방법 논문

Semiflexible 고분자 공부를 다양 한 도구로 DNA 나노튜브

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DOI:

10.3791/56056

⸱

2017년 10월 25일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I, Universität Leipzig

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

Semiflexible 폴리머 생명체가 광범위 하 게 적용 되는 독특한 기계적 속성을 표시 합니다. 그러나, biopolymers에 대 한 체계적인 연구는 폴리머 강성 같은 속성은 액세스할 수 없습니다 이후 제한 됩니다. 이 원고는이 제한 프로그래밍 가능한 DNA 나노튜브, 강성 필 라 멘 트의 영향에 대 한 실험 연구를 활성화 하 여 우회는 어떻게 설명 합니다.

초록

셀 또는 biopolymer 네트워크 같은 복잡 한, 폴리머 기반 부드러운 물질의 기계적 성질도 클래식 프레임 유연한 폴리머도 엄밀한 막대의 이해할 수 있습니다. 기본 필 지 속성 길이 (lp)를 통해 계량 되는 그들의 비 사라지는 백본 강성으로 뻗은 남아 있지만 그들은 또한 강한 열 변동 될 수 있습니다. 그들의 한정 된 굽 힘 강성 대량 네트워크, 큰 메시 크기를 제공 하면서 낮은 볼륨 분수에서 안정적인 장비의 형성을 활성화의 독특한, 특수 집단 역학 이끌어 낸다. 이 기본 원리는 (예를 들어, 셀 또는 조직), 자연에 널리 높은 분자 콘텐츠 및 따라서 퍼지는 촉진 또는 능동 이동 최소화. 그들의 생물 학적 영향 및 생체 hydrogels 잠재적인 기술 응용 프로그램, semiflexible 폴리머 상당한 연구 대상이 되었습니다. 그러나 그들은 자유롭게 조정 되지 않은 걸 필 라 멘 트 같은 천연 고분자에 의존 하는 때문에,, 이해할 수 있는 조사 도전 남아 있었다. 이러한 제한에도 불구 하 고 합성, 기계적으로 가변 및 semiflexible 폴리머의 부족, 말라 필 라 멘 트 일반적인 모델 시스템으로 설립 되었다. 주요 제한은 중앙 수량 lp 자유롭게 거시적인 대량 구조에 미치는 영향을 연구 조정 될 수 없습니다입니다. 이 한계는 강성 필 라 멘 트의 제어 변경 수 있도록 구조적 프로그래밍 가능한 DNA 나노튜브를 채용 하 여 해결 되었습니다. 그들은 부분적으로 보완 가닥의 개별 세트 개별 둘레와 반지 구조에서 교배 타일 기반 디자인을 통해 형성 된다. 이 고리 사용 필 라 멘 트에 효과적인 중 합 길이, 여러 미크론 끈끈한 끝 있으며 자연 biopolymers로 비슷한 중 합 속도 론을 표시 합니다. 그들의 프로그래밍 가능한 역학 때문이 튜브는 단일 분자 대량 규모에 lp 의 영향을 공부 다재 다능 한, 소설 도구입니다. 말라 필 라 멘 트, 달리 그들은 주 동안에, 주목할 만한 변성 없이 안정적으로 유지 하 고 그들의 처리는 comparably 간단.

서론

그들의 독특한 기계적 성질으로 사용 복잡 한 동작으로 인해 semiflexible 폴리머는 생활 문제의 근본적인 빌딩 블록. 유연한 고분자, 달리 semiflexible 폴리머 여전히 강한 열 변동1에 따라 하면서 자신의 비 사라지는 백본 강성 때문 뻗은 구성 채택. 따라서, 순전히 확률적 모델은 완벽 하 게 유연 하거나 딱딱한 폴리머의 극치와 마찬가지로 그들의 행동에 적용할 수 없습니다. 소위 벌레 같은 체인 모델2,,34 p l통해이 강성 필 라 멘 트4따라 접선 탄젠트 상관 관계의 붕괴 상수는 척도를 개발 되었다. Lp 는 윤곽선 길이 (lc)는 필 라 멘 트의 비교, 폴리머 semiflexible1를 간주 됩니다. 텐트의 기둥에 유사한, 그들의 준비 네트워크 또는 번들 안정화 낮은 볼륨 분수, 특이 한 점 탄성 속성5,6,7, 선도에서 전체 집단 시스템 8,9. 이러한 구조는 높은 신축성 대형 메쉬 크기10, 아직도 퍼지는 촉진 및 활성 전송 프로세스 동안 기계적 무결성을 유지 제공 합니다. 이 속성은 특히 골격 또는 기질, 생물 학적 시스템에 적합 하지만 그것은 식품 공학1,,1112에서 또한 널리 이용 된다.

