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방법 논문

주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays 단일 셀에서 단백질을 계산

8.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56110

⸱

2018년 7월 6일

 ,  ,  , 
1Institute of Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기 선물이 주소 드롭릿 microarrays (Adm), 작은 물방울 배열 기반 메서드 단일 셀에 절대 단백질 풍부를 확인할 수 있습니다. Adm의 기능 인간 암 세포 선에서 종양 억제기 단백질 p53의 표현에이 특성을 설명 합니다.

초록

종종 세포 행동 및 세포질 응답 마스킹 복잡 한 인구 내의 풍부한 단일 셀 동작 결과 평균으로 많은 세포의 반응을 함께 풀링된는 인구 수준에서 분석 된다. 단일 셀 단백질 검출 및 정량화 기술 최근 몇 년 동안에 주목할 만한 영향을 만들었습니다. 여기는 주소 드롭릿 microarrays는 실용적이 고 유연한 단일 세포 분석 플랫폼에 설명 합니다. 이 연구는 단일 셀 해상도 대상 단백질의 절대 복사 번호 수 있습니다 측정 하는 방법을 설명 합니다. 종양 억제기 p53 아닌 건강 한 p53 식 패턴을 전시 총 경우의 50% 이상으로 인간의 암에 가장 일반적으로 돌연변이 유전자입니다. 프로토콜을 식에 변화를 정확 하 게 결정을 단일 분자 해상도 10 nL 방울은 단일 인간의 암 세포는 격리 하 고 p53 단백질의 복사본 수를 측정 만드는 단계를 설명 합니다. 에 모든 셀 형식을 기본 자료를 포함 하 여 관심사의 어떤 대상 단백질의 절대 복사본 수를 결정 하는 메서드를 적용할 수 있습니다.

서론

이 방법의 목표는 단일 셀 해상도 세포 인구에서 대상 단백질의 풍부에 있는 변화를 결정 하는. 단일 세포 분석은 전통적인 앙상블 생 화 확 적인 방법으로 사용할 수 없는 혜택을 제공 합니다. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 첫째, 단일 셀 수준 작업 전통 앙상블 생 화 확 적인 기술로 발생 하 셀 인구는 평균에 의해 그렇지 않으면 손실 될 것 이라고 그의 풍부한이 캡처할 수 있습니다. 대부분 작업 말 생 화 확 적인 방법의 사용 대량, 요구, 그들은 종종 할 때, 결과 생산 하는 세포의 수백만. 물론, 전체 세포 인구를 평가의 결과에 따라 다릅니다 여러 가지 요인, 예를 들어 단백질 식 단백질 풍부의 분포의 몇 가지 중요 한 기능을 놓칠 수 있습니다에서. 실용적인 관점에서 단일 셀 기술의 필요한 감도 있도록 생물 소재도 기능에 더 민감한 대량 기술에 대 한 충분 하지 않은 양의 작업 가능. 이것의 핵심 예제 희귀 한 종류의 세포 등 순환 종양 세포 (CTCs) 어디 그릴 10 CTCs 단일 7.5 mL 혈액에 존재 수도 보다도 가난한 전조 outlook 환자에 대 한 연구 이다. 6 여기 우리 항 체 microarray에 인쇄 된 항 체 기반 분석 결과 기름 덮인 방울 고용 감소 볼륨을 사용 하 여 단일 셀 단백질 측정을 수행 하는 데 필요한 방법론을 제시.

미세 물방울 플랫폼은 높은 처리량, 다양 한 생 화 확 적인 분석 실험을 수행 하기 위해 개별 방울에서 두 번째, 및 격리, 그리고 심지어 경작, 단일 셀 수 있는 방울의 수천을 생성할 수 있습니다. 드롭릿 기반 기술을 단일 세포 분석, 크게의 힘에 의해 주 었는 DropSeq10 와 inDrop11를 포함 하 여 주목할 만한 최근의 예제와 함께7,,89 증폭 기술입니다. 제한 된 양의 재료와 단백질에 대 한 증폭의 아무 방법 단일 셀 proteomics 특히 어려운 게.

방울 다양 한 방법으로 분석할 수 있습니다 그리고 형광 현미경 검사 법은 널리 사용 되 고 있다. 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 같은 단일 분자 기술을 형광 분자를를 탁월한 신호 대 잡음 비율을 시각화할 수 있습니다. 12 사라져 필드의 지 수 감퇴 때문만 fluorophores 높은 표면 (100nm의 순서 대로)에 흥분 TIRF에 만드는 복잡 한 혼합물에서 대상 분자의 소량을 검출에 좋은 전략. TIRF의 고유의 광학 단면 강도 또한 세척 단계를 방지 하는 데 도움이 하 고 시험 시간 및 복잡성의 한계. 그러나, TIRF 평면 서피스를 요구 하 고 TIRF 현미경 흐름에 작은 방울에 적용의 예 포함 이미지를 평면 표면 형성. 13 이 단일 셀 proteomic 기술을 종종 디자인 표면 움직일 캡처 에이전트 microarray 형태로 주위 미세 칩. 4 , 14

