시아 노 박테리아의 글리코겐 함량 측정

요약

여기, 시아 노 박테리아 세포에서 글리코겐 함량을 측정하기위한 신뢰할 수 있고 쉬운 분석법을 제시합니다. 이 과정은 침전, 선택 가능한 해중합 및 포도당 잔류 물의 검출을 수반한다. 이 방법은 야생형 및 유 전적으로 변형 된 균주 모두에 적합하며 시아 노 박테리아의 대사 공학을 촉진 할 수 있습니다.

초록

시아 노 박테리아는 글리코겐을 광합성 과정에서 주요 세포 내 탄소와 에너지 저장 물질로 축적합니다. 최근의 연구 결과는 생합성 및 이화 과정의 산화 환원 조절, 산화 환원 조절 및 비 암호화 RNA의 관련을 포함한 글리코겐 대사의 복잡한 기전을 강조했다. 동시에, 생산량을 향상시키기 위해 글리코겐의 탄소를 유 전적으로 생산 된 시아 노 박테리아의 바람직한 제품으로 방향을 바꾸려는 노력이 이루어지고 있습니다. 여러 방법이 다양한 정확도와 기술적 복잡성을 지닌 시아 노 박테리아의 글리코겐 함량을 결정하는 데 사용됩니다. 여기, 표준 생명 과학 실험실에서 수행 할 수있는 시아 노 박테리아의 글리코겐 함량을 신뢰할 수있게 결정하기위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜은 세포 lysate에서 글리코겐의 선택적 석출과 글루코스 단량체를 생성하는 글리코겐의 효소 해중합을 포함하며, 이는 글루코스 옥시idase-peroxidase (GOD-POD) 효소 커플 링 분석. 이 방법은 Synechocystis sp. PCC 6803 및 Synechococcus sp. PCC 7002, 신진 대사 공학에서 널리 사용되는 두 개의 모델 시아 노 박테리아 종. 또한,이 방법은 조절 요소 또는 글리코겐 생합성 유전자가 결핍 된 야생형과 돌연변이 체 사이에서 글리코겐 함량의 차이를 성공적으로 나타냈다.

서론

남조류는 광합성 광 고정 CO _2에서 탄소의 주요 탄수화물 저장소로서 글리코겐을 축적. 글리코겐은 α-1,6- 연결 글루코 실 결합에 의해 생성 된 가지를 갖는 선형 α-1,4- 결합 글루칸으로 구성된 글리 칸이다. 시아 노 박테리아에서의 글리코겐 생합성은 포스 포 글루코 튜 타제와 ADP- 글루코스 피로 인산화 효소의 순차적 작용을 통해 글루코오스 -6- 인산을 ADP- 글루코스로 전환시키는 것으로 시작한다. ADP- 포도당의 글루코오스 잔기는 하나 이상의 글리코겐 합성 효소 (GlgA)에 의해 글리코겐의 α-1,4- 글루칸 백본의 비 환원 말단으로 전달된다. 이어서, 분지 효소가 α-1,6- 결합 된 글루코 실 결합을 도입하고, 글리코겐 입자를 생성하도록 추가 확장시킨다. 어둠 속에서 글리코겐은 글리코겐 포스 포 릴라 제, 글리코겐 탈 분기 효소, α- 글루 카노 트랜스퍼 라제 및 말토 덱스트린 포스 포 릴라 제에 의해 인산화 된 글루코오스와 유리 글루코스로 분해됩니다. 이러한 피드 int산화성 오탄당 인산 경로, Embden-Meyerhof-Parnas 경로 (glycolysis), Entner-Doudoroff 경로 ^{1 , 2 ,}

프로토콜

1. 준비

1. 시아 노 박테리아 배양
   1. 성장 Synechocystis sp. 1 % (v / v) CO _2가 보충 된 일정한 공기 공급으로 30 ℃에서 액체 BG11 배지 ⁸ 에서 PCC 6803. 50 μmol photon / m ² / s의 광합성 광자 자속 밀도에서 빛으로 문화를 지속적으로 조명하십시오.
   2. 성장하는 Synechococcus sp. PCA 7002는 1 % (v / v) CO _2가 보충 된 일정량의 공기가 공급되는 액체 A + 배지 ²³ (BG11 배지도 사용 가능). 온도는 37 ° C이어야합니다. 150 μmol photon / m ² / s의 광합성 광자 자속 밀도에서 빛으로 문화를 지속적으로 조명하십시오.
   3. 1cm의 빛 경로와 함께 큐벳을 사용하여 730 nm에서 문화의 광학 밀도 (OD)를 측정합니다. OD 값이 0.8 이상이면 적절한 희석을하여 th에 비례하는 OD 측정 값을 얻으십시오e 세포 농도.
      참고 : 아래 제시된 프로토콜은 액체 배양에 적합하며 OD

