Confocal Neuropeptide Y-pHluorin의 이미징: 그대로 Murine 인간과 독도에 인슐린과 립 Exocytosis를 시각화 하는 기법

요약

우리는 pHluorin, pH에 민감한 녹색 형광 단백질을 사용 하 여 그대로 독도에 인슐린 exocytosis의 시각화를 위한 프로토콜을 설명 합니다. 격리 된 독도 소포 화물 neuropeptide Y에 결합 하는 pHluorin를 인코딩 하는 아 데 노 바이러스와 감염 됩니다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 인슐린과 립 퓨전 이벤트의 검출에 대 한 수 있습니다.

초록

인슐린 분 비 뿐만 질병에서 정상적인 생리 적인 조건 하에서 포도 당 항상성에서 중심 역할을 한다. 전기 생리학 또는 현미경 형광 기자 들의 표현에 결합 하거나 사용 하는 인슐린과 립 exocytosis 공부를 현재 접근. 그러나 이러한 기술의 대부분 클론 세포 라인에 대 한 최적화 되었습니다 또는 췌 장 독도 해리 요구. 대조적으로, 여기에 제시 된 방법 그대로 췌 장 독도에 인슐린과 립 exocytosis의 실시간으로 시각화 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 먼저 인코딩하는 pH에 민감한 녹색 형광 단백질 (GFP), pHluorin, neuropeptide Y (NPY)에 결합 된 아 데 노 바이러스와 격리 된 췌 장 독도의 바이러스 성 감염을 설명 합니다. 둘째, 우리는 confocal 이미징 독도의 5 일 후에 바이러스 성 감염 및 인슐린과 립 분 비를 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 간단히, 감염 된 독도 이미징 챔버에 coverslip에 배치 되며 지속적으로 다양 한 자극을 포함 하는 extracellular 솔루션과 끼얹는다 되 하는 동안 똑바로 레이저 검사 confocal 현미경 아래 몇 군데. 공초점 이미지는 섬의 50 µ m에 걸친 빠른 공명 스캐너를 사용 하 여 시간 경과 녹음으로 획득 됩니다. 시간이 지남에 따라 인슐린과 립 원형질 막으로 융합을 다음 수 있습니다. 이 절차 또한 단일 실험에서 자극의 배터리를 테스트 가능, 마우스와 인간의 독도 이며 기능적인 화상 진 찰 (예를 들어, 막 잠재력 또는 cytosolic 칼슘 염료)에 대 한 다양 한 염료와 결합 될 수 있다.

서론

인슐린은 췌 장의 작은 섬의 베타 세포에 의해 생산 하 고 포도 당 물질 대사¹의 키 레 귤 레이 터 이다. 죽음 또는 베타 세포의 기능 장애 포도 당 항상성을 방해 하 고 당뇨병²리드. 인슐린은 캘리포니아^{2 +}에서 출시 된 코어 조밀한과 립에 포장-종속 방식³. 인슐린과 립 exocytosis 규제 어떻게 elucidating 완벽 하 게 이해 어떤 인슐린 분 비를 결정 하 고 당뇨병의 치료에 대 한 새로운 치료 대상의 식별에 대 한 새로운 경로 열 며 필수적 이다.

인슐린 exocytosis는 광범위 하 게 연구 되었습니다 형광 분자와 함께에서 막 커패시턴스 측정 등 미세한 접근 electrophysiological 접근을 사용 하 여. 막 커패시턴스 측정 좋은 시간적 해상도 있고 단일 셀 레코딩을 허용. 그러나, 커패시턴스에 변경 셀의 net 표면 변화를 반영 고 할 하지 개별 퓨전 이벤트를 캡처 또는 다른 비 인슐린 분 비 소포³에서 인슐린과 립 퓨전을 구별. 형광 프로브 및 소포 화물 단백질와 함께 2 광자 또는 총 내부 반사 형광 (TIRF) ....

프로토콜

마이애미 대학의 동물 윤리 위원회는 모든 실험을 승인 했습니다.

