환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

Summary

이 프로토콜의 목표 3 차원 섬유 소 매트릭스 내에서 셀 마이그레이션에 프로 및 안티 migratory 요인의 효과 평가 하는 것입니다.

Abstract

현재, 대부분 체 외에서 모델의 상처 치유, 잘 설립 스크래치 분석 실험 등, 공부 하는 2 차원 표면에 셀 마이그레이션 및 상처 폐쇄를 포함. 그러나,는 vivo에서 상처 치유 장소에에서 생리 적인 환경을 3 차원 보다는 2 차원 이다. 그것은 셀 동작에 크게 차이가 점점 더 분명 되 고 2 차원 3 차원 환경; 대 따라서, 더 순수 관련 생체 외에서 상처 폐쇄에 셀 마이그레이션 동작을 공부에 대 한 모델에 대 한 필요가 있다. 여기 설명 하는 방법을 더 나은 이전 설립된 2 차원 스크래치 분석 실험 보다 생리 상태를 반영 하는 3 차원 모델에서 셀 이동의 연구에 대 한 수 있습니다. 이 모델의 목적은 셀 프로 또는 안티 migratory 요인 존재 섬유 소 매트릭스 내에 포함 된 회전 타원 체 몸에서 셀 이동의 시험을 통해 결과 평가 하는 것입니다. 이 메서드를 사용 하 여 3 차원 매트릭스에서 회전 타원 체 몸에서 세포 파생물 관찰 될 수 있다 고 명시 야 현미경 검사 법 및 회전 타원 체 본문 영역의 분석을 통해 시간이 지남에 쉽게 정량은. 셀 마이그레이션에 프로 철새 및 억제 요인의 효과 또한이 시스템에 평가할 수 있습니다. 연구원 관련 3 차원 상처 행렬에서 체 외에서세포 마이그레이션 분석의 간단한 방법을 제공 합니다, 그리고 에 체 외 의 관련성 증가 셀 학문 vivo에서 동물의 사용 하기 전에 모델입니다.

Introduction

상처 치유 하는 것은 부상 다음 조직의 무결성의 복원에 결과 복잡 한 과정 이다. 이 과정은 깨진 hemostasis, 염증, 확산 및 개장 하 고, 포함 하는 4 개의 겹치는 단계로 각 통제 되는 수용 성 신호, 세포-매트릭스 상호 작용 및 세포 세포 커뮤니케이션의 복잡 한 조합에 의해. ^{1 , 2} 이러한 단서의 오케스트레이션 다양 한 상처 치유를 포함 하 여, 중요 한 것은, 셀 마이그레이션에 세포질 응답을 제어 합니다. ^{3 , 4} 셀 이동 셀룰러 고기 그리고 기질 환경 생화학 및 생물 속성에 매우 역동적인 과정 이다. ⁵ 셀 지속적으로 integrin 중재 경로;를 통해 그들의 기질 환경 조사 이 과정에는 다양 한 지형, 감 금, 강성, 등 행렬 속성을 셀 수 있습니다. 2 차원 (2D) 분석 세포 이동의 마이그레이션 lamellipodia 형성 걸 필 라 멘 트 번들의 세대를 통해 첨단에 의해 구동 됩니다 하는 방법을 보여 줍니다. 후행 가장자리에 수축과 수축 구동 actomyosin 함께에서 첨단에 초점 유착의 후속 대형 셀 앞으로 드라이브. ^{그러나 6} three-dimensional (3D) 셀룰러 이동은 현재 잘 이해 하지,, 최근 연구 결과 3D 마이그레이션이 보다 뚜렷이 보여는 afore 2d에서 메커니즘을 설명 하 고 가능성이 그렇지 메커니즘에 의해 구동 됩니다. 예를 들어, 피치 외최근 연구. 시연, ECM의 속성에 따라 셀 3D 행렬에 lamellipodium 및 lobopodium 마이그레이션 메커니즘을 구동 간에 전환할 수 있습니다. ⁷ 셀 마이그레이션 응답을 치유 하는 상처의 중요 한 구성 요소 이므로 세포 이동의 3D 모델이 상처 치유 하는 동안 다양 한 자극에 생리 적인 응답을 이해 합니다. 상처 치유 과정, 잘 설립 스크래치 분석 결과 포함 하 여 동안 셀 이동의 최신 체 외에 모델 2D 활용 3D 매트릭스에서 마이그레이션에서 크게 다를 2D 표면에 셀 철새 동작 표시 되었습니다, 비록 단층 문화입니다. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14} 더 최근 개발 분석 3 차원 매트릭스를 활용 하지만 여전히 따라서 진정으로 셀 환경 세를 정리 하는 능력을 제한 하는 매트릭스, 위에 단층 셀 문화 vivo에서. ¹⁵

