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방법 논문

PVDF TrFE 도관 격차에 걸쳐 축 삭 재생을 촉진 하 Transected 쥐 척수 젊고 아름 다운 여자를 다리 안에 이식 Schwann 세포

6.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56077

⸱

2017년 11월 3일

 ,  ,  , 
1The Miami Project to Cure Paralysis, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering, New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering, New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery, University of Miami Miller School of Medicine

이 논문에서

요약

이 문서는 완전 한 transection 후 척수 젊고 아름 다운 여자와 채우기 Schwann 세포 (SCs)와 다리 하 고 격차에 걸쳐 축 삭 재생을 촉진 주사 지하실 멤브레인 매트릭스 사이 빈 도관을 삽입 하는 기법을 설명 합니다.

초록

쥐에서 척수 부상에 대 한 다양 한 모델 중에서 박상 모델 그것은 인간의 척수 상해의 가장 일반적인 유형 때문에 가장 자주 사용 됩니다. 전체 transection 모델 비록 타 박상 모델로 하지으로 임상으로 관련 축 삭 재생을 평가 하기 위해 가장 엄격한 방법입니다. 타 박상 모델에서 조직 게시물 부상을 나머지의 존재로 인해 부 화 또는 절약 axons에서 재생성 구별 하기가 어렵습니다. 완전 한 transection 모델에는 브리징 방법은 격차를 만들어 연속성 있는 rostral에서 꼬리 젊고 아름 다운 여자를 치료의 효과 평가 하는 데 필요한입니다. 신뢰할 수 있는 브리징 수술 수술 방법에 따른 가변성을 감소 결과 측정을 테스트 하는 필수적 이다. 여기에 설명 된 프로토콜 Schwann 세포 (SCs)를 준비 하는 데 사용 됩니다 이식, 흉부 레벨 8 (T8)에서 척수의 완전 한 transection 전 도관에 도관을 삽입 하 고 도관으로 SCs를 이식. 이 접근은 또한 제자리에 고 SC 이식 호스트 조직으로 rostral와 꼬리 인터페이스를 통해 향상 된 축 삭 성장을 허용 하는 주 사용 지하실 멤브레인 행렬의 사용 합니다.

서론

척수 부상 수리는 관련 된, 예를 들어 조합 처리 전략을 필요로 하는 복잡 하 고 어려운 문제, 세포와 이식된 세포 기능 및 축 삭에 대 한 유리한 microenvironment를 제공 하는 소재를 사용 하 여 다시 부상의 생성 사이트 Hemisection1,2,,34,5,6,7,,89 및 완료 transection10 ,11,12,13,14,15,,1617,18,19 ,20,,2122 모델 소재 기반 브리지 치료의 효과 평가 하기 위해 자주 사용 됩니다. Hemisection 모델을 사용 하 여의 장점은 그것 완료 transection에 비해 브리징 구문에 대 한 더 많은 안정성을 제공입니다. 그러나, hemisection 모델, 그것은 절약된 조직의 존재로 인해 적용 된 치료 방법의 결과로 축 삭 재생을 증명 어렵다. 완전 한 transection 모델은 축 삭 재생을 보여 주기 위해 가장 엄격한 방법입니다.

다양 한 자연 및 합성 물질 주사 젤으로 사용 하기 위해 연구, 미리 형성 된 젤 hemisection에 타 박상 또는 hemisection 모델 또는 구조적된 도관 배치 또는 transection 모델 (에 대 한 자세한 리뷰23 를 완료합니다 , 24 , 25). 제자리에서 고 주 사용 매트릭스/SC 혼합물의 이식 및 축 삭 교차점26,27 미리 gelled 매트릭스/SC 임 플 란 트에 비해 호스트 코드 사이 더 인터페이스를 만듭니다 5 , 18 , 19 , 28. 제자리에서 고 허용 더 엄밀 하 고 구조화 된 도관 또는 덜 moldable 미리 형성 된 젤 수 없습니다 반면 불규칙 한 호스트 인터페이스 주위 윤곽을 매트릭스. 구조화 된 도관 자주 주사 매트릭스 달리 연락처 지침과 임 플 란 트 안정성을 제공합니다. 여기에 제시 된 프로토콜 설명 주사 지하실 멤브레인 매트릭스 (예: matrigel, 주사 매트릭스 여기로 테이블의 자료를 참조 하는 참조) 및 구조화 된 도관을 이용 하는 수술 가장 엄격한 척수 손상 모델에서 축 삭 재생을 평가 합니다.