1. 바이러스 성 감염의 그대로 고립 된 인간 또는 마우스 췌 장 독도

1. 섬 문화: 섬 문화 미디어 준비: Connaught 의료 연구 실험실 (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS 및 2 m L-글루타민.
   1. 인간 췌 장 독도 통합 섬 배포 프로그램 (NIDDK, NIH)에서 얻을 수 있습니다. 도착 시 전송는 독도 (~ 500 섬 등가물) 35 m m 비-조직 문화 취급 37 ° C에서 2 mL CMRL 문화 미디어, 바이러스 성 감염 하기 전에 24 시간을 위한 5%/95% CO ₂ /O ₂ 접시.
   2. 마우스 췌 장 독도 이전 설립된 프로토콜 ¹⁶ 다음 격리 될 수 있습니다. 절연, 다음 문화 ~ 200 섬 등가물에 35 m m 비-조직 문화 취급 37 ° C에서 2 mL CMRL 문화 미디어, 바이러스 성 감염 하기 전에 24 시간을 위한 5%/95% CO ₂ /O ₂ 접시.
      참고: NPY pHluorin와 형광 중복을 피하기 위해 독도 GFP 또는 YFP 기자 들과 유전자 변형 ....

결과

기술의 전체 워크플로 그림 1에 표시 됩니다. 간단히, 마우스 또는 인간의 독도 수 NPY pHluorin 인코딩 하는 아 데 노 바이러스에 감염 되며 문화, confocal 현미경 아래에서 몇 일 후 몇 군데. 과 립 원형질 막 및 오픈 퓨즈, 형광 증가 관찰 고 측정할 수 있습니다 (그림 1). NPY pHluorin 실제로 인슐린과 립 역학을 모니터링 하는 데 적합 한 도구 인지 확인, 감염 된 독도 GFP와 다른 섬 호르몬 인슐린, somatostatin 또는 글 루카 곤에 대하여 항 체와 immunostained 했다. 대부분의 세포 표현 NPY-pHluorin (GFP 긍정적인) 베타 세포 했다 그들은 또한 인슐린을 표현 (~ 90%; 그림 2A, 2B). 몇 글 루카 곤.......

토론

이 원고는 confocal 현미경 검사 법에 의해 exocytosis 그대로 췌 장 독도 내 베타 세포에서 인슐린 알갱이의 시각화를 사용할 수 있는 기술을 설명 합니다. 그것은 높은 transfection 효율을 보장 하기에 아 데 노비 루스 복제 형광 기자로 NPY-pHluorin를 사용 합니다.

방법은 우리 손에 고효율, 그것은 주로 두 개의 매개 변수 의존 하는 몇 가지 수정 해야 할 수도 있습니다: 1) 섬 준비, 및 감염 조건 최적화와 바이러스 성 주식의 2) titer의 품질. 독도의 바이러스 감염, 이전 섬 준비를 37 ° c.에 하룻밤 격리 및 수송 스트레스 로부터 복구할 수 있도록 셀 섬 표면 또는 섬 센터¹⁸ 에 hypoxic 세포 (어두운 세포)의 존재에서 튀어나와 등 감소 생존의 흔적에 대 한 확인 하 고 감염/식 기간 내내 가벼운 현미경 섬 형태 검사 . 각 바이러스 성 주식의 titer 및 감염 효율성에서 달라질.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
정립 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	TCS-SP5	포함 LAS AF, 이미지 수집 소프트웨어
이미징 챔버	Warner instruments	RC-26
이미징 챔버 플랫폼	Warner instruments	PH-1
22 x 40 유리 커버 슬립	Daiggerbrand	G15972H
Vacuum 실리콘 그리스	시그마	Z273554-1EA
다중 채널 관류 시스템	워너 인스트루먼트	VC-8
단일 인라인 용액 히터	워너 인스트루먼트	SH-27B
온도 컨트롤러	워너 인스트루먼트	TC-324C
연동 흡입 펌프	Pharmacia	P-1
35mm 페트리 접시, 비조직 배양 처리된	VWR	10861-586
CMRL 매체, 글루타민 없음	ThermoFisher 11530037
FBS, 열 비활성화	ThermoFisher	16140071
L-글루타민 200 mM	ThermoFisher	25030081
5 M NaCl 용액	Sigma	S5150
3 M KCl 용액	Sigma	60135
1 M CaCl2 solution	Sigma	21115
1 M MgCl2 solution	Sigma	M1028
소 혈청 알부민	Sigma	A2153
1 M HEPES 용액	Sigma	H0887
진공 필터	VWR	431098
D-Glucose	Sigma	G8270
폴리-D-라이신 하이드로브로마이드	시그마-알드리치	P6407
Di-8-ANNEP	ThermoFisher	D3167
3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX)	시그마	I5879
포스콜린	시그마	F3917