방울, 평면 표면, 소위 드롭릿 microarrays에 배열에서 형성 될지도 모른다. 15 , 16 , 17 편리 하 게 인덱스, 쉽게 시간이 지남에 모니터링, 개별적으로 다루어야 하 고, 필요한 경우 검색 하면 공간적 배열에 방울을 조직. 드롭릿 microarrays는 독립형 또는 microwell 구조에 의해 지원 되는 칩 당 요소 수천 마이크로 반응 기의 높은 밀도 얻을 수 있습니다. 18 , 19 , 20 그들은 형성 될지도 모른다 액체 처리 로봇, 잉크젯 관측 병, 순차적 증 착에 의해 microarrayers21,22,23,,2425, 문의 26 또는 그들은 superhydrophillic와 같은 표면에 자기 조립 수 명소 superhydrophobic 표면에 무늬. 27 , 28 , 29

염두에 두고 이러한 고려 하 여 지정 드롭릿 Microarrays (Adm) 양적 다양성, 공간적 접근성 및 드롭릿 microarrays의 감소 볼륨을 단일 분자 TIRF 현미경의 감도와 결합 하도록 설계 되었습니다. 단백질 풍부를 측정 합니다. 5 Adm 다음 증발을 방지 하기 위해 기름으로 출장 하는 항 체 microarray에 단일 셀을 포함 하는 작은 물방울 microarray를 형성 하는 단일 세포 분석 가능 작은 물방울의 볼륨은 온 칩 valving 연속 흐름 마이크로에 의해 그렇지 않으면 달성 될 것 이다 샘플 손실을 방지 하기 위해 개별. 30 단일 셀에서 대상 단백질의 절대 크기가 매우 작습니다. 그러나, 작은 물방울의 감소 볼륨 수 있습니다 상대적으로 높은 지역 농도 샌드위치 항 체 분석 결과 사용 하 여 검색-뚜렷한 지역에서 또는 표면에 묶는 단백질을 캡처에 자리 항 체 움직일 수 에 붙일 이라는 탐지 항 체 방울 볼륨에 존재. 레이블 없는 접근 방식으로 (즉 단백질 대상 직접 표시 될 필요가 없습니다), Adm 처리 혈액 등의 기본 소스에서 세포 분석에 일반적으로 적용 되는, 잘 문화에서 셀 뿐만 아니라 aspirates와 해리 종양 생 검 필요 하 고 그들의 lysates입니다.

약물에 응답, 예를 들어에 결정에 중요 하다 단백질 풍부에서 셀 인구 변화 측정 및 세포 기능 및 통로, 평가 부분 모집단에 대 한 통찰력을 제공 하는 데 도움이 됩니다 및 그들의 행동 뿐만 아니라, 그렇지 않으면 대량 방법으로 마스크는 드문 이벤트를 식별. 이 프로토콜 생산 주소 드롭릿 microarrays를 사용 하 여 양적 인간 암 세포에서 전사 인자 p53의 풍부를 결정 하는 방법을 설명 하 고 p53 화학요법 약물에 대 한 응답에서의 역할을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다. 대상 단백질 캡처 및 탐지 항 체의 선택에 의해 결정 되 고 더 또는 다른 목표를 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 기름으로 뒤덮인 10 nL 방울 수동으로 배열 하 일반 실험실 소모품에서 동심 노즐 통합 간단한 장치를 구축 안내 됩니다. 전체 실험 과정은 각 방울 lysed 다음 단일 셀와 단일 분자 해상도 TIRF 현미경을 사용 하 여 결정 하는 단백질의 표현 로드 그것에 의하여 설명 합니다.