생활 문제에 그들의 의미를 넘어가 고, 포괄적으로 생체 모방 재료 또는 소설 hydrogels 개발 도구 순서 이러한 구조체의 물성을 검토 하 결정적 이다. Semiflexible 폴리머의 관점에서이 단일 필 라 멘 트 속성 lp 설명 이론적 프레임 워크의 개발 등에서 발생 하는 네트워크의 집단 속성의 체계적인 결정을 의미 합니다. 선구적인 연구에서 세포 biopolymer 말라 semiflexible 고분자를 위한 모델 시스템으로 설립 되었다와 금5,13,,1415 에 아직도 널리 것으로 간주 됩니다. , 16 , 그러나 17., 철저 한 연구는이 시스템 제한 때문에 그들은이 단백질의 고유한 속성에 바인딩됩니다. 다양 한 이론적 접근 건물 단일 필 라 멘 트 수준에서 특수 기계 동작의 설명 목적으로 그리고 특히 다른 배율 예측에 의존에 대 한 선형 탄성 고원 전단 탄성 계수, G의 지도 0 (즉, 네트워크의 "신축성"), 농도 (c) 및 lp6,7,,1314, 15,18,19,20,21,,2223. 농도 스케일링은 걸 기반으로 실험 또는 다른 모델 시스템에 쉽게 액세스할 수 있으며 이론적인 예측을 엄격 하 게 되었습니다 확인13,,1624, 25, 실험적으로 접근 하기 어려운 남아 있다 lp 에 관하여 스케일링. 그러나 Lp 은 semiflexible 고분자의 정의 수량은 독립 변수 이기도 때문이,, 주요 한계입니다.

이 중앙, 자연 제한 걸의 고정된 lp 또는 콜라겐 같은 다른 생물학으로 파생 된 중합체에 의해 부과 된 최근 타일 기반 DNA 튜브, 그들의 기계적 성질에 가변을 사용 하 여 해결 되었습니다. 9 , 26 , 27 , 28. (단위 링 내 가닥 구성 DNA의예를 들어, 서로 다른 숫자) 튜브의 아키텍처에 약간의 변화가 항복 lp, 형광 현미경 검사 법을 통해 평가 될 수 있는 고유 값 한 변동 튜브를 분석 하거나 여러 준수 튜브의 곡선된 구성을 평가 하 여,와 같이 설명한 이전9,28. 이러한 분석을 다른 튜브 인구의 lp 값 이상의 크기 순서에 따라 달라 지는 다른 평가 기술을 일관 된 결과9,28항복 공개 했다.

놀랍게도, 농도 및 lp 선형 탄성 고원 전단 계수 G0 의 전반적인 비율 보고 되었습니다 모든 이전 이론적 접근와 일치 하도록 9, 특히 훨씬 시연 시 lp예측된 의존 보다 강한. 이러한 연구 결과 semiflexible 폴리머의 중앙 속성을 공부 하는 새로운 모델 시스템의 가치를 강조 한다. N채용-헬릭스 DNA 튜브 극적으로 이러한 조사의 범위를 높 혔 습니다. 수 lp 기본 재료를 변경 하지 않고 자유롭게 변화 될 뿐만 아니라 DNA의 고유한 프로그래밍 가능한 특성 추가 요소, crosslinks 등 운동 스위칭 프로세스의 체계적인 검사를 사용할 수 있습니다. 또한, 이러한 튜브 물에 용 해 되며, 대부분의 단백질 달리 적절 한 pH와 이온 조건 감지 저하9없이 몇 주 동안 안정.