여기에 설명 된 방법의 목적은 셀 마이그레이션 2D 표면이 아니라 순수 관련 3D 모델에 적용 된 자극과 관련 된 마이그레이션 응답의 더 강력한 이해를 얻기 위해 공부 하. 이 메서드는 셀 이동 활성화 하거나 연관 셀 마이그레이션 경로 억제 하는 요인의 3 차원 섬유 소 응고 매트릭스 내에서 평가 대 한 수 있습니다. 섬유 소 매트릭스 상처 치유;의 초기 단계에서 중요 한 역할 섬유 소 놀이 때문이 방법에 대 한 선정 다음 상해, 섬유 소 혈전 혈액 손실이 줄기 상처 환경에서 형성 되 고 조직 복구 및 리 모델링 하는 동안 초기 세포 침투에 대 한 비 계 역할. ^{2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} 또한, 섬유 소 임상 수술 실 란 트로 사용 하 고는 밀봉의 구성 세포 마이그레이션 및 궁극적인 결과 치유에 연결 되었습니다. 콕스 외이전 연구. 다양 한 섬유 소 및 섬유 소 실 란 트를 최적화 하기 위해 트 롬 빈 농도의 구성 하는 섬유 소 혈전과 섬유 마이그레이션을 조사. 이러한 연구에서 플라스틱 접시에 섬유 소 혈전에서 셀의 정량 했다. ²⁰ 여기 선물이 셀 3D 섬유 소 환경 내에서 이동의 정량화를 허용 하는 방법. 특히이 프로토콜에서 설명 하는 방법을 섬유 소를 사용 하는 동안이 모델은 원하는 대로, 교원 질 또는 다른 3D 매트릭스 같은 대안 매트릭스 재료를 사용 하 여 쉽게 수정할 수 있습니다. 또한, 선물이 구와 spheroids 사용 하 여가 분석이 결과에서 상처 침대로 구와 마이그레이션 기질 합성 및 조직 복구/리 모델링을 파라마운트 중요성 때문에. 그러나, 복구 하는 동안 프로세스 neutrophils 상처 침대, 대 식 세포에 의해 다음에 마이그레이션할 첫 번째 셀 유형입니다. 섬유 아 세포는 다음 상처 치유 과정의 증식 단계 시작 되는 시점에서 초기 부상 후 약 48 시간 상처 환경에 침투 하기 시작 합니다. ¹⁹ 이 분석 결과 수 있을 쉽게 포함 하도록 수정 호 중구, 대 식 세포, 또는 다른 세포 유형 섬유 소 혈전 구조 변경 이러한 세포 유형의 마이그레이션에 미치는 영향을 평가 하기 위해. ²¹

이 분석 결과 구현 하려면 먼저, 섬유 회전 타원 체 형성 된다 줄기 세포 배양에 대 한 이전 설명의 수정을 사용 하 여. ²² 섬유 회전 타원 체 이후 3D 섬유 소 매트릭스로 전송 되 고 파생물 수 다음 쉽게 모니터링 하 고 몇 일 동안 계량. 이 프로토콜은 계정에 생리 적 시스템의 3 차원 섬유 소 매트릭스 내에서 3D 셀 spheroids를 포함 하 여 따라서 세포 단층 모델 철새 행동을 함께 사용 하 여 2D 성장 표면에 의해 초래 하는 관련성에 한계를 피하, 동안 아직도 매우 제어 체 외에서 환경에서 셀 동작의 평가 대 한 허용.