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프로토콜

1입니다. 준비

  1. 칩 및 인쇄 항 체 microarrays
    1. 항 체 microarray를 지원 하기 위해 기능성된 coverslip를 접착 실리콘/아크릴 아이 솔 레이 터를 연결 합니다. 이 칩을 이라고 합니다.
      참고: 다양 한 표면 화학 주소 방울과 그들의 적합성에 대 한 테스트 되었습니다. 5 표면 화학 대체 캡처 에이전트 최적화 할 수 있습니다. ADM 절연체 상업적으로 사용할 수 있습니다 또는 레이저 커팅 아크릴에 의해 생성 될 수 있습니다 (CAD 파일 아이 솔 레이 터가이 작품에 사용 되는 다운로드로 제공, 추가 코드 파일을 참조).
    2. microarrayer에 스위치와 습도 75%로 설정.
      참고: 상대 습도 microarray 핀에서 인쇄 솔루션의 증발을 감소 하 고 내 고 남북 spot 변이 감소 시킨다.
    3. Ultrasonication 여 5 분에 대 한 솔루션을 청소 하는 핀에 microarray 핀을 청소 하십시오. 매우 순수한 물 세척 병을 사용 하 여 핀을 헹 구 고 건조 한 질소를 사용 하 여.
      참고:만 담가 핀 끝으로 핀을 일시 중단 합니다. 구멍의 적절 하 게 드릴된 세트와 현미경 슬라이드 핀 홀더를 얻을 수 없는 경우 도움이 됩니다.
    4. 인쇄 버퍼 3 × 염-나트륨 시트르산 (SSC) 버퍼, 1.5 M betaine 0.01% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)와 보완의 구성의 5 mL을 확인 합니다. 4 ° C에서 불명확 하 게 저장 합니다.
    5. 인쇄 솔루션을 준비, 안티-p53 항 체를 녹여 (p53/Mdm2 ELISA 키트, 재료의 표 참조) aliquots-80 ° c.에 저장 된 그것은 1:1 믹스 0.5 mg/mL의 최종 농도에 인쇄 버퍼. 384 잘 플레이트는 micropipette를 사용 하 여 인쇄 솔루션의 5-10 µ L을 로드 하 고는 microarrayer에.
    6. 부하 칩은 microarrayer에 단계 1.1.1에서에서 조립. 관광 명소는 아이 솔 레이 터의 각각의 센터에 의해 정의 된 좌표에 인쇄 microarrayer 프로그램.
      참고: Microarrayers 사용 범위, 주로, 독점 소프트웨어는 사용자가 관련 된 문학을 상담 하는 것이 좋습니다 그래서. Microarray 단계 1.1.1에서에서 동반 CAD 파일에 등장 하는 ADM 아이 솔 레이 터에 필요한 구성 요소의 사각형; 관련 거리 제공 됩니다.
    7. 밀폐 용기에 칩을 저장 하 고 호 일로 포장. 6 주까지 4 ° C에를 저장할.
      참고: 사진-손해를 방지 하기 위해 호 일이입니다. 4 ° C에서 저장 생체 및 microarray 활동을 감소 시키기 위하여 행동 할지도 모른다 어떤 해로운 반응의 저하 속도 제한 합니다. 밀폐 용기에는 칩을을 칩 표면에 형성 하는 결로 없이 사용 하기 전에 실내 온도에 equilibrate 수 있습니다. 연락처 microarray 인쇄 표면 장력 및 인쇄 솔루션 및 관광 명소를 생산 하는 인쇄 기판 사이의 접착을 이용 한다. 사전 인쇄 또는 blotting는 일반적으로 균일 하 게 크기의 관광 명소를 microarray 핀에서 과잉 솔루션을 제거 해야 합니다. 희생 미리 인쇄 coverslip 일괄 품질을 평가 하기 위해 사용할 수 있기 때문에 버리지 마십시오.
  2. 주사기, 준비 주소 방울 분배 배관 및 동심 노즐
    1. (대 한 수성 방울) 100 µ L를 분해 및 1 mL (상한 석유)에 대 한 해밀턴 주사기 유리 부품 증류수 H2o. 린스
    2. 150 µ m의 100 m m 길이 피드 ID/360 µ m OD 융합 1.0 m m ID/1/16의 40 m m 길이 통해 실리 카 튜브 "OD PFA 튜브 2 m m 돌출 될 때까지. 이 동심 노즐을 형성할 것 이다.
    3. 10 µ L 피 펫 팁의 끝에 cyanoacrylate 접착제의 얇은 층을 적용 하 고 1.0 m m ID/1/16의 40 m m 조각으로 삽입 "OD PFA 튜브. 필요한 경우, 접착제 세트 전에 노즐에서 2mm 돌출을 유지 하기 위해 융합 된 실리 카 튜브를 재조 정할.
    4. 용융 실리 카 모 세관의 다른 쪽 끝의 0.014"ID/0.062 200mm 길이의 끝에 삽입" PTFE 튜빙 마약 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (PBSA)이 4% 소 혈 청 배 젖 (BSA) 채워진 해밀턴 주사기 100 µ L를 연결.
      참고: 단백질과 다른 생 화 확 적인 종 표면에 비 특히 묶는 수 고 하거나 수 있습니다 수 손실 변성. BSA는 '차단' 표면 sacrificially 그 표면에 바인딩하여 일반적인 바인딩 최소화 하는 데 사용 됩니다.
    5. 그것은 물개를 형성 될 때까지 200 µ L 피 펫 팁에 1.0 m m ID/2.0 m m OD FEP 튜브의 400 m m 길이 삽입 합니다. 또 다른 200 µ L 피 펫 팁을 cyanoacrylate 접착제의 얇은 층을 적용 하 고이 자리에는 튜브를 해결 하기 위해 첫 번째 팁으로 밀어. 미네랄 오일으로 채워진 해밀턴 주사기 1ml에 1.0 m m ID/2.0 m m OD FEP 튜브의 열린 끝을 연결 합니다.
    6. 동심 노즐의 10 µ L 피 펫 팁에 200 µ L 피 펫 팁 어셈블리를 삽입 합니다. 별도 주사기 펌프에 주사기를 장소 그들은 독립적으로 운영 될 필요가 있을 것 이다.
    7. 4 %PBSA 차단 솔루션으로 100 µ L 주사기를 채우십시오. 다시 연결 하 고 차단 솔루션 '수성' 튜브를 플러시. 총 3 플러시를 두 번 반복 합니다.
    8. 4 %PBSA 다시 연결 튜브에서 0.125 µ g mL-1 탐지 항 체 (안티-p53 항 체 (마-1) 알 렉 사 488로 분류)로 100 µ L 주사기를 채우십시오. 펜스 25 튜브에 차단 솔루션 대체 µ L 탐지 항 체 솔루션.
    9. 모든 튜브와 노즐 기름으로 채우고 때까지 미네랄 오일 '석유' 튜브를 플러시. 미네랄 오일 1 mL 주사기를 리필 하 고 다시 연결 하는 튜브. 튜브와 노즐 어셈블리는 XYZ 조작자를 보안 합니다.
  3. Microinjector 및 micromanipulator 준비
    참고: 아래 단계 microinjector와 micromanipulator 기구 자료 테이블에에서 지정 된 구성 요소에 특정 참조를 확인 하지만 일반적으로 이러한 장치에 적용 되는.
    1. microinjector 압력 관과 모 세관 홀더를 연결 하 여 조립.
    2. 미네랄 오일 완전히 라인을 채우고 때까지 천천히 피스톤 다이얼을 돌립니다.
    3. 번역 헤드 마운트에 모 세관 홀더를 탑재 합니다.
    4. 모 세관 홀더 그립 헤드와 모 세관을 수정 했다.
    5. 4%의 솔루션을 플라스틱 PBSA는 아이 솔 레이 터의 우물 중 하나에.
    6. micromanipulator를 사용 하 여 번역 하십시오 하 고 솔루션으로 모 세관의 끝을 젖어.
    7. 천천히 4 %PBSA 떠나 10 분 동안 차단 하는 모 세관을 채우십시오.
    8. microcapillary을 추출 하 고 어셈블리는 칩의 명확한 번역 모듈을 회전.

