거 대 한 Unilamellar 소포에서 막 나노튜브를 당기

요약

셀에 많은 단백질을 감지 하 고 막 곡률을 유도. 곡선된 막 체 외단백질 또는 어떤 곡률 활성 분자의 상호작용을 연구 하는 지질 소포에서 막 나노튜브를 당겨 하는 방법을 설명 합니다.

초록

세포 막의 재편 endocytosis, 인신 매매, 등 filopodia형성 등 많은 세포 현상의 중요 한 부분입니다. 많은 다른 단백질 그들의 능력을 감지 하거나 유도 막 곡률 때문에 곡선된 멤브레인과 연결 합니다. 일반적으로 이러한 프로세스는 다양 한 단백질 셀에서 양이 많게 공부 하기에 너무 복잡 하 포함 한다. 우리는 endocytic 목 같은 곡선된 세포 구조를 흉내 낸는 곡선된 막에 생체 외에서다시 구성할 프로토콜을 설명 합니다. 거 대 한 unilamellar 소포 (우두머리)는 그의 내부 압력 및 표면 장력 micropipette 포부와 함께 제어 되는 세포 막의 모델로 사용 됩니다. 광학 핀셋을 사용 하 여 우두머리에는 포인트 당기는 힘을 적용 평면 막에 연결 된 높은 곡률의 나노튜브를 만듭니다. 이 방법은 전통적으로 굽 힘 강성 등 지질 막의 기본적인 기계적 특성을 측정 하기 위해 사용 되었습니다. 최근 몇 년 동안, 그것은 단백질 막 곡률 및 그들은 모양과 막의 역학에 영향을 미칠 방법으로 상호 작용 하는 방법을 공부 하 확장 되었습니다. Micromanipulation, microinjection, 광학 핀셋, confocal 현미경 검사 법을 결합 한 시스템 동시에 막 곡률, 막 긴장, 그리고 단백질의 표면 밀도의 측정을 허용 한다. 이 측정에서 단백질 막 시스템의 많은 중요 한 기계 및 형태학 속성 유추 수 있습니다. 또한, 우리 하다 생리 소금 농도 형광 강렬 레이블이 단백질과 지질에서에서 막에 단백질의 표면 밀도 측정 하는 방법의 GUVs를 만드는 프로토콜.

서론

Endocytosis, 인신 매매, filopodia, 감염 등의 형성 등 많은 세포질 과정 세포 막^1,2의 모양에 있는 극적인 변화를 함께 제공 됩니다. 셀에 다양 한 단백질 막에 바인딩 및 그들의 모양을 변경 하 여 이러한 프로세스에 참여 하 고. 가장 주목할 만한 보기는 본질적으로 도메인^3,,45,,67바 곡선 특성을 포함 하는 빈/Amphiphysin/Rvs (바) 단백질 가족의 일원. 일반적으로, 그들은 표면에 그리고, 많은 경우에, 또한 얕게 삽입은 bilayer amphipathic 나선 바 도메인 준수는 막으로 작용. 모양, 크기, 및 amphipathic 나선 수와 함께 바 도메인의 결정: (1) 막 곡률의 방향 (즉, 여부 그들은 invaginations 또는 돌출을 유발 한다), 및 (2) 막의 크기 곡률의⁵

프로토콜

1. Pt-와이어에 Electroformation에 의해 GUVs의 준비

1. Electroformation 챔버 청소 ( 소개 및 그림 1A참조)와 Pt-전선 에탄올 또는 지질을 멀리 세척 하는 아세톤 등 유기 용 매와 물으로 씻어 소금에.
   참고: 우리는 철저 하 게 에탄올-젖은 티슈로 잔류물을 멀리 닦아 다음 아세톤, 에탄올, 각각 5 분 동안 물에서 sonicating 제안.
2. 클로 프롬에 1 mg/mL에서 원하는 지질 구성의 지질 믹스를 준비 합니다. 혼합을 포함 한다 ~ 0.05%는 지질의 어 금 니 분수 biotin과 활용 (예를 들어, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]) 및 ~ fluorophore (0.5%는 지질의 어 금 니 부분 활용 예를 들어, BODIPY-TR-C5-세 라마 이드).
   참고: 우리의 경험에서 그것은 포함 하는 30% 이상 높은 수익률에 GUVs를 생산 하기 어렵다 지질 청구.
   주의: 클로 프롬은 적절 한 장갑을 끼고 화학 후드 안에 처리 되어야 합니다.
3. Elect....