Protocol

1. 1 일: 셀 및 시 약 준비

참고: 모든 셀 및 시 약 준비 생물 안전 캐비닛 샘플의 오염을 방지 하기 위해 수행 되어야 합니다.

1. 따뜻한 필터링 Dulbecco ' s 수정이 글 ' s 매체 (DMEM), 소 태아 혈 청 (FBS), L-글루타민, 고 37 ° C 물 욕조에 페니실린/스.
2. 보완 하 여 준비 신생아 인간 피부 섬유 아 세포 (HDFn) 미디어와 10 %FBS, 1% 페니실린/스, 1 %DMEM 따뜻하게 L-글루타민.
3. 녹여 냉동 HDFns 및 x 200g에 8 분 분리기 cryopreservation 매체를 제거 하는 유리병. 준비 HDFn 미디어 T-75 문화 플라스 크에 1 x 10 ⁶ 셀/mL과 씨앗의 밀도에 셀 resuspend.
4. 장소 플라스 크 (37 ° C, 5% CO ₂) 세포 증식을 허용 하는 인큐베이터에서.
5. 저장소 HDFn 미디어 4 ° c.
6. 필요에 따라 프로 및 안티 migratory 시 약 준비.

2. 주 3: 회전 타원 체 준비

1. 다음 샘플의 오염을 방지 하기 위해 문화 후드에서 수행.
2. 셀 도달 80 %confluency 미디어를 발음 하 고 0.25%의 5 mL을 추가 트립 신-EDTA. 완전 세포를 플라스 크 표면에서 분리 하려면 5 분 동안 37 ° C 배양 기에서 저장소 술병.
3. 중화는 트립 신을 플라스 크를 따뜻하게 미디어의 5 mL을 추가.
4. Microcentrifuge 튜브 믹스 Trypan 파랑의 10 μ와 세포 현 탁 액의 10 μ.
5. 200 x g.에서 8 분에 대 한 원래의 세포 현 탁 액 분리기
6. 세포 현 탁 액은 centrifuged 되 고, 하는 동안는 hemocytometer를 Trypan 블루 셀 서 스 펜 션의 10 μ를 추가 하 고 셀 수 수행.
7. 원심 분리, 다음 셀 펠 릿을 dislodging 없는 미디어 발음. 1.25 x 10 ⁵ 셀/mL의 농도에서 세포 펠 릿 resuspend.
8. 10 cm 배양 접시 회전 타원 체 성장 하는 동안 수산화 유지 하기의 밑에 버퍼링 하는 멸 균 인산 염 (PBS)의 5 mL을 추가.
9. 반전 페 트리 접시의 뚜껑. Petri 접시 뚜껑의 안쪽 표면에 세포 현 탁 액의 몇 20 μ 방울을 추가.
10. 빨리 뚜껑을 다시 반전 하 고 다시 제자리에 걸려 방울을 꺼내 려 하지 않도록 주의 되 고, 접시의 바닥. 그림 1에서는 성공적으로 형성 된 거 방울.
11. 신중 하 게 37 ° C 배양 기에서 접시를 놓고 고 교수형에 성장 spheroids 72 h.의 기간에 대 한 문화를 드롭

