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방법 논문

Vivo에서경작-Murine 이다 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 AWESAM 프로토콜을 사용 하 여 같은

7.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56092

⸱

2018년 1월 10일

 , 
1Chemical Biology, Chemistry Research Laboratory, University of Oxford, 2Department of Physiology, Anatomy, and Genetics, University of Oxford, 3Trans-synaptic signaling, European Neuroscience Institute

이 논문에서

요약

여기에 설명 된 AWESAM 프로토콜은 빠르고, 단순 하 고 저렴 한 방식으로 다른 뇌 세포 분리에서 murine 이다 경작에 최적입니다. AWESAM 이다 자발적인 캘리포니아2 + 신호, 형태학, 및 유전자 식 프로필 이다에서 vivo에서유사한 전시.

초록

AWESAM (는 low- e유도 stellate는 strocyte method 비용) 프로토콜 수반 vivo에서의 대량을 생성 하는 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 방법-마우스와 쥐 사이토 monocultures 같은 : 뇌 세포는 서로 다른 뇌 영역에서 고립 될 수 있다 고 주 후에 세포 배양의, 비 astrocytic 셀 인큐베이터에 6 h에 대 한 통에 문화 요리를 배치 하 여 떨어져 동요는. 나머지 이다 (불리 NB + H) 사이토 관련 매체와 새로운 접시에 다음 passaged 있습니다. NB + H 혈 청 매체에 대신 사용 되는 헤 파 린 바인딩 EGF 같은 성장 인자 (HBEGF)의 낮은 농도 포함 합니다. NB + H, 성장 후 AWESAM 이다 방사상 형태와 기능은 괜 찮 프로세스 있다. 또한,이 이다 더 많은 비보에있다-같은 보다 이전에 게시 방법으로 생성 하는 이다 유전자 발현. 캘리포니아2 + 영상, 기 역학, 고 막 가까이 다른 이벤트 따라서 벌금 astrocytic 프로세스에서 생체 외에서 예를 들어, 라이브 셀 confocal 또는 TIRF 현미경을 사용 하 여 공부 될 수 있다. 특히, AWESAM 이다 또한 전시 자발적인 캘리포니아2 + 신호 이다에서 vivo에서유사한.

서론

영양 지원, 혈액 흐름, 시 냅 스 신호 및 소성, 및 세포 통신-는 모두 얇은 astrocytic 프로세스 중심 메커니즘을 통해 뇌 기능에 영향을 이다. 여기에 설명 된 AWESAM 프로토콜을 사용 하는 유용한 예를 들어, 많은 단백질 및 심지어 캘리포니아2 + 신호 표현의 다른 뇌 세포에 걸쳐 다른 명과 뉴런에서 간섭 없이 이러한 프로세스의 연구 유형입니다. 또한,이 방법은 이전에 사용할 수 있는 기술의 한계 극복. 특히, 우리의 프로토콜 vivo에서제공-형태학 (방사상 이다 얇은 프로세스) 및 유전자 발현에 빨리, 쉽게, 그리고 저렴 한 방식으로 같은.

셀 형태, 유전자 발현, 그리고 다른 많은 규제 프로세스는 직접 환경에 의해 영향을 받습니다. 문화 접시에이 주변의 세포 뿐만 아니라 세포 재배 되 고 있는 매체에 의해 발표 하는 요소를 말합니다. 이다, HBEGF 방사상 형태로1 을 유도 하기 위해 이전에 보고 하지만 드 이다2를 차별화 하는 또한 발견 했다. 그러나, HBEGF의 낮은 농도 나중 더 vivo에서생성 하는 데 사용 했다-두 개의 서로 다른 프로토콜3,4RNA 시퀀싱을 통해 발견 이다 처럼. 또한, 사이토 형태학 프로토콜4에 중간 구성 변경: HBEGF의 낮은 농도와 Neurobasal 매체는 방사상 이다 (예를 들어, 다른 중간 작곡 하면서 성장을 위한 최적의 혈 청-포함 된 DMEM) (immunopanning에 의해 고립 된 갓 이다)에 다각형 세포를 생산.