이러한 튜브 조립 DNA oligonucleotides의 개별 집합은 사용 되, 각각 포함 된 2 개의 이웃 물가를 보완 기본 시퀀스를 공유 하는 두 개의 도메인 (특정 시퀀스 때문에 한 가닥 형성할 수 없습니다 머리 핀 같은 구조). 상호 보완적인 시퀀스 교배 n 상호 더블 헬리컬 세그먼트의 동봉, 반 겹치는 반지를 형성, 순환 방식에서 (그림 1A 및 B). 개별 직경 (그림 1C), 및 그들의 반 중복 구성에서이 고리 형태로 축 끈끈한 끝 다른 링의 끈끈한 끝에 무료 제공합니다. 이 선택적 추가 oligonucleotides 일치의 크기 n (nHT)의 filamentous DNA 나선 관의 효과적인 중 합으로 이어지는 반지의 스태킹 트리거합니다. 그들의 윤곽선 길이 일반적으로 길이, 여러 미크론을 측정 하 고 그들의 길이 분포는 걸 필 라 멘 트9,26,,2728의 비교. 그것은 표시 되었습니다 유사한 DNA 나노튜브에 대 한 그들은 실제로 비슷한 걸 필 라 멘 트 및 microtubules의 중 합 속도 론을 전시p class = "외부 참조" > 29. 기본 반지 구조를 구성 하는 개별 DNA 물가의 수 n , 따라 nHT 건축으로 그것의 원주와 직경, 수 수 controllably 다양 합니다. 반지/튜브의 둘레 증가 더 많은 DNA 가닥을 사용 하 고 해당 건축 변경 이동에 해당 하는 높은 강성 높은 lp 값 (그림 1C), 기계적 특성. 생체 규모 큰 lp 값이 높은 강성으로 인해 덜 구부러진된 conformations 변환 (그림 1D 및 E).

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프로토콜

1. n HTs의 준비

참고: 여기, n 다른 단일 DNA 가닥을 특정 크기의 나선 관의 형성에 관여의 수를 나타냅니다. N = 8, 8 개의 다른 단일 DNA 가닥 단위 링 메이크업.

  1. 구매 DNA 시퀀스 (HPLC 순도 등급 이상) 적당 한 DNA 합성에서 서비스 또는 높은-품질 합성 및 정화 (모범적인 시퀀스를 표 1에 주어진).
  2. 정화 물에 따라 더 물의 resuspension resuspend 동결 건조 된 oligonucleotides 단계는 회사에서 해당 설명서에 주어진. 200 µ M의 최종 농도 얻을 수의 양을 조절.
    3. 배포자에 의해 주어진 값을 확인 하 긴
  3. 단일 DNA의 농도 결정 (예: 260에 대 한 UV 분광학을 통해 nm) 이기 때문에 정확한 산출할 어셈블리 프로세스에 대 한 중요 한. 특정 어 금 니 무게 및 각 단일 가닥 DNA oligonucleotide에 대 한 소멸 계수 oligonucleotides의 농도 계산.
    참고: 소멸 계수 값 본질적으로 다를 다른 시퀀스에 대 한 및 상업적으로 구입한 DNA의 설명서에서 진술 된다. 그들은 또한 가까운 이웃 모델 수 자유롭게 사용할 수 있는 온라인 도구를 사용 하 여 계산할 수 있습니다. 분석기의 선형 범위를 준수 농도 결정을 위해 사용 하는 샘플을 희석 하십시오.
  4. Micropipette를 사용 하 여 혼합 DNA 가닥-각 농도에서 동시에 원하는 n HTs를 thermocycler (예를 들어, 200 µ L PCR 튜브)에 대 한 적합 한 컨테이너 (최종 버퍼 조건: 1xTE (10 mM Tris 및 1 m m EDTA, pH 8) 및 12.5 m m MgCl 2).
    참고: 최종 DNA n HT 샘플 구성 n-1 가닥, U 1 − U n − 1, 고 1 T n 가닥. 스트랜드 당 농도 사용자의 요구에 따라 하위-micromolar 이상 10 µ M에서 다를 수 있습니다 (예를 들어, < 단일 필 라 멘 트를 관찰 하는 후속 희석에 대 한 가닥 또는 높은 농도의 시험에 대 한 당 1 µ m 조밀한 네트워크 역학).
  5. 교배 n HTs thermocycler (65 ° c 이후 빠른 드롭과 90 ° C에서 10 분 변성, 느린 온도 65 ° C에서 30 분-0.5 K의 20 온도 단계에서 보완 기본 페어링으로 55 ° C 감소에 각; 그리고 한 빠른 방울 55 ° C에서 20 ° C); 그림 2A 참조.
    참고: 65 ° C에서 느린 감소 단계 평균 튜브 길이; 증가를 길게 할 수 있습니다. 그러나, 20 ° C에 이후 빠른 드롭 생산 튜브의 집계를 피하기 위해 중요 하다.
  6. 감지 저하 없이 4 ° C에서 최대 3 주 동안 교배 n HTs 저장.
    참고: 형광에 대 한 현미경 검사 법, n HTs 표시 됩니다 때 교배 (부분적으로) 수정된 U1 Cy3 (표 1)와 u 1을 대체 하 여. 더 이상 관찰 시간, 설립된 안티 표백 에이전트의 추가 것이 좋습니다.
  7. 신중 하 게 원하는 최종 농도에 샘플을 희석 (예를 들어, 4 네트워크 또는 20 µ M 단일 필 라 멘 트 관측에 대 한 nM) 필요한 경우 샘플 버퍼를 사용 하 여. 가능한 오류 소스를 최소화 하기 위해 원하는 최종 농도에서 샘플 조립.