2. 양식 주소 방울 및 부하 단일 셀

  1. 양식 주소 방울
    1. 현미경 단계에 칩을 보호 합니다.
      참고: 현미경은 자동된 현미경 단일 분자 TIRF의 장착 거꾸로 형광은 인코딩된 XY 스테이지 및 전자 전 하 결합 소자 카메라 (EM-CCD) 멀티.
    2. 자동된 현미경 제어 소프트웨어를 사용 하 여 배열에 있는 각 명소의 현미경 스테이지 좌표를 기록 합니다.
    3. 현미경 단계에 XYZ 조작자를 설정 합니다. 50-60 °의 각도에서 노즐을 배치 합니다. 노즐에 충분 한 길이 칩 도달 클리어런스 확인 합니다. '수성'과 '기름' 주사기 펌프 10 분배 설정 100 µ L/min과 100 µ L/분, 5 µ L에서 nL 각각.
      참고: 준비, 동안 노즐의 머리에서 수성 해결책 수 있습니다 건조 됩니다.
    4. 액체의 구슬 노즐의 머리에 표시 될 때까지 용액을 분배. 그것을 제거 하는 먼지 무료 지우기와 소량.
      참고: 조사 조건 수에 따라 다양 한 웰 스 셀에 대 한 저수지 역할을 보유 합니다. 단일 셀 라인/형식에 대 한 단일 저수지 충분 합니다.
    5. 자동된 현미경 제어 소프트웨어를 사용 하 여 배열 및 초점에서 항 체 자리에 coverslip 표면에 현미경 스테이지 좌표 설정.
    6. 방해 하지 않도록 주의 자리, XYZ 조작자를 사용 하 여 항 체의 측면에는 동심의 유리 모 세관 끝 및 10 분배 수성 해결책의 nL. 단계를 이동 하지 않고 수성 해결책을 뚜껑에 기름의 5 µ L를 분배 합니다. 천천히 노즐은 물방울의 명확한 올리고 잘 다음 이동.
    7. 배열에 있는 모든 항 체 관광 명소 2.1.6 단계를 반복 합니다.
    8. 30 분 후 각 항 체 세포를 로드 하기 전에 자리에 바인딩된 단일 분자의 배경을 자동된 현미경 제어 소프트웨어를 사용 하 여 배열에 있는 모든 관광 명소 이미지.
  2. 로드 셀 주소 지정이 가능한 방울
    1. 인큐베이터에서 세포 배양 플라스 크를 제거 하 고 트립 신/EDTA 솔루션을 사용 하 여 셀을 분리.
      참고:이 연구 될 인간 결 장 암 세포 라인 그리고 사용 Dulbecco의 수정 이글스 매체 (DMEM) 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) CO2 배양 기에서 보충을 사용 하 여 양식.
    2. 필요한 경우 셀 얼룩 놓여있는지.
      1. 10%에서 0.125 μ g/mL 탐지 항 체 (안티-p53 항 체 (마-1) 알 렉 사 488로 분류)의 솔루션에 셀 resuspend FBS L-15 미디어에서. 단일 세포 현 탁 액을 위해 40 µ m 피치 셀 스 트레이너를 통해 셀 솔루션을 필터링 합니다.
    3. hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수 및 희석 또는 25-400 × 103 셀/mL의 농도에 셀 솔루션을 집중. 그러면 그 셀 앙금 편안 하 게는 microcapillary 조작에 충분 한 간격으로.
    4. 단일 셀 micromanipulator microcapillary를 사용 하 여 셀 저수지에서 주소 지정이 가능한 작은 물방울으로 로드 합니다.
      참고: 비 부착 한 세포는 micropipette에 대량에서 로드할 수 있습니다 및 주소 지정이 가능한 작은 물방울으로 하나 하나를 적절 하 게. 표면 차단 치료에도 불구 하 고 부착 세포는 비 특히 유리 microcapillary 안 벽에 충실 하 여 손실 될 경향이 있습니다.
    5. 10 × 목표를 사용 하 여 관찰 하는 microinjector를 사용 하 여 단일 셀을 셀 저수지에서 microcapillary로 발음.
    6. 전자 조작 단계를 사용 하 여 경우 micromanipulator 무대 좌표를 저장 하거나 수동으로 z 위치를 참고.
    7. 칩의 1 m m 높이를 위쪽으로 그것을 번역 하 여는 micropipette 철회. 조이스틱이 나 전자 조작 무대의 '꺼내기' 기능을 사용 하 여 자동으로 이것을 수동으로 수행 합니다.