Electrospun 폴 리-vinylidenedifluoride-trifluoroethylene (PVDF TrFE) 정렬 된 섬유 빈 도관 우리의 실험적인 접근 방식에 사용 됩니다. PVDF TrFE는 기계적으로 변형 하는 경우 임시 충전을 생성 하 neurite 연장 및 축 삭 재생을 촉진을 보여줘 왔다 압 전 폴리머29,30 생체 외에서그리고 vivo에서 31. 전기는 빠르게 제어 속성 섬유 정렬, 섬유 직경, 및을 위한 발판의 두께 등 다양 한 고분자를 사용 하 여 신뢰할 수 있는 섬유 건설 기계를 생산할 수 있는 일반적인 비 계 제조 방법 신경 및 기타 응용 프로그램32,,3334

쥐 척수 부상 사이트에 이식 하는 SCs의 수많은 학문은 치료 효능5,9,,1819,20,21 설명 했다 ,26. 이러한 이식 병 변 주위의 조직에 대 한 신경, 병 변 캐비티 크기를 줄일 수 있으며 병 변/이식 사이트 및 myelination 재생성 된 축 삭의 축 삭 재생을 촉진. 인간의 SCs autologously 이식 될 수 있습니다, 그리고 이점을 비교 될 때 대부분의 다른 관련 된 신경 세포24. 말 초 신경 생 검 후 SCs 수 고립 된 고 정화 및 인간으로 이식에 대 한 원하는 금액을 확산 것입니다. 척수 부상 환자에 대 한 헌 SC 이식 이란35,36,,3738, 중국39,40, 안전한 것으로 입증 되었습니다 및 미국41,42. SCs는 수많은 neurotrophic 요인 및 축 삭 성장을 위한 중요 한 세포 외 기질 단백질을 분 비 하 고 말 초 신경 손상 후 축 삭 재생에 필수적인 역할을 알려져 있습니다. 우리의 목표는 여기 도관 디자인 완전 한 쥐 척수 transection 모델에 SC 이식의 결과 개선 하기 위해 조사할 수 있는 방법을 설명 하는 것입니다.

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프로토콜

여성 성인 피셔 쥐 (180-200 g 몸 무게) NIH와 USDA 지침에 따라 보관 됩니다. 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 마이애미 대학의 모든 동물 절차 승인.

