환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

요약

이 프로토콜의 목표 3 차원 섬유 소 매트릭스 내에서 셀 마이그레이션에 프로 및 안티 migratory 요인의 효과 평가 하는 것입니다.

초록

현재, 대부분 체 외에서 모델의 상처 치유, 잘 설립 스크래치 분석 실험 등, 공부 하는 2 차원 표면에 셀 마이그레이션 및 상처 폐쇄를 포함. 그러나,는 vivo에서 상처 치유 장소에에서 생리 적인 환경을 3 차원 보다는 2 차원 이다. 그것은 셀 동작에 크게 차이가 점점 더 분명 되 고 2 차원 3 차원 환경; 대 따라서, 더 순수 관련 생체 외에서 상처 폐쇄에 셀 마이그레이션 동작을 공부에 대 한 모델에 대 한 필요가 있다. 여기 설명 하는 방법을 더 나은 이전 설립된 2 차원 스크래치 분석 실험 보다 생리 상태를 반영 하는 3 차원 모델에서 셀 이동의 연구에 대 한 수 있습니다. 이 모델의 목적은 셀 프로 또는 안티 migratory 요인 존재 섬유 소 매트릭스 내에 포함 된 회전 타원 체 몸에서 셀 이동의 시험을 통해 결과 평가 하는 것입니다. 이 메서드를 사용 하 여 3 차원 매트릭스에서 회전 타원 체 몸에서 세포 파생물 관찰 될 수 있다 고 명시 야 현미경 검사 법 및 회전 타원 체 본문 영역의 분석을 통해 시간이 지남에 쉽게 정량은. 셀 마이그레이션에 프로 철새 및 억제 요인의 효과 또한이 시스템에 평가할 수 있습니다. 연구원 관련 3 차원 상처 행렬에서 체 외에서세포 마이그레이션 분석의 간단한 방법을 제공 합니다, 그리고 에 체 외 의 관련성 증가 셀 학문 vivo에서 동물의 사용 하기 전에 모델입니다.

서론

상처 치유 하는 것은 부상 다음 조직의 무결성의 복원에 결과 복잡 한 과정 이다. 이 과정은 깨진 hemostasis, 염증, 확산 및 개장 하 고, 포함 하는 4 개의 겹치는 단계로 각 통제 되는 수용 성 신호, 세포-매트릭스 상호 작용 및 세포 세포 커뮤니케이션의 복잡 한 조합에 의해. ^{1 , 2} 이러한 단서의 오케스트레이션 다양 한 상처 치유를 포함 하 여, 중요 한 것은, 셀 마이그레이션에 세포질 응답을 제어 합니다. ^{3 , 4} 셀 이동 셀룰러 고기 그리고 기질 환경 생화학 및 생물 속성에 매우 역동적인 과정 이다. ⁵ 셀 지속적으로 integrin 중재 경로;를 통해 그들의 기질 환경 조사 이 과정에는 다양 한 지형, 감 금, 강성, 등 행렬 속성을 셀 수 있습니다. 2 차원 (2D) 분석 세포 이동의 마이그레이션 lamellipodia 형성 걸 필 라 멘 트 번들의 세대를 통해 첨단에 의해 구동 됩니다 하는 방법을 보여 줍니다. 후행 가장자리에 수축과 수축 구동 actomyosin 함께에서 첨단에 초점 유착의 후속 대형 셀 앞으로 ....

프로토콜

1. 1 일: 셀 및 시 약 준비

참고: 모든 셀 및 시 약 준비 생물 안전 캐비닛 샘플의 오염을 방지 하기 위해 수행 되어야 합니다.

1. 따뜻한 필터링 Dulbecco ' s 수정이 글 ' s 매체 (DMEM), 소 태아 혈 청 (FBS), L-글루타민, 고 37 ° C 물 욕조에 페니실린/스.
2. 보완 하 여 준비 신생아 인간 피부 섬유 아 세포 (HDFn) 미디어와 10 %FBS, 1% 페니실린/스, 1 %DMEM 따뜻하게 L-글루타민.
3. 녹여 냉동 HDFns 및 x 200g에 8 분 분리기 cryopreservation 매체를 제거 하는 유리병. 준비 HDFn 미디어 T-75 문화 플라스 크에 1 x 10 ⁶ 셀/mL과 씨앗의 밀도에 셀 resuspend.
4. 장소 플라스 크 (37 ° C, 5% CO ₂) 세포 증식을 허용 하는 인큐베이터에서.
5. 저장소 HDFn 미디어 4 ° c.
6. 필요에 따라 프로 및 안티 migratory 시 약 준비.