    8. 그는 주소 지정이 가능한 작은 물방울의 사용 현미경 제어 소프트웨어 자동 스테이지 좌표를 설정 합니다. ' 주사 '는 micropipette 저장 (또는 언급) z 위치를 반환 하 여. 조이스틱 또는 자동으로이 수동으로 수행 전자 조작 단계를 사용 하는 경우.
      참고: microcapillary는 상한 기름 피어스 되며 주소 지정이 가능한 작은 물방울의 수성 부분 내에서 찾을 수 있습니다.
    9. 분배는 microinjector를 사용 하 여 주소 지정이 가능한 작은 물방울에 셀. 10 nL 주소 지정이 가능한 작은 물방울의 볼륨 1% 미만 증가 합니다.
    10. 어디 주소 방울 셀을 포함 하지 않는 일부 실험 제어에 대 한 무료 두고 나머지 주소 방울에 대 한 2.2.5-2.2.9를 반복 합니다.
      참고: 주소 지정이 가능한 방울 micromanipulator를 microcapillary를 사용 하 여 단일 셀 로드 간단한 대안 농도 10의 순서에 4 %PBSA 포함 세포 항 체 검출의 솔루션으로 단계 1.2.8에서에서 솔루션을 대체 하는 5 셀/mL, 1 셀/10에 해당 nL. 단일 셀 인 Poissonian 되며 셀 농도 최적화 될 필요가 있을 것 이다.
  3. Lyse 세포 및 이미지 배열
    1. 모든 형광 이미지를 포함 하 여 명시 야 현미경을 사용 하 여 작은 물방울에 이미지 셀.
      참고: 영상 ~ 100 방울 자동된 현미경을 사용 하 여 이미지를 약 3 분 걸립니다. 이미지를 수행 60 나 = 1.49 기름 침수 목표. 아니 필터는 명시 이미징 반면 형광 이미징에 사용 되는 표준 필터 집합 필요 합니다.
    2. 단일 분자 TIRF 현미경을 사용 하 여 배열에 있는 모든 관광 명소 이미지.
      참고: 특수 TIRF 2.3.1 단계에서 필터 집합 설정이 사용 됩니다. 이러한 이미지 세포 전 각 항 체 자리에 바인딩된 단일 분자의 배경을 결정 하는 3 절의 이후에 분석 됩니다. 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경을 사용 하 여 단일 분자 이미징 이미지 ~ 100 관광 명소를 약 5 분 걸립니다.
    3. 셀 주소 지정이 가능한 작은 물방울에 초점. 단일 6 초점을 맞춤 으로써 완전 한 광 세포 달성 ns 레이저 펄스 (파장 1064 nm, 펄스 당 펄스 에너지 14.1 ± 0.3 µJ)는 셀의 위치에 가까운.
      참고: 레이저 펄스 확대 공동 현상 거품을 그가 위 셀 설정 하 고 세포 성분 물방울 볼륨으로 줘 라. 4 , 31 레이저 유도 세포로 인해 기계적 프로세스 낮은 펄스 에너지에서 오일-물 인터페이스를 방해 하지 마십시오. 광 세포는 일반적으로 100 세포를 lyse 약 20-30 분 걸립니다. 토론 섹션에서 설명 했 듯이, 광 세포 설치 가능 하지 않은 경우 단일 세포를 lyse 대체 방법 수가 있습니다.
    4. 모든 포함 하는 셀 주소 지정이 가능한 방울 떠나 5 실험 제어에 대 한 무료 주소 방울 취소 lysed 세포를 포함 하는 어디에 대 한 반복 합니다.
    5. 참고는 각 셀이 lysed 시간.
      참고:이 시간 단계 3.1.9에서에서 각 명소에 대 한 개별 바인딩 곡선을 해결 하기 위해 사용 됩니다. 종종 주의 시간 때 첫 번째 및 마지막 셀 lysed는 나머지 가정 세포 이벤트 사이 적절 하 게 일관 된 시간을 추정 하는 충분 하다.
    6. 첫 번째 30 분 후 추가 60 분 마다 20 분 마다 10 분의 모든 관광 명소의 TIRF 현미경을 사용 하 여 단일 분자 이미지를 취득 합니다. 평형에 바인딩된 단백질 양에 관심만 실 온에서 90 분 동안 칩 잠복기 후 모든 관광 명소를 이미지.
      참고: 평형에 도달 하는 시간 방울 볼륨 및 분석 결과에서 사용 하는 항 체의 친 화력에 따라 달라 집니다. TIRF 현미경 레이저 여기 소스를 사용 하 여 수행 됩니다 = 488 nm와 1.5 mW 파워 광 파워 미터를 사용 하 여 다시 조리개에서 측정 되. 단일 분자 이미지 900 수집 시간, 1 MHz 판독 속도에서 16-비트 디지털화를 안에 CCD 카메라에 수집 설정을 설정 하 여 인수 하 고 그들 10 얻을. 아이 솔 레이 터는 coverslip 신중 하 게 제거 하 여 다시 사용할 수 있습니다.

