Method Article

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

DOI:

10.3791/56041

⸱

July 27th, 2017

 ,  , 
1Department of Cell and Tissue Biology, Program in Craniofacial Biology and Institute for Human Genetics, University of California San Francisco, 2Laboratory of Transgenic Models Diseases, Czech Centre for Phenogenomics, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 우리는 공 촛점 현미경을 사용하여 마우스 보조 입천장 융합의 라이브 영상을위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 다양한 형광 기자 마우스 라인과 기계적 통찰력을위한 경로 억제제와 함께 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 발달 시스템의 라이브 이미징에 적용 할 수 있습니다.

Abstract

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2 차 구개 선반이 융합되어 2 차 구개를 형성하는 것은 포유 동물의 발달 과정에서 중요한 과정이며, 그 파열로 인해 인간의 공통 선천성 기형 인 2 차 구개가 생길 수 있습니다. 이차 미각 융합은 광범위하게 연구되어이 과정을 중재 할 수있는 몇 가지 제안 된 세포 메커니즘을 유도한다. 그러나, 이러한 연구는 개발 도중 또는 고정 된 시점에서 분석 된 고정 된 체외 이식편 배양에서 진보적 인 시점에서 고정 배아 조직에서 주로 수행되었다. 정적 분석은 미각 융합과 같은 동적 인 형태 발생 과정의 분석과 어떤 유형의 동적 세포 행동이 구개 융합을 중재 하는지를 불완전하게 이해하는 데에는 한계가있다. 여기 우리는 마우스 배아에서 생체 내 2 차 구개 융합의 라이브 이미징 프로토콜을 설명합니다. 구개 융합의 세포 행동을 조사하기 위해 상피 특이 적 Keratin14 -cre를 사용하여 ROS의 구개 상피 세포를 표지 하였다A26-mTmG flox 기자 배아. 섬유질 악틴을 시각화하기 위해 Lifeact-mRFPruby 리포터 마우스를 사용했습니다. 이차 구개 융합의 라이브 영상은 배아 일 (E) 14.5 단계 배아의 최근 부착 2 차 구개 선반을 해부하고 거꾸로 공 촛점 현미경으로 이미징을 활성화하기 위해 유리 바닥 접시에 아가로 오스 함유 미디어에서 배양하여 수행되었습니다. 이 방법을 사용하여 우리는 2 차 구개 융합 동안 다양한 새로운 세포 행동을 발견했습니다. 공간과 시간에 어떻게 구별되는 세포 행동이 조정되는지에 대한 감사는 이러한 동적 형태 형성 과정에 대한 우리의 이해에 크게 기여한다. 이 프로토콜은 돌연변이 마우스 라인, 또는 두 번째 구개 융합이 제어되는 방법에 대한 이해를 진전시키기 위해 약리학 적 억제제로 치료 한 배양 물에 적용 할 수 있습니다.

Introduction

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조직 융합은 여러 장기의 발달에 중요한 단계입니다. 갈라진 입술과 입천장, 척추이 분증과 심장 기형과 같은 주요 인간의 선천적 결손은 조직 융합의 결함으로 생길 수 있습니다 1 . 마우스 2 차 구개 융합은 개발 2 , 3 , 4 에서 조직 융합을 조절하는 세포 및 분자 메커니즘을 확인하기 위해 광범위하게 연구되었습니다. 마우스에서 2 차 구개 발달은 E11.5에서 시작하여 양측 상악골의 각 단계에서 2 차 구개 선반이 형성됩니다. 구개 선반의 초기 성장은 대략 E14.0까지 혀를 따라 수직적으로 발생하며, 이때 구개 선반은 혀 위에서 수평으로 상승합니다. medially-directed growth는 정중선 epitheli를 형성하면서, 두 개의 구개 선반의 apposing epithelia 사이의 물리적 접촉을 가져온다E14.5에서 MES (al seam). 중간 엽 합병과 E15.5에 의한 완전히 융합 된 2 차 구개의 발생을 허용하기 위해 중간 구개 선반 사이에서 중간 MES를 제거해야합니다 3 .