1. 사전 이식 준비

  1. 도관 준비.
    1. 잘라 도관 #10 블레이드 해 현미경을 사용 하 여 길이 5 m m.
      참고: 2.4-2.7 m m; 사이 도관의 내부 직경은 외부 직경은 2.5-2.8 m m 사이.
    2. 경도 측면 ( 그림 1A)을 따라 부드럽게 도관을 접어. 0.4 m m 길이 및 적어도 1mm 도관의 구멍에서 떨어져 똑 바른 가장자리 욕실이 위 ( 그림 1B)를 사용 하 여 약 1 m m에 대 한 4 개의 작은 절 개를 잘라.
      1. 도관 ( 그림 1C)을 전개 하 고 만드는 두 개의 창을 나란히 같은 측면을 따라 두 절 사이 ( 그림 1D)를 잘라. 창문을 열어 하 고 포경을 따라 제대로 닫혀 수.
    3. 10 cm 배양 접시에서 25 분 75% 에탄올에 도관을 소독. 1 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 4 분 한 번 도관 린스 하 고 살 균 겸 새로운 10 cm 배양 접시에는 도관 전송. 각 25 분에 대 한 1 x PBS로 두 번 도관 린스.
    4. 수술까지 1 x PBS에는 도관을 저장.
      참고: 많은 도관 수 있다 살 균 되어야 한 번에. 별도 살 균 1.5 mL 원심 분리기 튜브 메 마른 그들을 유지 하는 도관 저장.
  2. 녹색 형광 단백질 (GFP)-Schwann 세포 (SC) 준비
    1. 앞에서 설명한 43에서 성인 여성 피셔의 tibial 신경 정화 사우스 캐롤라이나 문화 쥐를 준비. 이 단계의 완료에 접시에 폴 리-L-리 신 (PLL) SCs-10 cm 배양 접시를 코팅 하 고 유지 하는 d 10/3 M 매체; 이러한 SCs 통로 0으로 정의 됩니다.
      참고: d 10/3 M 매체는 다음 구성: 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 페니실린-스 (펜/strep), 20 µ g/mL 뇌 하 수 체 추출, 2 µ M 산림, Dulbecco에서 2.5 nM heregulin ' s 수정이 글 ' s 매체 (DMEM).
    2. 3 ~ 4 일 마다 신선한 d 10/3 M 매체 (mL/10-7cm 페 트리 접시)와 보충.
    3. 분할 사우스 캐롤라이나 문화 합류 70-80%에 도달 하면.
      1. 제거 매체와 행 크와 두 번 린스 ' s 균형 소금물 (HBSS) 칼슘 또는 마그네슘.
      2. 각 10 cm 배양 접시에 0.25 %trypsin / EDTA의 5 mL을 추가 하 고 실 온 (RT)에서 5 분 동안 품 어.
      3. Trypsin 무력화 50 mL 원심 분리기 관으로 d 10 매체 (10 %FBS 1% 펜/strep DMEM에)의 5 mL을 추가.
      4. 부드럽게 피펫으로 트립 신/EDTA 솔루션에는 페 트리 접시 SCs. 제거를 분리 하려면 여러 번 접시에서 세포 현 탁 액 고 그것 원심 분리기 튜브 이전 단계에서 준비 합니다. D 10 매체의 5 mL와 함께 접시를 헹 구 고 셀 수확을 최대화 하기 위해 원심 분리기 튜브에 배치.
      5. 370 x g 4 o C. 제거는 상쾌한에 5 분 동안에 세포를 원심 및 각 페 트리 접시 분할에 대 한 4 mL d 10/3 M 매체에 셀 resuspend.
      6. 10 cm 배양 접시에 1 mL의 사우스 캐롤라이나 정지 및 d 10/3 M 매체의 6 mL 분배; 각 페 트리 접시 분할 4 접시 귀 착될 것 이다. 이러한 SCs 통과 1로 정의 됩니다.
