Vivo에서경작-Murine 이다 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 AWESAM 프로토콜을 사용 하 여 같은

요약

여기에 설명 된 AWESAM 프로토콜은 빠르고, 단순 하 고 저렴 한 방식으로 다른 뇌 세포 분리에서 murine 이다 경작에 최적입니다. AWESAM 이다 자발적인 캘리포니아^{2 +} 신호, 형태학, 및 유전자 식 프로필 이다에서 vivo에서유사한 전시.

초록

AWESAM (는 low- e유도 stellate는 strocyte method 비용) 프로토콜 수반 vivo에서의 대량을 생성 하는 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 방법-마우스와 쥐 사이토 monocultures 같은 : 뇌 세포는 서로 다른 뇌 영역에서 고립 될 수 있다 고 주 후에 세포 배양의, 비 astrocytic 셀 인큐베이터에 6 h에 대 한 통에 문화 요리를 배치 하 여 떨어져 동요는. 나머지 이다 (불리 NB + H) 사이토 관련 매체와 새로운 접시에 다음 passaged 있습니다. NB + H 혈 청 매체에 대신 사용 되는 헤 파 린 바인딩 EGF 같은 성장 인자 (HBEGF)의 낮은 농도 포함 합니다. NB + H, 성장 후 AWESAM 이다 방사상 형태와 기능은 괜 찮 프로세스 있다. 또한,이 이다 더 많은 비보에있다-같은 보다 이전에 게시 방법으로 생성 하는 이다 유전자 발현. 캘리포니아^{2 +} 영상, 기 역학, 고 막 가까이 다른 이벤트 따라서 벌금 astrocytic 프로세스에서 생체 외에서 예를 들어, 라이브 셀 confocal 또는 TIRF 현미경을 사용 하 여 공부 될 수 있다. 특히, AWESAM 이다 또한 전시 자발적인 캘리포니아^{2 +} 신호 이다에서 vivo에서유사한.

서론

영양 지원, 혈액 흐름, 시 냅 스 신호 및 소성, 및 세포 통신-는 모두 얇은 astrocytic 프로세스 중심 메커니즘을 통해 뇌 기능에 영향을 이다. 여기에 설명 된 AWESAM 프로토콜을 사용 하는 유용한 예를 들어, 많은 단백질 및 심지어 캘리포니아^{2 +} 신호 표현의 다른 뇌 세포에 걸쳐 다른 명과 뉴런에서 간섭 없이 이러한 프로세스의 연구 유형입니다. 또한,이 방법은 이전에 사용할 수 있는 기술의 한계 극복. 특히, 우리의 프로토콜 vivo에서제공-형태학 (방사상 이다 얇은 프로세스) 및 유전자 발현에 빨리, 쉽게, 그리고 저렴 한 방식으로 같은.

셀 형태, 유전자 발현, 그리고 다른 많은 규제 프로세스는 직접 환경에 의해 영향을 받습니다. 문화 접시에이 주변의 세포 뿐만 아니라 세포 재배 되 고 있는 매체에 의해 발표 하는 요소를 말합니다. 이다, HBEGF 방사상 형태로¹ 을 유도 하기 위해 이전에 보고 하지만 드 이다²를 차별화 하는 또한 발견 했다. 그러나, HBEGF의 낮은 농도 나중 더 vivo에서생성 하는 데 사용 했다-두 개의 서로 다른 프로토콜

프로토콜

여기에 설명 된 모든 동물 실험은 독일 동물 복지에 대 한 지침에 따라 수행 했다.

참고: 타임 라인 및 프로토콜의 주요 단계는 그림 1에서 그림.

1입니다. 준비

1. 다음과 같은 솔루션을 준비 합니다.
   1. DMEM + 다각형 MD 이다 경작에 대 한 준비: DMEM 10 %FCS 100 U 페니실린, 100 µ g/mL 스.
   2. NB + H 방사상 이다 경작에 대 한 준비: 5 ng/mL HBEGF, B-27 보충, 1 x 글루타민 보충, 100 U 페니실린과 100 µ g/mL 스 x 1와 neurobasal 매체.
      참고: HBEGF의 높은 농도의 Aliquots 준비 고 필요할 때마다 중간에 추가 될-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
   3. 절 개 매체 (10 mM HEPES HBSS에)를 준비 합니다.
   4. 0.05% 트립 신-EDTA와 6-7 mL 15 mL 튜브에 0.25% trypsin EDTA의 6-7 mL의 aliquots을 준비 합니다. 이 37 ° C 물 목욕에 해 동 고-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다....

결과

신경을 가진 공동 경작 하 고 NB + 매체에 성장 이다 문화 (그림 2)의 2 주 후 방사상 나타납니다. NB + 매체, 이외에 공동 경작된 이다 또한 아마 그들의 생존 및 형태학에 기여 하는 알 수 없는 신경 파생 된 요소에 노출 됩니다. 반면, 메릴랜드 이다 (후에 통과 하기 전에 다른 세포 유형 푸는) monocultures로 DMEM + 성장 다각형 2 주 후에 나타납니다. NB + H에서 떨고, 후 성장 하는 AWESAM 이다 문화의 2 주 후 많은 정밀한 프로세스와 방사상 나타납니다.

우리는 이전 AWESAM 이다 RNA 식 프로 파일은 이다에서 vivo에서 MD와 immunopanned 이다⁴에 비해의 가까이 보였다. 사이토 특정 단백질 .......

토론

프로토콜 내에서 4 단계는 중요: 1)를 준비 하 고 정확 하 게 5 ng/ml, HBEGF 농도 때문에 농도 있는 작은 증가 미 숙 문화, 예를 들어, 발생할 수 있습니다 10 ng/mL HBEGF 드 차별화 이다⁴; 조직 또는 pH를 변경 하 고 사이토 건강;을 방해 수 있는 셀을 포함 하는 솔루션 2) 피 거품 3) 전 평형 미디어 최적 pH 및 온도 성장 하는 건강 한 이다; (비록 아무 microglia AWESAM 문화에서 지금까지 발견 된) 4) 교환만 절반 매체 일주일에 한 번 모든 나머지 microglia 충분 한 양분이 존재 하 고 매체에 가능성이 있기 때문에⁸ 정기적으로 교환. 이 마지막 포인트, astrocytic, 차별화, 생존과 확산을 지원할 수 있습니다 그들은 그 문화 내에서 사이토 파생 요소 하지 완전히 제거 해야 참고 중요 하다.

성숙한 사이토 소스.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.05 % 트립신 -EDTA	Gibco	25300054	37 º에서 따뜻하게; C 사용 전 수조
0.25 % 트립신 -EDTA	Gibco	25200-056	37 º에서 따뜻하게; C 사용 전 수조
B-27 보충제	Gibco	17504-044	50X 주식
Glutamax	Gibco	35050-061	100X 재고
페니실린 / 스트렙토마이신	Gibco	15070-063	50 주식; 페니실린: 5000 U/ml; 스트렙토마이신: 5000 &마이크로; g/ml
	L-글루타민이 없는		Gibco
DMEM	Gibco
HBEGF	시그마	4643
HEPES	Gibco	15630080
HBSS	Gibco	14170112
FCS	Gibco	10437028
PBS	Gibco	10010049
1X 100 &뮤; m 나일론 셀 여과기	BD	352360
Trypan 블루	시그마	T8154
세포 배양 인큐베이터	Thermo Fisher Scientific	Hera Cell 240i 세포 배양 인큐베이터
실험실 쉐이커	Heidolph	Rotamax 120	세포 배양 인큐베이터 내부 사용
원심분리기	Eppendorf	5810 R

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