AWESAM 프로토콜 사이토 monocultures4성장에 대 한 이전 방법의 단점을 극복 했다. 성장 하는 사이토 monocultures 이전 기술은 다음과 같은 단점이 있습니다: 방사상 이다에 vivo에서 (MD 방법)5;의 특성은 다각형 형태 길이 비용 (유도 만능 줄기 세포는 이다 3 개월을 준비 하며 고가의 성장 인자를 포함 하 여 많은 시 약) 프로토콜의6; 낮은 양의 재료 (immunopanning 방법)3; 이다의 탈 분화와 3D 매트릭스 (Puschmann 외.)의 요구 사항 1 , 2. AWESAM 프로토콜을 제공 하는 반면,: vivo에서-같은 형태 (얇은 프로세스와 방사상 이다); 빠른, 쉽게, 그리고 저렴 한 방법; 대량의 물자; 그리고 vivo에서가장-같은 비해 immunopanned 및 MD 이다 유전자 발현. 또한, 2D 문화 캘리포니아2 + 신호 및 얇은 프로세스, 고 막 가까이 이벤트 재활용 기의 연구에 대 한 수 있습니다 (예를 들어, TIRF 현미경 불가능 3D 문화에서).

MD 메서드는 19805, 다각형 사이토 monocultures는 간단 하 고 빠른 기술 제공에 그것의 간행물부터 광대 하 게 사용 되었습니다. 간단히, MD 메서드 수반 송아지 태아 혈 청 (FCS)에서 성장 혼합된 뇌 세포-(다른 모든 뇌 세포 유형을 분리 접시에서)로 이다에 대 한 풍부 하 고 더 동일한 매체에 문화 단계를 흔들어 뒤 DMEM, 포함 된. DMEM fcs 보충 fibroblasts 및 adipocytes에서 다른 암 세포 선, 모두의 공유 문화에서 MD 이다에 의해 전시 다각형 형태에 이르기까지 많은 다른 세포 유형, 사용 됩니다. 초기 2000 년대7까지 작은 생각 했던 특히 그들의 전형적인 방사상 형태를 선호 하 미디어 이다에 맞게 주어진 에 비보를 발견. 2011 년에 출판 한 프로토콜 같은 방사상 형태를 달성지 않습니다: 혈 청 자유로운 매체 이다3경작을 위해 최적화 된 사용 immunopanning 메서드를 호출. 이 메서드를 사용 하 여 갓 고립 된 뇌 세포는 대상 셀 형식 관련 세포 표면 단백질, 이다에 대 한 풍부 하 게 하는 항 체로 입힌 요리 시리즈에 노출 됩니다. 더는 비보에도 불구 하 고-immunopanned 이다의 형태와 식 프로필, 같은 생체 외에서 연구의 대다수는 여전히 MD 사이토 방법에 의존. MD 메서드는 간단 하 고 빠른, 문화의 첫 번째 날에 더 복잡 하 고 시간이 많이 걸리는 단계를 구성 하는 immunopanning 메서드 (더 이상 효소 소화 기간 등 다른 밀도, 자체, immunopanning 솔루션의 주의 레이어 링 및 여러 원심 분리 단계-모든 도금 하기 전에). 그러나, 보다 전문적인된 매체를 사용 하 여 AWESAM 메서드를 사용 하면 두 속도의 MD 메서드는 vivo에서제공-immunopanning 프로토콜의 형태 처럼.

전반적으로, AWESAM 프로토콜은 더 vivo에서공부 하는 데 유용-2D monocultures (immunostainings, immunoblots, 및 RNA 시퀀싱에 의해 이전 특징된4 )로 신경 및 다른 명과 격리에서 이다 처럼. 그것은 얇은 astrocytic 프로세스의 연구에 대 한 허용 하 고 자연 스러운 캘리포니아2 + 신호 (예를 들어, TIRF 현미경 검사 법에 의해 몇 군데) 막 가까이 이벤트 시각화를 위한 훌륭한 접근을 제공 합니다.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 동물 실험은 독일 동물 복지에 대 한 지침에 따라 수행 했다.