2. 전단 유동 학

동적 전단 고분자에 대 한
  1. 선택 적절 한 형상 (-격판덮개 또는 콘 판). 콘 판 기하학을 사용 하는 작은 볼륨 (즉, 아래 200 µ L).
  2. 동적 전단 고분자에 샘플 로드.
  3. 잠재적인 증발 효과 방지 하기 위해 다음 단계를 사용 하 여 환경과 샘플의 공기-물 인터페이스 passivate.
    1. 샘플 버퍼 목욕의 2.5 mL과 샘플을 둘러싸고.
    2. Micelle 농도 바로 아래 계면 활성 제를 추가.
    3. 해밀턴 주사기를 사용 하 여 공기 샘플의 직접 접촉을 피하기 위해 지질으로 샘플을 둘러싸고.
  4. 젖은 스폰지를 갖춘 모자와 함께 샘플 챔버를 봉인 하 고, 만약에 가능 하다 면, 추가 (샘플) 접촉 하지 추가 물 목욕과 증발을 억제.
  5. 실내 온도에서 고분자 관련 소프트웨어를 사용 하 여 측정을 시작, (해당 되는 경우 생리 조건 필요) 또는 37 ° C와 같은 서로 다른 온도에서 측정을 수행.
    참고: 샘플을 냉각은 종종 함께 수증기의 응축 주변 공기에서 난방 리드 향상 된 증발 하는 동안 합니다. 두 효과 미친 듯이 샘플의 농도 시리즈에서 모든 측정은 일정 한 온도에서 수행 되어야 한다 변경할 수 있습니다.
  6. 실 온에서 2 h equilibrate을 샘플을 수 있습니다. 시간 진화 시간 청소와 모니터링할 수 있습니다 (데이터 분당 지점, 스트레인 γ = 5%; 주파수 f = 1 Hz).
  7. 원하는 테스트 프로토콜 기계적 특성을 측정합니다. 주파수 스위프의 시리즈와 함께 시작 (f-스윕) 그들은 샘플 그대로 두고 더 많은 측정에 대 한 허용 하기 때문에.
    참고: 또한, 짧은 f-더 이상 측정 전후 청소 밖으로 실행 되어야 한다 (긴 f 등-훨씬 더 높은 해상도와 스윕) 샘플 전체 측정 프로토콜에 걸쳐 변동 확인 하.
  8. 수행 짧은
      f-스윕 (예를 들어, γ = 5%; f = 0.01 Hz 30 hz; 10 년 당 5 데이터 포인트).
    1. 수행 긴 f-스윕 (예를 들어, γ = 5%; f = 0.001 Hz 30 hz; 21 데이터 요소 10 년 당); 측정 시간을 줄이기 위해 필요 하지 않은 경우 낮은 주파수 정권을 생략할 수 있습니다.
    2. 짧은 f를 수행-스윕.
    3. Γ-스위프를 실행 (예: f = 1 Hz; γ = 0.0125% ~ 100%; 10 년 당 20 데이터 포인트).
      참고: 사용 짧은 f-청소 처음, 그것은 일반적으로 이전 f 일치-스윕 네트워크는 일반적으로 γ-스윕 동안 파열 또는 격판덮개에서 분리 하기 때문에. 또는, γ-램프를 사용 하 여 (예: 0.025 s -1, t = = 60 s); 그러나, 경사로 일반적으로 변경할 필요가 모터 모드, 그래서 이후 짧은 f-스윕 위조한 것.
  9. 빈 또는 부드럽게 가우시안 커널 원시 데이터.