3. 제 6 일: 3D 매트릭스로 Spheroids 포함

1. 다음 샘플의 오염을 방지 하기 위해 문화 후드에서 수행.
2. 응고 솔루션으로 많은 우물 잘 당 100 μ를 추가할 충분 한 양의 응고 솔루션을 생성 하는 첫번째 섬유 소 층의 형성에 대 한 (우물 당 1 회전 타원 체) 필요 합니다. 혈전 10 X HEPES 버퍼는 10%의 볼륨 (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50mm CaCl ₂, pH 7.4), 2 mg/mL 인간의 fibrinogen, 및 0.1 U/mL 인간의 알파 트 롬 빈에 의해 구성 되어 있습니다. 응고 볼륨의 나머지는 초순 구성.
   1. 추가 트 롬 빈 마지막 하 고 신속 하 게 솔루션을 추가 48-잘 접시에 원하는 우물 우물에 추가 되 고 이전 polymerizing에서 혈전을 방지 하기 위해.
3. 부드럽게 흔들어/탭 섬유 소 혈전 혼합물 전체를 잘, 코팅은 되도록 잘 플레이트 그리고 유해를 응고 레이어 수 있도록 1 h에 대 한 보육에 잘 접시 장소. 잘 플레이트 충분히 거품 형성;을 유발 하드 흔들 하지 마십시오 우물의 전체 코팅까지 간단 하 게 필요한 만큼 접시 바위. 더 큰 응고 볼륨 사용 하는 경우이 단계가 필요 하지 않을지도.
4. 섬유 소 레이어 spheroids 전송.
   1. 제거 잘 플레이트와 교수형에 spheroids를 포함 하는 페 트리 접시는 인큐베이터에서 문화를 삭제 하 고 spheroids 현미경 검사. 다음 문화 후드에 접시를 놓고.
   2. 신중 하 게 액세스할 수 있도록 페 트리 접시의 뚜껑을 거꾸로 매달려 놓기 문화.
   3. 신중 하 게 우물의 바닥 코팅 섬유 소 생산 층을 찔린 하지 않도록 주의 복용 각 잘 중심으로 거꾸로 뚜껑에서 한 방울을 전송 1 mL 주사기에 부착 된 21 G 바늘을 사용 하 여. 효과적으로 드롭 전송, 바늘에 드롭 천천히 당겨. 다시 마자 전체 드롭 니 들; 내부 플런저를 당겨 중지 후퇴는 드롭 너무 멀리 공기 방울, 효과적인 회전 타원 체 전송 또는 후속 이미징 중단 될 수 있습니다 발생할 수 있습니다.
   4. Spheroids는 모든 원하는 우물으로 옮겼다 제대로 되도록 현미경 잘 판 검사.
5. 두 번째 섬유 소 층의 형성에 대 한 첫 번째 섬유 소 레이어 (3.2 단계)의 창조에 대 한 위의 같은 준비를 사용 하 여 다른 응고 솔루션을 만듭니다. 신중 하 게 각 포함 하는 회전 타원 체 드롭에 100 μ 플라스틱 및 spheroids는 그대로 하 고 우물의 가장자리에 밀어 안 되도록 다시 현미경 검사.
6. 인큐베이터에 잘 접시를 반환 하 고 두 번째 레이어 1 헤에 대 한 유해를 허용합니다

4. 주 6: 추가 프로 철새 억제 요인

1. 따뜻한 HDFn 미디어 37 ° c.
2. 오염을 방지 하기 위해 후드에서 다음 단계를 수행 하십시오.
3. 미디어 프로/안티 migratory 에이전트를 평가의 적절 한 농도 포함 하 여 각 그룹에 대 한 준비.
4. 인큐베이터와 문화 후드에 장소에서 잘 플레이트 제거.
5. 제어 회전 타원 체 그룹의 각 음을 표준 미디어의 추가 500 μ, 마이그레이션 저해 회전 타원 체 그룹의 각 음을 억제 미디어의 500 μ 및 마이그레이션 향상 된 회전 타원 체 그룹의 각 음에 프로 철새 미디어의 500 μ.
6. 인큐베이터에 잘 접시를 반환.
7. 변경 미디어 모든 48 헤

5. 6-9 일: 평가 셀 이동과 확산

미디어 (0 h)와 24 h에 다음의 추가 직후 72 h. 옵션에 대 한 명시 야 현미경을 사용 하 여

1. 이미지 spheroids: 각 시간 지점에서 경우 확인 하려면 z-스택 이미지 걸릴 마이그레이션 영역 외부에 1 차 초점의 비행기에서 발생 됩니다. 우리의 경험에의 하면이 발생 하지 않습니다; 그러나, 이것은 모든 실험의 경우 되도록 유용 하다.
2. 사용 ImageJ 셀 파생물에 각 잘 각 연속 시간 시점에서 각 회전 타원 체의 셀 테두리를 추적 하 고 사용 하 여 각 회전 타원 체에 대 한 영역에 백분율 증가 분석 하 여 결정 하는 " 측정 " 영역을 구하는 함수.

