여기, 우리는 공 촛점 현미경을 사용하여 마우스 보조 입천장 융합의 라이브 영상을위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 다양한 형광 기자 마우스 라인과 기계적 통찰력을위한 경로 억제제와 함께 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 발달 시스템의 라이브 이미징에 적용 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
2 차 구개 선반이 융합되어 2 차 구개를 형성하는 것은 포유 동물의 발달 과정에서 중요한 과정이며, 그 파열로 인해 인간의 공통 선천성 기형 인 2 차 구개가 생길 수 있습니다. 이차 미각 융합은 광범위하게 연구되어이 과정을 중재 할 수있는 몇 가지 제안 된 세포 메커니즘을 유도한다. 그러나, 이러한 연구는 개발 도중 또는 고정 된 시점에서 분석 된 고정 된 체외 이식편 배양에서 진보적 인 시점에서 고정 배아 조직에서 주로 수행되었다. 정적 분석은 미각 융합과 같은 동적 인 형태 발생 과정의 분석과 어떤 유형의 동적 세포 행동이 구개 융합을 중재 하는지를 불완전하게 이해하는 데에는 한계가있다. 여기 우리는 마우스 배아에서 생체 내 2 차 구개 융합의 라이브 이미징 프로토콜을 설명합니다. 구개 융합의 세포 행동을 조사하기 위해 상피 특이 적 Keratin14 -cre를 사용하여 ROS의 구개 상피 세포를 표지 하였다A26-mTmG flox 기자 배아. 섬유질 악틴을 시각화하기 위해 Lifeact-mRFPruby 리포터 마우스를 사용했습니다. 이차 구개 융합의 라이브 영상은 배아 일 (E) 14.5 단계 배아의 최근 부착 2 차 구개 선반을 해부하고 거꾸로 공 촛점 현미경으로 이미징을 활성화하기 위해 유리 바닥 접시에 아가로 오스 함유 미디어에서 배양하여 수행되었습니다. 이 방법을 사용하여 우리는 2 차 구개 융합 동안 다양한 새로운 세포 행동을 발견했습니다. 공간과 시간에 어떻게 구별되는 세포 행동이 조정되는지에 대한 감사는 이러한 동적 형태 형성 과정에 대한 우리의 이해에 크게 기여한다. 이 프로토콜은 돌연변이 마우스 라인, 또는 두 번째 구개 융합이 제어되는 방법에 대한 이해를 진전시키기 위해 약리학 적 억제제로 치료 한 배양 물에 적용 할 수 있습니다.
서론
조직 융합은 여러 장기의 발달에 중요한 단계입니다. 갈라진 입술과 입천장, 척추이 분증과 심장 기형과 같은 주요 인간의 선천적 결손은 조직 융합의 결함으로 생길 수 있습니다 1 . 마우스 2 차 구개 융합은 개발 2 , 3 , 4 에서 조직 융합을 조절하는 세포 및 분자 메커니즘을 확인하기 위해 광범위하게 연구되었습니다. 마우스에서 2 차 구개 발달은 E11.5에서 시작하여 양측 상악골의 각 단계에서 2 차 구개 선반이 형성됩니다. 구개 선반의 초기 성장은 대략 E14.0까지 혀를 따라 수직적으로 발생하며, 이때 구개 선반은 혀 위에서 수평으로 상승합니다. medially-directed growth는 정중선 epitheli를 형성하면서, 두 개의 구개 선반의 apposing epithelia 사이의 물리적 접촉을 가져온다E14.5에서 MES (al seam). 중간 엽 합병과 E15.5에 의한 완전히 융합 된 2 차 구개의 발생을 허용하기 위해 중간 구개 선반 사이에서 중간 MES를 제거해야합니다 3 .
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프로토콜
모든 동물 실험은 San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee의 University of California의 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 라이브 영상 미디어 준비
- 액체 배양 배지의 제조
- 20 % FBS (fetal bovine serum), 2 mM L- 글루타민, 100 U / mL 페니실린, 100 μg / mL 스트렙토 마이신, 200 μg / mL L- 아스 코르 빈산, 15 mM HEPES를 더베 페코 수정 이글 배지 (DMEM) / F12 미디어.
