 실험 동물 실험 부 무르시아 대학교 및 산부인과 산부인과 부서 무르시아의 대학에 의해 지원 되었다.

1. 8 주 오래 된, Sprague-Dawley 쥐 (28 여성 쥐) 모든 실험에 200-250 g를 무게를 사용 합니다.
   참고: 여기, 우리 또한 사용 5 임신 쥐.
2. 임신 쥐를, 8 주 오래 된 여성 및 비옥한 남성 쥐 케이지 및 17:00에서 친구-23: 00 h. 다음 아침에 질 플러그의 식별 짝짓기 성공. 로 해석 되었다 임신 후 성관계를 했다 그들은 다음 날의 1 일을 고려 하십시오.
3. 임신의 9, 15, 18 일에는 실험을 실시 합니다.
4. 집 쥐와 두 그룹에서 음식과 물에 대 한 액세스 및 일반 12 h 명암 주기를 유지 관리 합니다.
5. 2 주간의 최소 시설 조건에 acclimating 후 매일 아침 질 세포학을 사용 하 여 발 정기 주파수 및 규칙에 대 한 평가.
   참고: 정기적으로 4 ~ 5 일 발 정기 단계 28 쥐 연구에 포함 선정 됐다.

2입니다. 영상에 대 한 쥐의 준비

참고: 이미지 고해상도 transabdominal 초음파를 사용 하 여 얻은 했다. Estrous 주기 단계 질 얼룩 세포학에 의해 결정 되었다.

1. 이미징 연구에 앞서 2-3 %isoflurane 가스 유도 실에서 댐 anesthetize.
2. 동물을 제거 즉시 마 취 시스템에 연결 된 코 콘 내 주 둥이 배치 하 고 ultrasonographic 시험 기간 동안 1.5-2 %isoflurane 동물 유지.
3. 클리퍼 스와 depilatory 크림 꼬리 복 부 늑 골 여백에서 모피를 제거 합니다.
4. 마 취 쥐 쥐를 보안 및 이미징 세션의 기간에 대 한 최적의 편안 함과 생리 적인 매개 변수의 유지 보수를 보장 하는 온수 테이블에 부정사 위치에 놓습니다. 모든 생리 적 매개 변수는 이미지와 함께 통합 한다 및 데이터 캡처에 초음파 응용 프로그램을 통해 실시간.
5. 부드럽게 (37.5 ° C ± 0.5 ° C) 온도 모니터링 (윤 활) 후 직장 프로브를 삽입 합니다.
6. 트랜스듀서 (30 Hz) 고정 홀더 놓고 수직 축과 수평 축 (앞으로-투-다시 및 사이드-투-사이드)를 따라 이동 수동으로 운영된 조이스틱을 사용 하 여 또는 손으로.
7. 절차 동안에 건조 하지 않도록 하는 쥐의 눈에 석유 기반 안과 연 고를 적용 합니다.

3. 시험 절차

참고: rats´ 생식 기관의 해부학: 질 방광 등 거짓말과 신장 쪽으로 확장 하는 두 개의 자 궁 뿔을 나눕니다. 난소는 자 궁 뿔 oviducts (그림 1)를 통해에 연결 됩니다. 자 궁 후부 신장 지역에 위치 해 있습니다.

1. 자 궁의 식별
   1. 를 사용 하 여 방광 랜드마크로 자 궁 경부를 찾을 왼쪽 및 오른쪽 자 궁 뿔의 분기를 찾을 수 자 궁 경부를 따릅니다.
   2. "B-모드"를 선택 하 여 2 차원 보기/비디오 전환 합니다. 화살 중간 이미지에 중반에 isthmic 지역에 각 자 궁 경적의 antero 후부 직경을 측정 합니다. Ultrasonographic 시스템 소프트웨어를 사용 하 여 측정을 감지 합니다.
   3. "B-모드"에서 화살 중간 이미지에 자궁내 강에 걸쳐 echogenic 국경에 echogenic 국경에서 자궁내 막 두께 측정 합니다.
   4. "컬러 도플러" 선택 하 여 컬러 도플러 모드를 변경 합니다. 색 도플러를 사용 하 여 식별 하는 endometrium의 혈액 공급 고 endometrium의 혈액의 흐름을 측정. 컬러 도플러 모드에서 다음 매개 변수를 선택: 4 Hz, 펄스 반복 주파수 세트 4 48 kHz, 그리고 펄스 도플러 게이트 사이 0.2 0.5 m m 사이 하이 패스 필터 설정.
2. 자 궁 동맥 혈의 식별
   1. 각 측에 장 골 동맥에 가까운 utero 경부 접합의 측면-열 등 여백 근처 자 궁 동맥에서 파형 도플러를 얻을.
   2. 다음 매개 변수를 사용 하 여 도플러 모드에서: 6 Hz, 펄스 반복 주파수 세트 4 48 kHz, 그리고 펄스 도플러 게이트 0.2 0.5 m m 사이 사이 하이 패스 필터 설정.
   3. 혈액 흐름 및 도플러 각도 최소화 하기 위해 도플러 빔 정렬 하는 것을 주의. 도플러 빔과 배 사이의 각도 기록 합니다. 값 60 °의 각도 넘어 촬영 정확 하지 않으며 피할된⁶이어야 한다.
   4. 최대 수축 속도 (PSV)와 3 연속 사이클에서 끝 확장기 속도 (EDV)를 측정 합니다. 심장 수축 심장 확장 (S/D) 비율 (PSV/EDV) 및 저항 인덱스 (RI) 계산 ([PSV-EDV] / PSV) 각 자 궁 경적에 대 한 값.
   5. 9^일, 15^일, 임신의 18^일 하루 동안 5 임신 쥐의 자 궁 동맥 혈 류를 측정 합니다.
3. 난소와 난소 동맥 혈액 흐름의 식별
   참고: 여성 쥐 난소 있습니다 (그림 1) 자 궁 경적의 끝에 발견 하는 지방 패드에서 생활 하 고 동물의 양쪽에 신장에 측면.
   1. 난소, 이미지를 가로 평면에서 프로브와 함께 시작 하 고 갈비뼈 아래 약간 동물의 측면 측면에 배치 합니다. 신장 및 지방 패드 난소에 비해 hyperechoic 외관이 있다.
   2. 난소 낭의 외부 경계를 측정 합니다. 각 이미지에 규모에 번호 0.1 m m 단위로 밀리미터에 있습니다.
      참고: 컬러 도플러 모드와 파워 도플러 모드 영상 난소 강도와 방향 흐름의 식별 도움이 됩니다.