참고: 타임 라인 및 프로토콜의 주요 단계는 그림 1에서 그림.

1입니다. 준비

  1. 다음과 같은 솔루션을 준비 합니다.
    1. DMEM + 다각형 MD 이다 경작에 대 한 준비: DMEM 10 %FCS 100 U 페니실린, 100 µ g/mL 스.
    2. NB + H 방사상 이다 경작에 대 한 준비: 5 ng/mL HBEGF, B-27 보충, 1 x 글루타민 보충, 100 U 페니실린과 100 µ g/mL 스 x 1와 neurobasal 매체.
      참고: HBEGF의 높은 농도의 Aliquots 준비 고 필요할 때마다 중간에 추가 될-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
    3. 절 개 매체 (10 mM HEPES HBSS에)를 준비 합니다.
    4. 0.05% 트립 신-EDTA와 6-7 mL 15 mL 튜브에 0.25% trypsin EDTA의 6-7 mL의 aliquots을 준비 합니다. 이 37 ° C 물 목욕에 해 동 고-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
  2. 프로토콜을 시작 하기 전에 날 코트 0.04 %polyethylenimine (페이) 각의 5 mL와 10 cm 조직 문화 취급 요리.
  3. 다음 날는 페이 제거 하 고 두 번 이온, 증 류 물으로 설거지. DMEM + 12 mL 각 접시에 추가 하 고 미리 셀을 도금 하기 전에 적어도 30 분 동안 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 equilibrate.
  4. 해 부 지역 준비: 층 류 절 개 후드, 장소 2 10 cm 배양 접시 가득 얼음에 해 부 매체. 되도록 각 뇌 영역에 대 한 (예, 피 질, 해 마), 절연 15 튜브 14 mL 절 개 매체와 가득 준비 하 고 얼음에 계속. 70% 에탄올와 후드에 해 부 현미경 옆 해 부 도구 (좋은 위, Dumont #3, #5 집게)를 스프레이.

2. 쥐 또는 마우스 뇌 해 부

참고: 두 쥐 쥐를 사용할 수 있습니다. P8도 사용할 수 있습니다 보다 더 오래 된 동물 (우리는 P12까지 테스트), 하지만 meninges 제거 점점 더 어렵게 될 것입니다. 또한, 셀 생산량 및 건강 것입니다 축소, 이후 복잡 한 프로세스와 연결 조직 분리, 증가 된 세포 죽음으로 이어지는 동안 휴식 수 있습니다 오래 된 동물에서 뇌 세포 형성 됩니다. 대뇌 피 질의 준비 설명, 하지만 다른 뇌 영역을 사용할 수 있습니다.

  1. 37 ° C 물 욕조에 0.05% 트립 신-EDTA를 놓습니다.
  2. CO2 농도 천천히 올려서 (임신 쥐 E19 새끼 또는 P0-P8 동물) 동물을 euthanize 하 고 두뇌를 분리. 다음 단계는 메 마른 기술 필요.
  3. 배아 조직으로 작업 하는 경우 먼저 자 궁에서 태아를 제거 하 고 배아 낭 열고 즉시가 위로 머리를 잘라. 모든 머리는 잘라, 미리 냉각된 해 부 중간에 그들을 전송 합니다.
    1. 일단 머리는 중간에 잠긴, 집게와 소 뇌에서 핀치 피부와 두개골 (둘 다는 매우 부드러운 젊은 동물에서)을 엽니다. 신중 하 게 레버 두개골에서 뇌의 나머지.
      참고: 2 ~ 4 E19 배아 항복 해 부의 날에 접시 당 500000 셀에 도금 하는 대뇌 피 질의 이다의 적어도 8 10 cm 요리에 대 한 충분 한 조직.
  4. 신생아 이상 강아지에 대 한가 위, 머리를 잘라 하 고 두뇌 medially 코 끝에 머리 뒤쪽에서 직선에 피부를 절단 하 여 분리 합니다. 옆으로 그리고 신중 하 게 잘라 두개골 왼쪽 및 오른쪽, 다음 리프트를 두개골 뼈 피부를 당겨. 소 뇌, 떨어져 고 레버는 두개골에서 뇌의 나머지.
    참고: 2 ~ 3 P0-P8 새끼 양보 해 부의 날에 접시 당 500000 셀에 도금 하는 대뇌 피 질의 이다의 적어도 8 10 cm 요리에 대 한 충분 한 조직.
  5. 기본 midbrain 구조에서 피 질을 구분 합니다. 다음 장소는 반구 사이 fissure 내 집게 꼬집어 각 반구 무료 (경도 균열에 수직) 한 반구의 피 질 및 midbrain 구조 사이 집게를 이동 합니다.
  6. 집게를 사용 하 여 모든 meninges 각 반구 (와 그것의 해 마), 다음은 된 분리. Hippocampal 이다 필요한 경우 14 mL 해 부 중간에 얼음으로 가득 15 mL 튜브에 각 마를 이동 합니다.
  7. 제거 더 지역 각 반구의 피 질에서 특정 영역은 필요 (예를 들어, 담당). 잘라 1 m m3보다 더 큰 조각으로 이다 생성 하는 데 사용할 모든 대뇌 피 질의 조직. 해 부 중간에 얼음 가득 별도 15 mL 튜브에 대뇌 피 질의 조직의 모든 조각을 수집 합니다.