3. 형광 기반 분석의 DNA 어 닐 링

  1. 12의 준비 8 aliquots µ L 1-4 µ M를 사용 하 여 각 샘플에 대 한 DNA 가닥, TE 버퍼, x 12.5 m m 1에서 MgCl 2 및 1 핵 산 젤 x 10000 x DMSO에서 얼룩 주식입니다. 없는 DNA와 부정적인 제어 하지만 핵 산 젤 얼룩을 포함.
  2. 실시간 PCR 플레이트에는 aliquots를 전송 하 고 접착 필름 (예를 들어, 96-잘 반응 플레이트)와 함께 인감.
    참고: 프로토콜을 어 닐 링 열에 사용 된 높은 온도 샘플 증발 됩니다. 따라서, 우물은 특히 장기 실험 중 물 증발 및 농도 증가 방지 하기 위해 접착 필름으로 단단히 밀폐 된 있는지 확인 하십시오.
  3. 가스 거품 제거를 실 온에서 1 분 x 100g에 격판덮개 원심; 가스 거품 확장, 우물 분석 될 수 없습니다.
  4. 실시간 정량 PCR 시스템으로 밀폐 접시 로드.
  5. 어 닐 링 프로그램을 실행합니다. 10 분 드롭 빨리 72 ° c.에 온도 90 ° C에서 DNA를 변성 다음, 0.5 ° C 마다 30 분으로 천천히 온도 감소. 후에 신호는 부식 가속 온도 램프.
    참고: 72 ° C는 진짜 교 잡 온도; 위에 충분히 따라서, 신호는 광범위 한 온도 범위는 필요한 온도 범위를 결정 하기 위한 적합 한 기록.
  6. 는 cycler 뚜껑 접착 필름에 증발된 샘플의 응축을 방지 하기 위해 100 ° c 이상가 열이 있는지 확인 하십시오.
  7. 488에서 아르곤 이온 레이저 샘플 어셈블리, 동안 자극 nm 550에서 형광을 검출 하 고 nm 핵 산 젤 얼룩을 사용 하는 경우 (또는 괴기 하 게 비슷한). 다른 염료에 대 한 적절 한 여기/방출 조합을 선택 합니다. 전체 증가를 가능한 한 자주 형광 신호를 측정 내장 카메라를 사용 하 여 신호 품질.
    참고: 여기, 측정 모든 9 찍은 s.
  8. 미리 용 해 및 어 닐 링 프로그램 적용 하는 경우 데이터를 분석 하는 제공 된 소프트웨어를 사용 합니다. 그렇지 않으면, 형광 신호의 상대적인 변화를 각 온도 단계에 대 한 평균 값에서 이전 평균 값 빼기.

4. AFM 이미징

  1. 쪼개 운 모 (예: 운 모 " V1 ") 상용 접착 테이프를 부착 하 고 벗; 여는 운의 최고 층을 제거 해야 합니다.
  2. 미리 형성 된 n HT Mg 2 + 갓 쪼개진된 운 모에 접는 버퍼를 포함 하 고 10 분에 대 한 정착 보증금 micropipette를 사용 하 여
  3. 남은 액체를 제거 하는 작은 테이블 원심 분리기에 2000 x g 3-s 짧은 간격에서 샘플을 회전 합니다. 여러 n HTs 여전히 운 모 표면에 붙어 있어야 한다.
  4. 외팔보 팁 높은 뻣 뻣 함 (예: 54 Nm -1) 사용 하 고 내부 AFM 소프트웨어와 함께 그것의 공명 주파수 결정.
  5. 기록 모드 손상 또는 n HTs.를 전치 하지 않으려면 낮은 스캔 속도 (예를 들어, 1 선/s)에서 도청에서 공기에 afm 높이 프로 파일