      7. 신선한 d 10/3 M 매체는 하루 도금 후 도금 후 3-4 일 마다 Replenish.
      8. 한번 SCs 합류 70-80%에 도달, 단계 1.2.3.1 1.2.3.6 반복. SCs는 지금 통로 2.
    4. 50% 합류 한 번 도달 하는 SCs transduce, GFP d 10/3 M에서 인코딩 lentiviral 벡터와 하룻밤 30의 감염의 다양성에 매체 앞 44 , 45에서 설명한 .
    5. 다음날과 도금 후 3-4 일 마다 신선한 d 10/3 M 매체와 보충.
    6. GFP-SCs 70-80% 합류, 도달 단계 1.2.3.1 1.2.3.5 반복 하지만 대신 d 10 매체의 6 mL에 GFP SCs를 resuspend. 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 GFP-사우스 캐롤라이나 정지의 15 µ L를 분배 하 고 0.4 %trypan 블루 솔루션의 15 µ L를 추가 합니다. 원심 분리기 튜브를 부드럽게 터치 한 셀 계산 슬라이드의 챔버에 혼합물의 10 µ L를 분배 합니다.
      1. 슬라이드 자동된 셀 카운터에 놓고 셀 밀도 결정.
    7. 370 x g 4 o C. 제거는 상쾌한에 5 분 동안에 세포를 원심, 모든 3 x 10 6 GFP 냉동 매체의 1.5 mL와 함께 resuspend-극저온 유리병, 그리고-80에서 동결에 GFP-사우스 캐롤라이나 정지의 1.5 mL 디스 펜스 SCs. o 스토리지에 대 한 액체 질소로 이동 하기 전에 적어도 24 h에 대 한 C.
      참고: 동결 매체: DMEM에 25 %FBS 8% 디 메 틸 sulfoxide.
    8. 녹여 GFP-SCs 수술 전에 1 주일.
      1. 50 mL 원심 분리기 관으로 추가 10 mL D10 매체.
      2. 녹여 물 목욕에서 37 o C 부분적으로 해 동 때까지 냉동된 GFP SCs 튜브.
      3. 극저온 유리병에서 GFP SC 현 탁 액을 제거 하 고 1.2.8.1에 50 mL 원심 분리기 튜브에 배치. 부드럽게 피펫으로 솔루션 고 반복적으로 아래로.
      4. 370 x g 4 o C. 제거는 상쾌한에 5 분 동안에 세포를 원심 및 해 동 각 유리병에 대 한 4 mL d 10/3 M 매체에 셀 resuspend.
      5. 10 cm 배양 접시에 GFP-사우스 캐롤라이나 정지 및 d 10/3 M 매체의 5 mL 2 mL 분배; 각 유리병 2 접시 초래 한다. GFP-SCs 통과 3로 정의 됩니다.
        참고: 10 cm 배양 접시 일반적으로 수익률 약 8 x 10 6 GFP SCs 1 주일 후.
    9. 수술 당일 단계 1.2.6 반복. 사용 셀 밀도 계산 단계 1.2.10.
    10. 3 x 10 6 GFP SCs 살 균 1.5 mL 원심 분리기로 디스 펜스 aliquots 튜브 셀 밀도에 따라 단계 1.2.9에서에서 계산. 370 x g 4 o C에서 5 분에 GFP SC aliquots 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 각 약 수와 원심 분리기에서 370 x g. DMEM/F12 매체의 1 mL을 추가
      참고: 각 동물 받는 3 x 10 6 GFP-SCs. 보통 혈 청으로이 단계까지 GFP SCs와 함께 사용 됩니다.
    11. 계속 GFP-SCs 이식의 시간까지 얼음에.