3. 데이터 분석

  1. 단일 분자 (비-정체/디지털 정권)을 계산
    1. 피지 (Matlab), 어떤 혼잡 비 항 체 자리에 대 한 using, 세포 (배경, BKD) 전에 취득 하는 이미지를 로드 합니다.
      참고: 다음 단계에서 작업 straightforwardly 수행 됩니다 피지 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여. 사용자 가이드 다음 링크 https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html에서 찾을 수 있습니다.
    2. 피지에서 BKD 이미지를 선택 합니다. "이미지" 메뉴에서 "중복" 중복 BKD를 선택 합니다. 중복 이미지 선택 및 "과정 > 필터"에서 "가우스 덩어리 죠" 하는 것을 선택 하 고 50 픽셀 반경을 지정.
    3. BKD 이미지 흐리게 BKD 이미지를 생산 하는 BKD_FLAT에 의해 나누어 여기 광원의 효과적인 균일 강도 분포 되도록 BKD 이미지를 평평.
      1. "프로세스" 선택 "이미지 계산기...", 이미지 필요한 작업 "나누기"를 지정 하 고 선택 상자 "만들기 새 창"와 "32-비트 (부동) 결과."
    4. 1 이미지에서 각 픽셀을 뺍니다 ("과정 > 수학", "빼기..."를 선택 하 고 값 1 지정). 평균 픽셀 강도 0 이어야 합니다.
      참고: 병합 필드 하 고 이후 모든 픽셀의 합계 0 이어야 하 고 모든 나머지 오프셋 수 있습니다 더 straightforwardly 보상 평면화 된 배경 이미지를 쉽게 확인할 수 있습니다.
    5. BKD_FLAT 이미지의 4 모서리에 50 픽셀 × 50 픽셀 영역을 선택 합니다. "분석"과 "측정"을 선택 하 여 픽셀 강도 표준 편차 (σ)를 측정 합니다.
      참고: 선택 영역 요약 통계 결과 창에 표시 됩니다. 이 자리에서 배경 결정 단일 분자의 높은 밀도 될 것입니다. 기본 메뉴 선택 도구를 사용 하 여 측정 위치를 수동으로 선택할 수 있습니다 하거나 실행 매크로 코드 "makeRectangle (x, y, 너비, 높이)"; 이 사각형 선택 영역을 만듭니다 어디 x 및 y 좌표 (픽셀)의 왼쪽된 위 모퉁이 인수.
    6. 3σ로 이미지 임계값을 설정 하 고 SM_MASK 이진 이미지를 만듭니다.
      1. "이미지 > 조정" 아래 "임계값..."를 선택 하 고 3σ로 더 낮은 임계값을 설정 합니다.
        참고: 픽셀 임계값 값은 0으로 설정 되 고 임계값을 초과 하는 픽셀을 1로 설정 됩니다. 임계값은 thresholded 픽셀 단일 분자에 속하는 자신감을 결정할 것입니다.
    7. 세그먼트 이미지 SM_MASK, 4-9 픽셀2 의 크기 및 0.5-순환 하는 개체의 0 설정된 픽셀 휘도 값에에서 1 "분석"을 선택 하 여 다음 분석 입자 크기와 원형 지정.
      참고: 픽셀 크기 다른 fluorophores 및 현미경 세트에 대 한 최적화를 할 수 있습니다 ups. 카메라 노이즈 유형 때문 단일 픽셀이이 임계값 이상 있을 수 있으며 단일 분자 되지에 불구 하 고 폐기 하지. 픽셀 크기 기준 올바르게 이러한 픽셀을 삭제 것입니다. 단일 분자는 일반적으로 모양에서 원형. 반면 값이 0에 접근 이면 점점 더 길쭉한 모양을 진원도 값 1 완벽 한 원을 나타냅니다. 나머지 개체는 단일 분자 고 계산 될 수 있습니다. 자리에 자리 를 차별의 영역을 구분 하는 마스크를 설정할 수 있습니다 고 자리에서 프레임 당 계산. 이것은 최신 시간에서 획득 하는 프레임에 대 한 쉽게 이전 프레임에 적용할 수 있는 충분 한 신호 자리에 있을 때.
    8. 같은 비 혼잡 항 체 자리에 대 한 로드 하 고 단계 3.1.1-모든 이미지 프레임 3.1.7 캡처한 시간 해결 시리즈 인수 게시물 세포로 반복 합니다. 2.3.5 단계에 세포의 용 해 시간을 사용 합니다. 모든 바인딩 곡선 수정