3. 조직 소화 및 분리

  1. 모든 조직 조각 수집 되 면 튜브의 하단에 정착 하도록 기다리는 다음 가능한 많은 매체를 발음.
  2. 0.05% 트립 신-EDTA 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 2-3 mL를 추가 하 고 20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 튜브를 품 어.
    참고: 조직 조각을 혼합 하 고 다시 정착 수 있도록 신속 하 게 피 펫에서 모든 트립 신-EDTA를 해제 합니다.
  3. 조심 스럽게 발음 트립 신-EDTA, 가능한 튜브의 하단에 작은 액체도에서 조직 조각을 떠나.
  4. 나머지 트립 신-EDTA 씻어 미리 냉각된 해 부 중간의 5 mL를 추가 합니다. 조직 조각의 혼합 달성 하기 위해 튜브의 상부 쪽으로 플라스틱.
  5. 해 부 중간 발음 하 고 가능한 작은 액체로 조직 조각에 둡니다. 두 번 더 미리 냉각된 해 부 매체와이 세척 단계를 반복 합니다.
  6. 마지막 세척 단계 후 DMEM + (실내 온도를 따뜻하게) 사용 하 여 1000 µ L 피 펫 팁, 및 triturate pipetting으로 조직 고 거품 소개 없이 아래쪽의 1 mL를 추가 합니다.
    참고: 그것은 중요 하다을 생산 하는 거품을 피하기 위해이 솔루션을 이다 아주 민감한 하의 pH를 변경 될 수 있습니다.
  7. 50 mL 튜브의 개통에서 100 µ m 셀 스 트레이너를 놓고 미리 미리 냉각 DMEM + 4.5 mL와 함께 필터를 젖은.
  8. 셀 스 트레이너에 천연된 직물 서 스 펜 션의 1 mL를 플라스틱 및 다른 4.5 mL을 추가 사전 냉각 DMEM + 셀 스 트레이너를 통해 세포를 씻어.

4. 셀 도금 뿌리고 여 사이토 농축에 대 한

  1. 10 µ L 10 µ L trypan 블루와 세포 현 탁 액의 희석 한 hemocytometer에 믹스를 pipetting을 예를 들어, 셀을 계산.
  2. 10 cm 접시 당 12 ml DMEM + 500000 셀 플레이트.
    주: DMEM +는 astrocytic 성장을 위한 도움이 그래서 신경 또는 microglia 보다 더. 떨고, 하는 동안 유리 coverslips 우물 내에 물리적 힘 (coverslips) 없이 10 cm 요리에 그 보다 훨씬 강해 있습니다. 만약 셀 24-잘 접시에 동요는, 그들은 건강에 해로운 될 또는 죽어. 만 떨고 후 24-잘 접시에 이다 격판덮개.
  3. 7 일 동안 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터에서 셀 문화 유지.
  4. 6 일에 동요 하 고 셀을 뿌리고 전날 페이 코팅 배양 배지 단계 5에서에서 설명한 대로 준비 합니다.