2. 흉부 레벨 8 (T8) Transection 완료

케 타 민 (60 밀리 그램/kg 체중) 및 xylazine (5의 복 주사와
  1. 수술 동물 준비
    1. Anesthetize 여성 피셔 쥐 (180-200 g) mg/kg 몸 무게)입니다. 발가락을 꼬 집는 것을 선택 하 여 다음 단계로 진행 하기 전에 마 취의 깊이 모니터링 하 고 눈을 깜박이 응답.
    2. 전기 깎기로 쥐의 뒤를 면도 하 고 70% 에탄올과 피부를 닦아냅니다. 두 눈에 안과 윤 활 유를 적용 합니다. 척추는 접근 하기 쉬운 롤에 약 37 o C. 장소는 동물에서 체온 유지에 생리대에 동물 수술 테이블에 전송.
      참고: 롤 종이 타월 이나 살 균 될 수 있는 거 즈에 x2에 2에서 만들 수 있습니다. T7-T9 롤 위에 납작하게 누워 있을 때 더 큰 롤은 것이 좋습니다.
  2. T9 laminectomy T7
    1. T9 T11 spinous 프로세스에 대 한 랜드마크를 찾습니다.
      참고: T9, T10, T11 사이 격차는 작은 다른 세그먼트에 비해 난n 지역입니다. 롤에 쥐를 놓고, T9 T11 spinous 프로세스는 피부를 통해 작은 삼각형 범프 처럼 느낄 것 이다.
    2. 는 T11에 T4에서 #10 블레이드를 사용 하 여 피부의 4 ~ 5 cm 중간 절 개를 확인 합니다. 지방 부에 무뚝뚝한 끝 곡선가 위 표면 지방 층에 작은 절 개를 만들기.
      참고: 악기의 다른 종류는 지방 질을 분리 하에 사용할 수 있지만 무뚝뚝한 끝 곡선된가 위 지방 분리에 대 한 가장 효과적이 고 최소한 침략 적 방법을 사용.
    3. #10 잎의 뒷면을 사용 하 여 T7을 T9 spinous 프로세스를 찾습니다. 무딘 집게로 t 4에 대 한에 근육 누른 T6-T10에서 척추의 각 측면을 따라 근육에 절 개를 확인 합니다. 깨끗 한 오프닝을 만들고 동물에 최소한의 부상의 입을 최대한 척추에 가까운 컷 확인.
    4. 각 개별 spinous 프로세스 t 7에서 근육과 인 대 사이의 T6와 T7 T7, T8, T8, T9, 절단 하 여 T9와 T9 T10 #10 블레이드와 격리.
    5. T9에 t 7에서 어떤 근육과 인 대는 하기에 제거 하는 rongeur를 사용 합니다. T7 t 9의 가로 프로세스 사이의 간격 표시 될 때까지 최대한 옆으로 근육과 인 대 제거.
    6. T9 spinous 프로세스는 rongeur 제거합니다. T8 spinous 프로세스 무딘 집게와 리프트 T9, T10 프로세스 사이의 작은 오프닝에서 T9 lamina 상승를 부드럽게 잡고.
    7. Lamina 오프닝에서 시작 하 고 t 9에서 rongeur와 rostrally 이동 제거 합니다. 가능한 만큼 많이 옆으로; lamina를 제거 지 뿌리는 laminectomy 후 표시 되어야 합니다.
    8. 는 lamina 제거 되 면 T8 및 t 7에 대 한 과정을 반복.
      참고: laminectomy, 동안를 사용 하 여 흡수 스피어스는 laminectomy 계속 하는 동안 혈액을 제거. 과다 출혈이 발생 하는 경우 압축된 스폰지에 출혈 사이트 놓고 염 혈액 응고에 도움이 추가.
  3. T8에서 transection
    1. T9에 T7 주위 견인 장소. 모든 하기 제거 되 면 가로 프로세스 사이의 간격 T8에 특히 볼 수 있는지 확인 합니다. 또한 바깥쪽으로 튀어나온 뼈 조각 없습니다 보장 하기 위해 t 9 T7 사이 양쪽에 길이 따라 뼈 검사.
      참고: T8에이 격차는 전체 transection 수행 중요 합니다. 길이 따라 척추 쉽게 도관 삽입을 위해 제거 되어야 합니다.
    2. 컷은 등 쪽 그리고 복 부 뿌리 T8 사용 하 여 위아래 각도 봄이 위. 척수에 염 분을 추가 하 고 기다리는 혈액 응고.
      참고:이 단계는 적절 한 도관 삽입을 위해 중요 하다.
    3. T8에서 가로 프로세스 사이의 간격 척수 위에 각도 봄이 위 놓고 한 컷 척수를 완전히 끊을 수 있도록. 압축 된 거품의 작은 조각 결과 2-2.5 m m 간격으로 배치 하 고 지역에 식 염 수를 즉시 추가.

3. 도관 삽입

  1. 1 x PBS에서 도관 꺼내 hemostasis 도달 절단된 코드 젊고 아름 다운 여자를 기다리는 동안. 얇은 긴 조각으로 흡수 삼각형을 잘라 고 그들 도관 초과 PBS를 제거 합니다. 미리 잘라 창이 열려 확인.
  2. 염 분을 제거 하 고 혈액 흡수 삼각형의 얇은 긴 조각을 사용 하 여. 좋은 분리를 보장 하는 microspatula를 사용 하 여 척수의 두 젊고 아름 다운 여자를 들어올립니다. 부드럽게 rostral 그 루터 기는 microspatula와 들어올린 자신을 직면 하는 windows와 함께 그 루터 기에 도관을 풀. 전체 그 루터 기를 삽입 하 고 도관에 아무 초과 출혈이 있다.
    3. 부드럽게
  3. 꼬리 밑둥 들어올린 그 루터 기에는 도관의 다른 쪽 끝을 풀. 전체 그 루터 기 삽입 되 고 창 ( 그림 2A) 등 쪽 표면에는 있는지 확인 하십시오.