4입니다. 연구의 설계

1. 질 얼룩 세포학에 의해 발 정기 주기를 확인 하십시오.
2. 두 그룹에 있는 모든 쥐를 나눕니다. 그룹 1 또는 미리 비옥한 (또는 periovulatory), 주기 단계 proestrus와 발 정기에 있던 쥐를 포함 합니다. 그룹 2 또는 포스트 비옥한, 주기 단계 초기 diestrus 및 늦은 diestrus에 있던 쥐를 포함 합니다.
3. 모니터링 하 고 중반에 isthmic 지역 그룹 1에서 각 자 궁 경적 및 2의 antero 후부 직경을 비교.
4. 모니터링 및 자궁내 막 두께 그룹 1과 2에서 endometrium의 특성을 비교 합니다.
5. 모니터링 및 크기 (최대 지름)와 난소의 특성을 비교 하 고 두 난소 그룹 1에서와 2에서 어떤 periovulatory 낭 지역화.
6. 모니터링 및 그룹 1과 2에서 자 궁 동맥 혈을 비교 합니다.
7. 모니터링 및 임신의 다른 단계에서 임신 쥐의 자 궁 동맥 혈을 비교 (9, 15 및 임신의 18 일).
8. 수행 통계 분석 SPSS를 사용 하 여. Interquartile 범위와 평균 ± 표준 편차 (SD) 또는 중간 데이터를 제시. 다른 그룹 사이의 스튜던트 t-검정을 사용 하 여 결과 분석 합니다. P-값이 0.05 보다 통계적으로 유의 한 차이 고려 되었다.

결과

아니 큰 차이가 antero 후부 자 궁 경적 직경 또는 두께 endometrium의 자 궁 경적 (표 1)의 두 측면을 확인 하 고 있었다. 그룹 2와 비교, 그룹 1에에서 평균 자궁내 막 두께 두꺼운, 하지만 더 중요 한 차이 (P > 0.05) (그림 3)의 두 그룹 사이 발견 했다. 그럼에도 불구 하 고, 우리 관련 endometrium 형태 (그림 2)에서 변경 된 발 정기 주기 근처 (8 중 28 쥐)에서 자 궁 안에 액체 발견.

도플러 연구 또한 보였다 아니 중요 한 변화 흐름에 속도 파형 패턴 또는 비 임신 쥐 (표 1 과 2, 그림 4A)에서 발 정기 주기의 다른 단계에서 자 궁 경적의 각 측에. 그러나, 임신 쥐에...

토론

프로시저 수정 및 쥐, 초음파를 사용 하 여 주기는 발 정기의 단계 모든 식별의 우리의 목표에도 불구 하 고 본이 연구에서는 데 필요한 문제 해결 우리는 어떤 중요 한 차이점을 찾을 수 없었습니다. 우리 가설 이러한 어려움 때문에 발 정기 주기 여성에서 주기 달리 쥐 몇 일 지속 될 수 있습니다. 우리는 어떤 차이 확인 하기 위해 정확 하 게 적절 한 시기에 모든 측정 한 했다입니다. 따라서, 우리가 어떤 차이 대 한 평가를 두 단계로 발 정기 주기 단계 재편성 하지만 아무도 관찰 했다. 예상 대로, 우리는 측정을 수행 미래에 어느 경적을 선택할 수 있도록 각 자 궁 경적의 측정 사이의 큰 차이 발견. 설치류에서 isoflurane 사용의 효과 대 한 연구는 모순. 않았음, 하지만 몇 시간 또는 몇 일에 대 한 마 취 농도에서 관리 하는 경우에 수 있습니다. 우리가 어떤 임신 쥐 또는 그들의 자손에 어떤 부작용을 찾지 못 했 그래서 우리의 실험 임신 쥐에 시험 시간 30 분 미만 했다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Vevo3100 고해상도 생체 내 마이크로 이미징 시스템*	Visual Sonics, inc.
www.visualsonics.com/products 생리학적 모니터링 장치를 포함한 Vevo 통합 철도 시스템.	비주얼 소닉, Inc.		www.visualsonics.com/products
MX400 트랜스덕터	비주얼 소닉스, inc.		www.visualsonics.com/products
Vevo Lab Software	Visual Sonics, inc.
www.visualsonics.com/products HSD: Sprague Dawley SD	Envigo, inc.		쥐 균주
윤활 젤	일반 공급
CIBERTEC CA-EAC20 마취 트롤리 시스템	Cibertec S.A		마취 기계
Ecogel 100 초음파 젤	Eco-Med Pharmaceuticals Inc.
제모 로션(나이르)	일반 공급
Isoflurane	Esteve Veterinaria		흡입 마취
* 필요한 소프트웨어는 B-Mode 애플리케이션, 맥파 도플러 애플리케이션 및 혈관 변형 분석 도구 패키지를 포함한 Vevo 소프트웨어입니다.