  2. 단일 분자 (정체/아날로그 정권)을 계산
    1. 계속 하기 전에 단일 분자의 평균 강도 계산 하려면 단계 3.1.1-3.1.8 반복 합니다.
    2. BKD_FLAT 및 SM_MASK에 의하여 0이 아닌 픽셀 값은 단일 분자와 관련 있는 이미지 생성 이미지를 곱하면 됩니다.
      1. 을 수행 하려면, "프로세스" 메뉴에서 "이미지 계산기...", "곱하기" 운영과 필수, 이미지 지정 선택한 상자 "만들기 새 창"와 "32-비트 (부동) 결과."
    3. "분석" 그리고 "측정";를 선택 하 여 모든 픽셀의 강도 값 합계 선택 항목의 요약 통계 결과 창에 표시 됩니다. 단계 단일 분자 당 평균 강도 계산 하는 3.1.8에 의하여 계산된 단일 분자의 수로 나눕니다.
    4. 어떤 혼잡 한 항 체 자리에 대 한 로드 이미지 획득 후 세포 평평 하 게 단계 3.1.2와 3.1.3에 의하여 흐린된 배경 이미지와 함께.
    5. 1에 의해 병합 된 이미지에서 각 픽셀을 빼기 ("과정 > 수학", "빼기..."를 선택 하 고 값 1 지정)
    6. 이미지의 4 모서리에 50 픽셀 × 50 픽셀 영역을 선택 하 고 픽셀 강도 표준 편차 (σ)를 측정. 3.1.5 자세한 단계를 참조 하십시오.
    7. 3σ에 이미지 임계값을 설정 하 여 바이너리 이미지 마스크를 만들고 크기와 개체의 0 미만 4 픽셀2픽셀 강도 값을 설정 합니다. 을 수행 하려면, "분석" 메뉴에서 "입자 분석"을 선택 하 고 크기 및 원형 지정.
    8. 병합 된 혼잡 한 항 체 자리 이미지를 바이너리 이미지 마스크에 곱하십시오.
      1. 을 수행 하려면, "프로세스" 메뉴에서 "이미지 계산기...", "곱하기" 운영과 필수, 이미지 지정 선택한 상자 "만들기 새 창"와 "32-비트 (부동) 결과."
    9. "분석"을 선택 하 여 나머지 픽셀 농도의 합계 다음 "측정"; 선택 항목의 요약 통계 결과 창에 표시 됩니다.
    10. 혼잡 한 자리에 바인딩된 단일 분자의 수를 계산 하기 위해 평균 단일 분자 강도 의해 픽셀 농도의 합계를 나눕니다.
  3. 절대 정량화에 대 한 교정 곡선
    1. 섹션 1과 알려진된 농도 재조합 단백질으로 아군 4 %PBSA 솔루션에서 10 nL 주소 방울 탐지 항 체를 형성 하는 2를 반복 합니다.
    2. 수행 하는 10의 농도 시리즈2-솔루션에 추가 하는 재조합 형 단백질의 알려진된 농도 변화 하 여 방울 당 107 재조합 단백질. 보정 단일 셀 데이터 간단 있도록 드롭릿 당 단백질의 수 작업 하는 것이 좋습니다.
    3. 3.3.2 어떤 단 하나 분자를 보정 단계에서 데이터 계산 농도 시리즈를 사용 하 여 자리 단백질 풍부한 방울 당 고 단일 셀 당 확장 단백질 풍부 하 당.

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결과

P53의 절대 기저 단백질 복사본 수 인간 결 장 암 세포 선, 될 셀에에서 단일 셀 해상도로 결정 되었다. 어떻게 p53 식 여러 자릿수로 동안 다를 수 있으며 휴식 될 세포 인구 내에서 셀 크기와 단백질 복사 번호 약하게 긍정적인 상관관계를 보여 보여 줍니다.

주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays 수성 방울 항 체 자리 위치에서 적절 하 게 석유와 때 형성 된다. 여기, 방울 민감한 p53 단백질 분석 결과 지원합니다. Coverslips 캡처 항 체 점이 연락처 microarrayer 핀을 사용 하 여 배열 됩니다. 안티-p53 캡처 항 체 상용 ELISA 테스트 키트에서 가져온 것입니다. 인쇄 조건 캡처 명소 했다 자리 당 6.2 ± 0.5 x 105 단백질의 최대 캡처 용량을 가진 직경에 있는 약 100 µ m 되도록 했다....