4. Schwann 세포 / 주 사용 매트릭스 (재료의 표 참조) 준비 및 사출

  1. hemostasis 도달 절단된 코드를 기다리는 동안 GFP SC 펠 릿 (단계 1.2 준비) 위의 매체를 제거. 차가운 DMEM/F12의 10 µ l에 GFP SCs를 resuspend. 세포 현 탁 액을 감기 주사 젤의 10 µ l을 추가 하 고 반복 pipetting으로 잘 혼합. 도관 삽입 완료 될 때까지 얼음에 GFP-SC/DMEM/F12/주 사용 매트릭스 혼합물을 유지.
  2. 는 등 쪽 표면에 창문 ( 그림 2A)를 확인 한 후 미리 잘라 창 46 중 하나를 통해 도관에 GFP-SC/DMEM/F12/주 사용 매트릭스 혼합물의 20 µ l 주사 사용 하는 팁과는 micropipette 로드 서쪽 오 점. 사우스 캐롤라이나/DMEM/F12/주 사용 매트릭스 혼합물 도관을 연극 해야, 흡수 삼각형으로 과잉을 제거 합니다. 주사; 후 창 닫기 아니다 봉합 필요 ( 그림 2B).

5. 상처 폐쇄와 수술 후 케어

  1. 봉합 근육 레이어 및 표면 뚱뚱한 층. 70% 에탄올과 다음 주식 (예를 들어, 상처 클립을 사용 하 여)와 피부를 깨끗 한 피부를 종료. 그들은 식이 되 찾을 때까지 열 레 귤 레이트 인큐베이터에서 동물을 유지. 동물 감 금 소에 다시 전송 합니다. 오래 먹이 튜브 물 제공 하 고 장소 알 약을 음식에 쉬운 접근을 위한 침구.
  2. 관리 Buprenorphine (0.1 mg/kg 체중) 피하 통증을 줄이기 위해 수술 후 즉시 시작 하는 3 일 동안 하루에 두 번. Gentamycin (5 mg/kg 체중)을 방지 하 고 감염을 줄이기 위해 수술 후 즉시 7 일 동안 하루에 한 번 피하 주사. 10 mL lactated Ringers 솔루션의 수 화에 대 한 일 동안 하루에 두 번 피하 주사.
  3. 빈 방광 수동으로 두 번 방광까지 하루 함수 반환 합니다. 방광 감염 발생 하는 경우 다음 관리 10 mL의 염 분 피하까지 소변 명확 하 게 된다. 이틀에 개선 경우 주사 gentamycin (5 mg/kg 체중, 하루에 한 번씩) 피하까지 소변 분명해.

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결과

이 수술 기법을 사용 하 여 목표 구조화 된 도관 및 완료 transected 척수에 이식 후 SC 함수를 최대화 하는 주 사용 매트릭스의 사용을 평가 하는 것입니다. 이식 후 3 주 동물 4 %paraformaldehyde 끼얹는다는 고 척추 열 조잡 해 부하 고 다른 24 h에 대 한 동일한 정착 액에 고정. 척수 후 해 부 고 cryostat 화살 섹션에 대 한 샘플은 cryoprotection에 대 한 30% 자당 해결책으로 됩니다. 1 m m 두께 횡단 해 부 척수의 또 다른 세트의 SC 다리의 중간에서 절연 플라스틱 섹션에 대 한 처리도 정착 액에 배치 됩니다. 샘플 전자 현미경 준비 베이츠 외. 여 자세한 일정을 복종 된다 47. cryostat 화살 섹션은 immunostained GFP, 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP)에 대 한 1 차적인 항 체와 무거운 체인 neurofila...

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토론

효과적인 transection 모델을 만드는 가장 중요 한 단계는 하나 또는 두 개의 상처에서 척수 절단은. Rostral와 꼬리 척수 젊고 아름 다운 여자 사이 2-2.5 m m 간격 transection 사이트에 존재 해야 합니다. 나타나지 않는 이러한 격차에 대 한 세 가지 가능성이 가장 높은 이유는 (1) 등/복 부 뿌리 제대로 제거 되지 않은, (2) 복 부 두 라 적절 하 게, 제거 되지 않았습니다 및 (3) 동물 그녀 아래 배치 롤에 제대로 위치 하지 했다.