Results

회전 타원 체 문화 구와 마이그레이션 체 외에 프로 및 안티 철새 에이전트의 효과 평가에 이용 될 수 있다
3D 구와 spheroids 72 h (그림 1)의 기간에 걸려 드롭 문화를 통해 형성 될 수 있습니다. 문화 기간에 따라 spheroids 응고 매트릭스에 포함 하 고 명시 야 현미경 검사 법 (그림 2)를 사용 하 여 몇 군데. Spheroids (흰색 테두리에 묶여 지역으로는 그림에 표시 된)의 초기 영역 ImageJ를 사용 하 여 결정 되었고, 회전 타원 체 시체에서 후속 셀 파생물의 정도 결정 하는 기준점으로 사용. spheroids에 대 한 초기 평균 지역 측정 10⁴ μ m² ± 1.1 x 10⁴ μ m² 에 대 한 제어 spheroi...

Discussion

이 프로토콜에는 상처 치유에 세포 이동의 시험 체 외에 3D 모델을 통해 소프트웨어 관련에 대 한 수 있습니다. 프로시저의 적절 한 실행에 중요 한 단계는 섬유 spheroids;의 적절 한 개발 준비 하는 동안 셀 농도 2500 셀/드롭의 초기 농도 주고 최적화 되었다 72 h의 인큐베이션 기간 동안 안정적으로 양식 spheroids을 허용. 셀의 수가 부족 사용 하는 경우 spheroids 효과적으로 집계 하지 있습니다 하 고 전송 하 고 섬유 소 층에 포함 되 고 시 떨어져 휴식 수 있습니다. 다른 세포 유형 사용 하는 경우 초기 세포 농도 및 회전 타원 체 시간 숙성 일관 되 고 안정 된 회전 타원 체 형성을 얻기 위하여 조정 될 수 있을 수 있습니다. 섬유 아 세포 보다는 더 느리게 증식 하는 세포 유형에 대 한 훨씬 높은 초기 세포 농도 72 시간 시간 범위 내에서 적절 한 회전 타원 체 형성을 보장 하기 위해 필요할 수 있습니다. 셀 교수형에 남아 있지 해야 문화 문화에 spheroids에 미디어를 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L 포도당, w/ 나트륨 Pyruvate, w/out L-글루타민	VWR	VWRL0148-0500	DMEM 이미 L-글루타민을 함유하고 있으며
100mm 조직 배양 접시, 비처리, 멸균, 비발열성	VWR	10861-594	어떤 크기의 접시도 드롭 문화를 걸 수 있습니다
USDA 승인 국가에서 온 태아 소 세럼, 열 비활성화, 멸균 필터링, 세포 배양 테스트 완료	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-글루타민	피셔 사이언티픽	ICN1680149	이미 L-글루타민을 포함하고 있는 DMEM을 사용하는 경우에는 필요하지 않음;
페니실린-스트렙토마이신 용액 안정화, 멸균 필터링, 10,000 단위 페니실린과 10 mg 스트렙토마이신/mL	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
인간 피부 섬유아세포, 신생아	Thermo Fisher	C0045C	관심 세포 유형으로 교체 가능
21 G x 1 1/2' 바늘	BD	305167	22 G x 1 1/2 바늘도 작동합니다
1 mL 주사기	VWR	89174-491	모든 용량의 주사기를 사용할 수 있습니다
. 세포 배양 멀티웰 플레이트, 폴리스티렌, Greiner Bio-One (개별 포장) (48 웰)	VWR	82051-004
Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted	Enzyme Research Laboratories	FIB 3	replaced with matrix protein of interest
Human Alpha Thrombin	Enzyme Research Laboratories	HT 1002a	의 매트릭스 단백질에 따라 필요하지 않을 수
Equipment
BSL2 세포 배양 후드
세포 배양 인큐베이터
10X 대물
15mL 튜브