결과

10 mL의 야생형 Synechocystis sp. PCC 6803은 OD _730nm 값이 약 0.8에 도달 할 때까지 광 자기 영양 조건 하에서 성장시켰다. 세포를 수확하고 50 mM Tris-HCl, pH 8에 재현 탁시켰다. OD ₇₃₀ nm 값을 2-3으로 조정 하였다. 상기 한 프로토콜에 따라 글리코겐 함량을 분석 하였다. OD _730nm 당 글리코겐 함량은 13 ± 1.8 μg / mL / OD ₇₃₀ nm ( N = 12)이었다. 글리코겐 함량은 단백질 함량에 비례하여 0.24 ± 0.03 μg / μg ( N = 12)이었고 엽록소 a 함량에 대한 글리코겐 함량은 5.7 ± 0.6 μg / μg ( N = 12)이었다. 사용 가능한 물질의 양이 적기 때문에 셀 건조 중량의 측정이 생략되었습니다. 유.......

토론

프로토콜 내에서 중요한 단계는 글리코겐 침전 및 재 부유입니다. 에탄올 침전 후 원심 분리 후, 글리코겐은 미세 원심 분리 튜브의 벽에 느슨하게 부착되는 반투명 펠렛을 형성한다. 따라서 상등액을 제거 할 때 pellet을 제거하지 않도록 특별한주의가 필요합니다. 글리코겐 펠렛은 끈적 거리며, 건조되면 가용화가 어려울 수 있습니다. 글리코겐 펠렛의 완전한 가용화는 중요하지 않은데, 이는 불완전한 가용화로 인해 비효율적 인 효소 분해가 유발 될 것이고, 따라서 기술 복제간에 큰 차이가 발생할 수 있기 때문이다. 볼 텍싱에 의한 가용화 전에 초음파 처리를 적용하면 공정을 촉진시킬 수있다.

표준화 방법의 선택과 관련하여 셀 건조 중량은 널리 사용되는 참고 자료입니다. 단백질과 엽록소의 측정보다 더 힘들고 더 많은 세포 바이오 매스가 필요하다.a . 전체 단백질 함량은 세포 바이오 매스에 대한 대안적인 참조를 제공하며, 본 프로토콜에 기술 된 바와 같이 소규모로 결정될.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
QSonica Sonicators Q700	Qsonica, LLC	NA	QSonica
SpectraMax 190 마이크로플레이트 리더	Molecular Devices	NA	Eliza 플레이트 리더
Bullet Blender Storm	Next Advance	BBY24M-CE	비즈 비터
Ultrospec 3100 pro UV/Visible 분광광도계	Amersham Biosciences	NA	분광광도계
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	완충액
HCl	Merck	1-00317	pH 조절
아세트산	나트륨 Sigma-Aldrich	32319	완충액
Amyloglycosidase (Rhizopus sp.)	글리코겐 해체를 위한	Megazyme	E-AMGPU
&알파;-아밀라제, 열안정성 (Bacillus licheniformis)	Sigma-Aldrich	A3176	글리코겐 해체화를 위한
효소 D-Glucose	Merch	8337	포도당 분석 표준
Pierce BCA 단백질 분석 키트	Thermo Fisher scientific	23225	단백질 농도 측정용
알루미늄 건조 트레이, 일회용	VWR	611-1362	세포 건조 중량 측정용
D-Glucose assay kit(GODPOD 형식)	Megazyme	K-GLUC	포도당 농도 측정용
산화지르코늄 빵, 0.15mm	Next Advance	ZrOB015	세포 용해용 비드 Bullet Blendar Storm
RINO 튜브	Next Advance	NA	튜브: Bullet Blendar Storm의 세포 용해를 위한

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