5. 뿌리고 셀

  1. 뿌리고, 전날 코트 0.04% 페이와 세포 배양 배지.
    1. Immunocytochemistry, 바이러스 성 변환, 또는 플라스 미드 transfection, 24-잘 또는 6 잘 플레이트 (각 포함 하는 멸 균된 12 m m 또는 25 m m 유리 coverslip, 각각)를 사용 합니다.
    2. 적어도 1 시간에 70% 에탄올에 외피에 의해 유리 coverslips 소독 다음 우물에 있는 coverslips를 배치 하기 전에 세 번 이온 증류수에 세척.
    3. 적어도 70 µ L 24-잘 접시에 12 m m coverslip 당 0.04% 페이 6 잘 플레이트에 25mm coverslip 당 600 µ L 0.04% 페이 추가 합니다.
    4. 서쪽 오 점 또는 RNA-Seq 분석, 10 cm 요리 이미 해 부 후 셀을 포함 하는 사용할 수 계속할 수 있습니다. 요리만 흔들릴 수 필요가 다음 셀 1 x PBS로 세척 및 NB + H로 치료 (새로운 요리를 전송 하지 않습니다).
  2. 하루에 생체 외에서 (DIV) 7 해 부 후에 셀 10 cm 요리 DMEM + 인큐베이터에서 실험실 셰이 커에 놓고 흔들어 6 h 110 rpm에서 요리 합니다.
  3. 이온, 증 류 물으로 코팅된 coverslips에서 페이 두 번 씻어. 번호판 (잘 24-잘 접시와 6 잘 플레이트 잘 당 2 mL 당 500 µ L) NB + H 매체를 추가 합니다. 전 37 ° C, 5% CO2 10 cm 요리 떨고 있다, 동안에 또는 적어도 30 분 동안 인큐베이터에 접시 equilibrate.
  4. 6 h 떨고의 끝 전에 20-30 분 전 1 x PBS, DMEM +, NB + H, 및 0.25 %trypsin-EDTA 물 목욕에서 37 ° C에 따뜻한.
  5. 떨고, 6 h 문화 요리 흔드는 고 즉시 10 mL (흥분 상태에서 뉴런, oligodendrocytes, 및 microglia를 포함) 하는 매체 대체 후 미리 접시 당 1 x PBS를 따뜻하게 합니다.
    참고: 그것은 즉시 다시 연결 비 astrocytic 셀을 피하기 위해 분리 된 셀을 포함 오래 된 매체를 발음 하는 것이 중요입니다.
  6. PBS를 제거 하 고 접시 당 3 mL 미리 따뜻하게 트립 신-EDTA를 추가. 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 4 분에 대 한 각 접시를 품 어.
    참고: 서쪽 오 점 또는 RNA-Seq에 대 한 샘플을 준비 하는 경우에 트립 신-EDTA 추가 하지 마십시오. 대신, 12 mL PBS 바꿀 미리 NB + H, 이후 문화 인큐베이터에 다시 배치할 수 따뜻하게 합니다.
  7. 미리 따뜻하게 DMEM + 각 3 mL 트립 신-EDTA를 접시, 플라스틱 접시 5 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여에서 셀 고 수집 50 mL 튜브에 세포 현 탁 액 5 mL를 추가 합니다.
    참고: 피 펫-접시의 아래쪽에서 직접 접시의 바닥 해야 될 셀 분리로 명확 하 게. (대신 DMEM +), 매체를 포함 하는 혈 청 혈 청은 트립 신으로 사용 합니다.
  8. 4 분 동안 20 ° C에서 3,220 x g에 세포 현 탁 액 원심
  9. 상쾌한을 제거 하 고 resuspend 셀 펠 릿 1 mL에는 NB + H에 미리 예 열.