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토론

주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays는 양적 단일 세포 내 단백질의 절대 복사본 수를 결정 하는 과민 하 고 확장 가능한 방법.

일반적인 바인딩 수준을 제한 (NSB)이 낮은 가능한 탐지의 한계를 달성 하는 프로토콜 내에서 중요 합니다. 단백질 및 다른 생 화 확 적인 종 방울 내의 인터페이스의 수에 비 특히 묶는 수 있습니다-coverslip 표면, 항 체 자리와 기름/물 인터페이스. 단백질은 인터페이스 또는 자체 기름으로 분할 하 여 손실 될 수 있습니다. 우리는 4 %BSA 수성 방울에는 NSB는 프로토콜에 지정 된 항 체를 사용 하 여 단백질의 제한 수 나타났습니다. 양자 택일 단백질 목표 및 그들을 검출 하는 데 사용 하는 항 체는 다른 차단 방법, 그러한 비 이온 세제 또는 호환 계면 필요할 수 있습니다. 불 오일 또한 상한 기름으로 봉사에서 그들의 적합성에 대 한 테스트할 수 있습니다. 이러한 경우, 임계 micelle 농도 및 상한 오일의 밀도 같은 추가...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

ASR는 실험 설계, 프로토콜을 개발 하 고 데이터를 분석. SC와 PS 셀 크기 실험을 수행. ASR와 OC는 원고를 썼다. 저자는 기꺼이 인정 하는 교수 데이비드 R. Klug의 지원 장비에 대 한 액세스를 제공 하고자 합니다. 저자는 제국 대학 고급 Hackspace 제조 및 프로토타이핑 시설에 대 한 액세스를 감사 하 고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강>세포 배양
인산염 완충 식염수(PBS)Life Technologies10010015
DMEM 고포도당시그마D6429
소 태아 혈청(FBS)바이오크롬S0115
세포 배양 플라스크코닝SIAL0639
트립신/EDTABiochromL2153
NameCompany카탈로그 번호Comments
>Microarray
Microcontact ArrayerDigiLab, 영국OmniGrid Micro
Microcontact pinArrayIt, 미국946MP2
Coverslips (Nexterion)Schott, 유럽1098523크기(mm): 65.0 x 25.0; 두께 (mm) 0.17
p53 캡처 항체EnzoADI-960-070
p53 검출 항체, Alexa Fluor 488 표지Santa Cruzsc-126재고 농도 200μ g/mL
식염수-구연산나트륨 완충액Gibco15557-044
베타인시그마61962
도데실황산나트륨시그마L3771
384 웰 플레이트(저용량)시그마CLS4511
질소 가스 실린더BOC산업용 등급, 무
<강>이름Company카탈로그 번호코멘트
>Droplets
MicromanipulatorEppendorfPatchman NP2
수동 마이크로인젝터EppendorfCellTram Vario
MicropipetteOrigio, 덴마크MBB-FP-L-0
주사기 펌프KD ScientificKDS-210
100 μ L 주사기Hamilton81020가스 밀폐, PTFE Luer lock
1 mL 주사기Hamilton81327가스 밀폐, PTFE Luer lock
실리콘 아이솔레이터Grace Bio-LabsJTR24R-A-0.56x4 웰 실리콘 아이솔레이터 (접착제 포함
레이저 커터VersaLASEVLS2.30 CO2 Laser 3W맞춤형 아이솔레이터
레이저 절단 용 1mm 두께의 아크릴 시트맞춤형 절연체의 레이저 절단을 위한Clarex Precision Sheet 001
접착 시트3M마이크로어레이 커버슬립에 맞춤형 절연체를 부착하는 데 사용됩니다.
슈퍼 글루록타이트LOCPFG3T
150 μ m ID/360 &뮤; m OD 용융 실리카 튜브IDEXFS-115
1.0 mm ID/1/16" OD PFA 튜빙IDEX1503
0.014" 아이디/0.062" OD PTFE 튜빙Kinesis008T16-100
1.0mm ID/2.0mm OD FEP 튜빙IDEX1673
소 혈청 알부민(BSA)피셔 사이언티픽BP9700100
미네랄 오일시그마M5904
초순수Millipore, 독일MilliQ
Name 회사카탈로그 번호Comments
Microscopy &
TIRF 현미경일본 Nikon, 일본Nikon Ti-E
EM-CCDAndor Technologies, 아일랜드IXON DU-897E
레이저 여기 소스Vortran, 미국Stradus 488-50
광학 용해 레이저 소스Continuum, 미국Surelite SLI-10
현미경 TIRFChroma, 미국z488bp
현미경 필터 큐브LPD01-532R-25
NameCompany카탈로그 번호Comments
Software
피지오픈 소스이미지 분석 소프트웨어
MatlabMathworks버전 7.14 이상이미지 분석 소프트웨어
산소) Weatherall-UK 은 인코딩된 XY 스테이지가 있는 광학용 필터 큐브 광학 용해 레이저 2000, 영국

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