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결과

온도 경사로 (그림 2)를 통해 DNA 나노튜브의 어셈블리 이러한 인공 semiflexible 폴리머를 형성 하는 매우 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이러한 고분자 걸 필 라 멘 트, 등 그들의 자연적 사건 대응에 유사한 특성을가지고 있지만 훨씬 광범위 한 실험 프레임 워크를 그들의 기계적 특성은 controllably 될 수 있으므로 변경9,27 제공 . Biopolymers, 처럼 그들은 네트워크 (그림 3)에서 배열 될 수 있다 고 특히 대량 구조 및 속성에 필 라 멘 트 경직성의 영향을 테스트 할 수 있습니다. 그림 4에서 같이, 이러한 네트워크 표시 긴장에 대 한 선형 긴장 정권 최대 10%, 밀접 하...

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토론

제대로 구성 된 네트워크를, DNA 나노튜브 조립은 중요 한 단계 이다. 합성 과정에서 오류 저하 튜브 품질; 따라서, HPLC 또는 더 엄격한 프로세스는 oligonucleotides 정화를 사용할 것이 좋습니다. 집합에서 n 구성 oligonucleotides의 아데닌 산출할 집계 DNA 나노튜브, 뿐만 아니라 그들의 길이 분포 보다 이산의 형성에 의하여 달려 있다, 이후 그것은 농도 측정 하는 데 필요한 구입한 가닥의 이후 값 주어진 수 다 실질적으로 실제 농도에서. 이 수행할 수 있습니다, 예를 들어, 260의 흡 광도 파장에서 자외선에 대 한 분광학에 의해 nm. 분자 무게와 소멸 계수; 다른 시퀀스 사이 다 참고 하 고 싶습니다. 따라서, 농도에 흡 광도 변환할 값 각 DNA oligonucleotide에 대 한 결정 되어야 합니다. 장비는 NanoDrop 같은 작은 샘플 볼륨에 대 한 최적화를 사용 하는 경우 각 측정 지점은 여러 번 촬영 한 평균 해야 합니다. 탐지는 분석기의 선형 범위를 준수 합니...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

DFG (1116/17-1) 및 "BuildMoNa" (GSC 185) 자연 과학의 라이프 찌 히 학교에 의해 자금을 인정 합니다. 이 작품은 프라운호퍼 유치 프로젝트 601 683 통해 지원 되었습니다. T. H. 유럽 사회 기금 (ESF-100077106)에서 자금을 인정 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AFM 캔틸레버 ACTAAppNano
AFM - NanoWizard 3JPK Instruments
CCD 카메라AndoriXon DV887
DMSOSigma-AldrichD2650
DNA 올리고뉴클레오티드Biomers.net염기서열은 표 1
DNA Cy3 표지 올리고뉴클레오티드Biomers.net서열은 표 1
EDTASigma-AldrichE-9884
Epi-fluorescence micro-scopeLeicaDM-IRB
MgCl2Sigma-AldrichM-8266
Mica "V1", 12 mm roundPlano GmbH50-12
MicroAmp®를 참조하십시오. 고속 광학 96웰 반응 플레이트Thermo Fisher Scientific Inc.
MicroAmp® 광학 접착 필름Thermo Fisher Scientific Inc.
NanoDrop 1000 분광 광도계Thermo Fisher Scientific Inc.
100x 대물렌즈Leica5506168
정제수Merk Millipore - Milli-Q & Elix
사파이어 PCR 튜브Greiner Bio-One683271
T전문 표준 PCR ThermocyclerCore Life Sciences Inc.070- 표준
7900HT 고속 실시간 PCR 시스템응용 바이오시스템4351405
레오미터TA 기기ARES
SYBR® 그린 I 핵산 젤 염색Thermo Fisher Scientific Inc.S7567
트리스시그마-알드리치T4661
트리톤 X-100시그마-알드리치X-100공기-물 계면에서 시료의 증발을 억제합니다
43469074306311은 .

참고문헌

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