2. 주 3: 회전 타원 체 준비

1. 다음 샘플의 오염을 방지 하기 위....

결과

회전 타원 체 문화 구와 마이그레이션 체 외에 프로 및 안티 철새 에이전트의 효과 평가에 이용 될 수 있다
3D 구와 spheroids 72 h (그림 1)의 기간에 걸려 드롭 문화를 통해 형성 될 수 있습니다. 문화 기간에 따라 spheroids 응고 매트릭스에 포함 하 고 명시 야 현미경 검사 법 (그림 2)를 사용 하 여 몇 군데. Spheroids (흰색 테두리에 묶여 지역으로는 그림에 표시 된)의 초기 영역 ImageJ를 사용 하 여 결정 되었고, 회전 타원 체 시체에서 후속 셀 파생물의 정도 결정 하는 기준점으로 사용. spheroids에 대 한 초기 평균 지역 측정 10⁴ μ m² ± 1.1 x 10⁴ μ m² 에 대 한 제어 spheroi.......

토론

이 프로토콜에는 상처 치유에 세포 이동의 시험 체 외에 3D 모델을 통해 소프트웨어 관련에 대 한 수 있습니다. 프로시저의 적절 한 실행에 중요 한 단계는 섬유 spheroids;의 적절 한 개발 준비 하는 동안 셀 농도 2500 셀/드롭의 초기 농도 주고 최적화 되었다 72 h의 인큐베이션 기간 동안 안정적으로 양식 spheroids을 허용. 셀의 수가 부족 사용 하는 경우 spheroids 효과적으로 집계 하지 있습니다 하 고 전송 하 고 섬유 소 층에 포함 되 고 시 떨어져 휴식 수 있습니다. 다른 세포 유형 사용 하는 경우 초기 세포 농도 및 회전 타원 체 시간 숙성 일관 되 고 안정 된 회전 타원 체 형성을 얻기 위하여 조정 될 수 있을 수 있습니다. 섬유 아 세포 보다는 더 느리게 증식 하는 세포 유형에 대 한 훨씬 높은 초기 세포 농도 72 시간 시간 범위 내에서 적절 한 회전 타원 체 형성을 보장 하기 위해 필요할 수 있습니다. 셀 교수형에 남아 있지 해야 문화 문화에 spheroids에 미디어를 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Materials
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L 포도당, w/ 나트륨 Pyruvate, w/out L-글루타민	VWR	VWRL0148-0500	DMEM 이미 L-글루타민을 함유하고 있으며
100mm 조직 배양 접시, 비처리, 멸균, 비발열성	VWR	10861-594	어떤 크기의 접시도 드롭 문화를 걸 수 있습니다
USDA 승인 국가에서 온 태아 소 세럼, 열 비활성화, 멸균 필터링, 세포 배양 테스트 완료	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-글루타민	피셔 사이언티픽	ICN1680149	이미 L-글루타민을 포함하고 있는 DMEM을 사용하는 경우에는 필요하지 않음;
페니실린-스트렙토마이신 용액 안정화, 멸균 필터링, 10,000 단위 페니실린과 10 mg 스트렙토마이신/mL	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
인간 피부 섬유아세포, 신생아	Thermo Fisher	C0045C	관심 세포 유형으로 교체 가능
21 G x 1 1/2' 바늘	BD	305167	22 G x 1 1/2 바늘도 작동합니다
1 mL 주사기	VWR	89174-491	모든 용량의 주사기를 사용할 수 있습니다
. 세포 배양 멀티웰 플레이트, 폴리스티렌, Greiner Bio-One (개별 포장) (48 웰)	VWR	82051-004
Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted	Enzyme Research Laboratories	FIB 3	replaced with matrix protein of interest
Human Alpha Thrombin	Enzyme Research Laboratories	HT 1002a	의 매트릭스 단백질에 따라 필요하지 않을 수
Equipment
BSL2 세포 배양 후드
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