6. 셀 도금 최종 사이토 문화에 대 한

  1. 셀을 계산 합니다.
  2. (잘 당 2 mL NB + H 매체)에 6-잘 접시에 잘 당 20000 셀 이나 잘 (잘 당 500 µ L NB + H 매체)에 24-잘 접시 당 5000 셀 접시.
  3. 추가 처리 또는 분석까지 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터에서 셀 문화 유지.
  4. 일주일에 한 번 반 매체를 교환 합니다.
    참고: 낮은 영양소 환경에서 이다 확산 중지 하지만 (비록 우리의 경험에 아무 microglia AWESAM 문화에 나타난) 모든 나머지 microglia 확산 것입니다. 일단 주 어떤 잠재적으로 나머지 microglia8의 농축을 방지 하 고는 monocultures 적어도 3 주 동안 건강 유지 절반 매체를 교환.

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결과

신경을 가진 공동 경작 하 고 NB + 매체에 성장 이다 문화 (그림 2)의 2 주 후 방사상 나타납니다. NB + 매체, 이외에 공동 경작된 이다 또한 아마 그들의 생존 및 형태학에 기여 하는 알 수 없는 신경 파생 된 요소에 노출 됩니다. 반면, 메릴랜드 이다 (후에 통과 하기 전에 다른 세포 유형 푸는) monocultures로 DMEM + 성장 다각형 2 주 후에 나타납니다. NB + H에서 떨고, 후 성장 하는 AWESAM 이다 문화의 2 주 후 많은 정밀한 프로세스와 방사상 나타납니다.

우리는 이전 AWESAM 이다 RNA 식 프로 파일은 이다에서 vivo에서 MD와 immunopanned 이다4에 비해의 가까이 보였다. 사이토 특정 단백질 ...

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토론

프로토콜 내에서 4 단계는 중요: 1)를 준비 하 고 정확 하 게 5 ng/ml, HBEGF 농도 때문에 농도 있는 작은 증가 미 숙 문화, 예를 들어, 발생할 수 있습니다 10 ng/mL HBEGF 드 차별화 이다4; 조직 또는 pH를 변경 하 고 사이토 건강;을 방해 수 있는 셀을 포함 하는 솔루션 2) 피 거품 3) 전 평형 미디어 최적 pH 및 온도 성장 하는 건강 한 이다; (비록 아무 microglia AWESAM 문화에서 지금까지 발견 된) 4) 교환만 절반 매체 일주일에 한 번 모든 나머지 microglia 충분 한 양분이 존재 하 고 매체에 가능성이 있기 때문에8 정기적으로 교환. 이 마지막 포인트, astrocytic, 차별화, 생존과 확산을 지원할 수 있습니다 그들은 그 문화 내에서 사이토 파생 요소 하지 완전히 제거 해야 참고 중요 하다.

성숙한 사이토 소스...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 유럽 연구 위원회 (FP7/260916), 알렉산더 폰 훔볼트-재단 (Sofja Kovalevskaja), 그리고 도이치 가운데 (DE1951 및 SFB889)에서 자금을 인정 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.05 % 트립신 -EDTAGibco2530005437 º에서 따뜻하게; C 사용 전 수조
0.25 % 트립신 -EDTAGibco25200-05637 º에서 따뜻하게; C 사용 전 수조
B-27 보충제Gibco17504-04450X 주식
GlutamaxGibco35050-061100X 재고
페니실린 / 스트렙토마이신Gibco15070-06350 주식; 페니실린: 5000 U/ml; 스트렙토마이신: 5000 &마이크로; g/ml
L-글루타민이 없는Gibco
DMEMGibco
HBEGF시그마4643
HEPESGibco15630080
HBSSGibco14170112
FCSGibco10437028
PBSGibco10010049
1X 100 &뮤; m 나일론 셀 여과기BD352360
Trypan 블루시그마T8154 
세포 배양 인큐베이터Thermo Fisher ScientificHera Cell 240i 세포 배양 인큐베이터
실험실 쉐이커HeidolphRotamax 120 세포 배양 인큐베이터 내부 사용
원심분리기Eppendorf5810 R 
21103049 41966029

참고문헌

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