참고 : 라이브 이미징 미디어는 이미지 작성 직전에 새로 제작되었습니다. 이 매체에는 페놀 레드가 포함되어있어 오랜 시간 동안 라이브 이미지를 촬영할 때 광독성을 유발할 수 있습니다. 페놀 레드가없는 용지를 대체하면 장기 이미징을 향상시킬 수 있습니다.
- 20 % FBS (fetal bovine serum), 2 mM L- 글루타민, 100 U / mL 페니실린, 100 μg / mL 스트렙토 마이신, 200 μg / mL L- 아스 코르 빈산, 15 mM HEPES를 더베 페코 수정 이글 배지 (DMEM) / F12 미디어.
- 저 융점 아가 로스 용액의 제조
- 저 융점 아가 로스 350 mg을 오토 클레이 빙 된 증류수 10 mL에 녹여 3.5 % 저장 용액으로 만든다.
- 아가로 오스 용액을 잘 섞고 70 ° C에서 ....
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결과
구개 제거 (explant) 배양의 라이브 영상으로 미각 융합을 매개하는 여러 세포 과정이 밝혀졌습니다 6 . 두 개의 상피 세포 사이의 초기 접촉은 막 돌출부에 의해 이루어진다 ( 그림 2 B-2E ). 두 개의 상피 세포가 만났을 때 상피 수렴을 통해 통합 된 단일 세포층 MES를 만들기 위해 인터 셀 레이션 (intercalation)을 거친 다중 세포층 MES를 형성한다 ( 그림 2A-2E 및 그림 2K-2O ). 더 깊은 Z 수준의 상피 세포는 점진적으로 상피 수렴 과정에 기여하는 MES의 구강 측으로 옮겨진다 ( 그림 2
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토론
3D 장기 explant 문화와 조직 morphogenesis의 라이브 이미징 고정 조직 섹션의 기존 얼룩 분석에 표시 할 수없는 세포 프로세스에 관한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다. 생쥐의 배아 이차 배뇨의 생체 외편 배양 배지를 사용하여 우리는 상피 융합과 세포 압출을 포함하는 구개 융합의 새로운 메커니즘을 제안하기 위해 몇 가지 흥미로운 세포 행동을 관찰했다.
이러한 유형의 연구에서 공통적으로 직면하는 문제 중 하나는 오랜 시간 동안 지속적으로 레이저를 여기시켜 광 표백을하는 것입니다. 우리의 연구에서 백색광 공 촛점 및 회전 디스크 공 촛점 현미경이 사용되었습니다. 시간 경과에 따른 신호 강도의 감소는 이미징 소프트웨어 (LAS-AF)에서 표백 보정을 통해 교정 할 수 있습니다 (프로토콜 4.1). 표백 보정은 제한적이므로 각 이미징 시스템에서 레이저 출력과 노출 시간을 신중하게 최적화하는 것이 중요합니다. 우리는 또한 확인했다.그 구개 융합 3 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
2 차 구개 영상에 관한 초기 대화에 M. Douglas Benson에게 감사드립니다. 공 촛점 현미경 검사에서 이미징 조건을 조정하는 데 도움을 준 David Castaneda-Castellanos (Leica)와 Chris Rieken (Zeiss)도 인정합니다. 우리는 Lynsey Hamilton (Bitplane)에게 Imaris 소프트웨어를 사용하여 정량적 이미지 분석을위한 유용한 제안을 해주었습니다. 이 작품은 NIH / NIDCR R01 DE025887에 의해 재정 지원을 받았다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal bovine serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic | acid Sigma | A4544-100G | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Life technology | 15140-122 | |
| 저융점 아가로스 | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35mm 유리 바닥 접시 | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum 젤리(바셀린) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | 대립유전자 = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | 대립유전자 = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | 대립유전자 = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 컨포칼 현미경 | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer 회전 디스크 컨포칼 현미경 | Zeiss 현미경 |
참고문헌
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birt....
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