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Protocol

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모든 동물 실험은 San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee의 University of California의 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 라이브 영상 미디어 준비

  1. 액체 배양 배지의 제조
    1. 20 % FBS (fetal bovine serum), 2 mM L- 글루타민, 100 U / mL 페니실린, 100 μg / mL 스트렙토 마이신, 200 μg / mL L- 아스 코르 빈산, 15 mM HEPES를 더베 페코 수정 이글 배지 (DMEM) / F12 미디어.
      참고 : 라이브 이미징 미디어는 이미지 작성 직전에 새로 제작되었습니다. 이 매체에는 페놀 레드가 포함되어있어 오랜 시간 동안 라이브 이미지를 촬영할 때 광독성을 유발할 수 있습니다. 페놀 레드가없는 용지를 대체하면 장기 이미징을 향상시킬 수 있습니다.
  2. 저 융점 아가 로스 용액의 제조
    1. 저 융점 아가 로스 350 mg을 오토 클레이 빙 된 증류수 10 mL에 녹여 3.5 % 저장 용액으로 만든다.
    2. 아가로 오스 용액을 잘 섞고 70 ° C에서 ....

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Results

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구개 제거 (explant) 배양의 라이브 영상으로 미각 융합을 매개하는 여러 세포 과정이 밝혀졌습니다 6 . 두 개의 상피 세포 사이의 초기 접촉은 막 돌출부에 의해 이루어진다 ( 그림 2 B-2E ). 두 개의 상피 세포가 만났을 때 상피 수렴을 통해 통합 된 단일 세포층 MES를 만들기 위해 인터 셀 레이션 (intercalation)을 거친 다중 세포층 MES를 형성한다 ( 그림 2A-2E 및 그림 2K-2O ). 더 깊은 Z 수준의 상피 세포는 점진적으로 상피 수렴 과정에 기여하는 MES의 구강 측으로 옮겨진다 ( 그림 2

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Discussion

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3D 장기 explant 문화와 조직 morphogenesis의 라이브 이미징 고정 조직 섹션의 기존 얼룩 분석에 표시 할 수없는 세포 프로세스에 관한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다. 생쥐의 배아 이차 배뇨의 생체 외편 배양 배지를 사용하여 우리는 상피 융합과 세포 압출을 포함하는 구개 융합의 새로운 메커니즘을 제안하기 위해 몇 가지 흥미로운 세포 행동을 관찰했다.

이러한 유형의 연구에서 공통적으로 직면하는 문제 중 하나는 오랜 시간 동안 지속적으로 레이저를 여기시켜 광 표백을하는 것입니다. 우리의 연구에서 백색광 공 촛점 및 회전 디스크 공 촛점 현미경이 사용되었습니다. 시간 경과에 따른 신호 강도의 감소는 이미징 소프트웨어 (LAS-AF)에서 표백 보정을 통해 교정 할 수 있습니다 (프로토콜 4.1). 표백 보정은 제한적이므로 각 이미징 시스템에서 레이저 출력과 노출 시간을 신중하게 최적화하는 것이 중요합니다. 우리는 또한 확인했다.그 구개 융합 3 .......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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2 차 구개 영상에 관한 초기 대화에 M. Douglas Benson에게 감사드립니다. 공 촛점 현미경 검사에서 이미징 조건을 조정하는 데 도움을 준 David Castaneda-Castellanos (Leica)와 Chris Rieken (Zeiss)도 인정합니다. 우리는 Lynsey Hamilton (Bitplane)에게 Imaris 소프트웨어를 사용하여 정량적 이미지 분석을위한 유용한 제안을 해주었습니다. 이 작품은 NIH / NIDCR R01 DE025887에 의해 재정 지원을 받았다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
DMEM/F12Life technology11330-032
Fetal bovine serumLife technology16000-044
L-glutamineLife technology25030-081
L-Ascorbicacid SigmaA4544-100G
페니실린/스트렙토마이신Life technology15140-122
저융점 아가로스BioExpressE-3111-125
35mm 유리 바닥 접시MatTekP35G-1.5-10-C
Petrolieum 젤리(바셀린)Sigma16415-1Kg
Mice
Keratin14-creMGI: J:65294대립유전자 = Tg(KRT14-cre)1Amc
ROSA26mTmGMGI: J:124702대립유전자 = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo
Lifeact-mRFPrubyMGI: J:164274대립유전자 = Tg(CAG-mRuby)#Rows
Microscope
White Light SP5 컨포칼 현미경Leica Microsystems
Cell Observer 회전 디스크 컨포칼 현미경Zeiss 현미경

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
  2. Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birt....

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Secondary Palate FusionLive ImagingConfocal MicroscopyMouse EmbryosKeratin14 CreROSA26 mTmGLifeact mRFPrubyAgarose CultureEpithelial Cell TrackingFilamentous Actin

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