결과

튜브를 당기 실험 멤브레인에 대 한 중요 한 기계적인 정보를 줄 수 있습니다. 단백질 또는 다른 분자를 막 곡률, 막와 커플 하 고 튜브 반경 막 긴장 Canham Helfrich 해밀턴을 적용 하 여 관련 될 수 없을 경우에는 튜브를 방정식 우두머리^{50,51에서 가져온}

(식 1)

어디

토론

하지만, 막의 기본적인 기계적 특성 측정을 의미 하지만 단백질 및 막 간의 결합에 빛을 발산 하는 데 도움이 막 단백질 시스템에 풍부한 정보를 제공 하는 GUVs에서 튜브를 당기기의 방법 곡률입니다. 소개에서 설명 했 듯이, 다른 기술을 서브 미크론 리¹⁹ 세 표면^18,곁에와 단백질을 배양 하거나 관찰 하 여 막 커브 단백질의 효과 측정 하기 위해 존재 합니다 단백질^20,21의 주입 시 micropipette 발음 하는 GUVs에서 tubules의 자발적인 형성. 여기 설명 하는 방법을 endocytosis 기하학적 직결 하며 단백질 밀도, 막 긴장, 막 힘 등 동시에 제공 하는 시스템의 중요 한 실제 측정에서 유일 하다.

방법의 중요 한 제한 사소한를 구성 하 고 분석 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)	Avanti	850375	그림 3의 데이터에 사용된 지질의 예
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]	Avanti	880129	biotinylated lipid
BODIPY-TR-C5-ceramide	Molecular Probes (ThermoFisher)	D7540	형광 지질
BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)	Molecular Probes (ThermoFisher)		단백질 밀도 보정을 위한 형광 지질
Egg L-α-phosphatidylcholine (eggPC)	Avanti	840051	튜브 반경 상수
β-소우유(>99%)의 카제인을	Sigma Aldrich	C6905	마이크로피펫을 부동태화하는 데 사용됩니다. 실험 챔버
: 설탕	시그마 Aldrich	S7903
D (+) 포도	: 시그마 Aldrich	G7021
NaCl	시그마 Aldrich	S7653
트리스	: 시그마 Aldrich	10708976001
삼투압계	: 패자	n / a
Pt-wires, 0.5 mm 직경, 99.99 % 순도	Goodfellow USA		GUV 전기 형성
함수 발생기		PT005139 GUV	전기
퍼티 실란트	Vitrex (CML France)	CRIT 140013	전기 챔버를 밀봉하는 데 사용
초음파 발생기		n / a	전기 챔버를 청소하는 데 유용하지만 중요
하지는 않습니다.Nikon TE2000 도립 현미경, eC1 컨포칼 시스템(Nikon), 두 개의 레이저 라인(λ = 488nm 및 543nm); 5 W 이테르븀 섬유 연속파 레이저에 의해 유도된 광학 핀셋 (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germany)광학
		해당 없음
, 붕규산 모세관(각각 내부 및 외부 반경 0.78mm 및 1mm)	Harvard Apparatus	30-0036
마이크로피펫 풀러,	Sutter Instrument	P-2100
마이크로포지	Narishige	MF-800
압전 액추에이터	Physik Instrumente	n/a
폴리스티렌 스트렙타비딘 코팅 비드(직경 3.2 &마이크로; m)	스페로텍	SVP-30-5