젊고 아름 다운 여자 사이 효과적인 도관 삽입을 수행 하려면: 특정 종과; 실험에 사용 된 동물의 나이 맞출 도관의 (1) 직경 (2) 하기 가로 프로세스 사이의 격차를 구상 될 수 있다; 때까지 옆으로 충분히 제거 되어야 합니다. (3) 뿌리를 제거 해야 하 고 첫 번째 시도에 젊고 아름 다운 여자 사이 (4) 도관 삽입을 달성 한다. 여러 시도 필요한 경우,이 젊고 아름 다운 여자, 더는 젊고 아름 다운 여자...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리 감사 드리고 싶습니다 바이러스 성 벡터와 동물 코어 치료 마비에 마이애미 프로젝트에서 각각 lenti GFP 바이러스 및 제공 동물 관리, 생산 및 조직학 및 이미징 코어 cryostat, confocal 현미경의 사용에 대 한 고 스테레오 탐정 형광 현미경입니다. 자금 NINDS (09923), 국방부 (W81XWH-14-1-0482), NSF (DMR-1006510)에 의해 제공 했다. M.B. Bunge는 크리스틴 E 린 저명한 교수의 신경 과학 이다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
극저온 바이알ThermoFisher Scientific5000-0020
10cm 페트리 접시VWR25382-428
Dulbecco의 변형된 독수리 배지: 영양소 혼합물 F-12ThermoFisher Scientific11039-021"DMEM/F12" 프로토콜.
페니실린-스트렙토마이신ThermoFisher Scientific15140-122"Pen/Strep" in protcol.
혈청HycloneSH300-70-03프로토콜의 "FBS".
뇌하수체 추출물생물 의학 기술BT-215
포스콜린시그마-알드리치F6886
헤레굴린R& D Systems396-HB/CF
Poly L-lysineSigma-AldrichP2636"PLL" 프로토콜.
Dulbecco의 변형된 Eagle's mediumThermoFisher Scientific11965-092"DMEM" 프로토콜.
Hank의 균형 잡힌 염 용액ThermoFisher Scientific14170-112"HBSS" 프로토콜.
Tryspin-EDTAThermoFisher Scientific15400-054
암컷 피셔 쥐 (160-180g)Envigo
Vannas 가위, 스트레이트FST15018-10
케타민Vedco Inc5098976106100 mg / ml
XylazineLloyd IncAnaSed20 mg / ml
GentamycinAPP 제약NDC 63323-010-02선택할 수있는 모든 브랜드가 될 수 있습니다.
마이크로 주걱FST10089-11어떤 브랜드도 선택할 수 있습니다.
끝이 뭉툭한 곡선 가위FST14017-18원하는 브랜드가 될 수 있습니다.
무딘 집게FST11006-12선택의 모든 브랜드가 될 수 있습니다.
rongeurFST16121-14선택할 수있는 모든 브랜드가 될 수 있습니다.
각진 스프링 가위FST15006-09선택할 수 있는 모든 브랜드가 될 수 있습니다.
흡수 삼각형FST18105-03선택의 모든 브랜드가 될 수 있습니다.
GelfoamHenry Schein9083300프로토콜의 "압축 폼".
#10 블레이드Sklar06-3010원하는 브랜드가 될 수 있습니다.
MatrigelCorning354234프로토콜의 "주사 가능한 매트릭스".
닭 항녹색 형광 단백질 항체MilliporeAB16901
Mouse RT97 hybridoma 항체DSHBRT97
토끼 항 신경 필라멘트 항체Encor Biotechnology, IncPRCA-NF-H
Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein 항체DakoZ033401
Alexa Fluor 488 염소 항 닭 IgG (H + L)ThermoFisher ScientificA-11039
Alexa Fluor 546 염소 안티 토끼 IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-11035
Alexa Fluor 647 염소 안티 토끼 IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-21244
Alexa Fluor 647 염소 안티 마우스 IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-21236
컨포칼 현미경Nikonclsi
소 태아

참고문헌

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