colchicine을 이용한 이중 처리를 통해 분열 세포를 죽이는 식물 유래 독소, 신경이없는 히드라 vulgaris 가 생성 될 수 있습니다. 이 히드라 는 독자적으로 먹거나 먹을 수 없습니다. 이 논문은 실험실에서 신경이없는 히드라 vulgaris 의 장기 유지를위한 개선 된 방법을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
히드라 의 간질 세포 계통에는 다 분화능 줄기 세포와 그 파생물이 포함됩니다 : 샘 세포, 혈구 세포, 배아 세포 및 신경 세포. 간질 세포는 분열 세포를 죽이는 식물 유래 독소 인 콜히친 (collicicine)을 2 회 연속 처리하여 제거함으로써 간질 줄기 세포에서 유래 한 분화 세포의 재생 가능성을 없앨 수 있습니다. 이것은 신경 세포가 부족한 히드라 의 생성을 가능하게합니다. 신경이없는 폴립은 삼투압을 공급, 제거 또는 조절하기 위해 입을 열 수 없습니다. 그러나 그러한 동물은 규칙적으로 강제로 먹이를 먹이고 짐을 싣기 만하면 생존하고 실험실에서 무기한 배양 될 수 있습니다. 신경 세포가 부족하여 동물 행동과 재생을 조절하는 신경계의 역할을 연구 할 수 있습니다. 신경이없는 히드라 유지를 위해 이전에 발표 된 프로토콜에는 손으로 뽑은 마이크로 피펫을 사용한 구강 (mouth-pipetting)히드라 를 먹이고 닦으십시오. 여기서 신경이없는 히드라 유지를위한 개선 된 프로토콜이 소개됩니다. 잘게 썰린 집게는 강제로 입을 열고 갓 죽인 아르테 미아 (Artemia)를 삽입하는 데 사용됩니다. 강제 공급 후 동물의 체강을 시린지와 피하 주사침을 사용하여 신선한 배지로 씻어내어 소화되지 않은 물질을 제거합니다. 여기서는 "burping"이라고합니다. 포셉과 주사기를 사용하여 힘을 공급하고 신경이없는 히드라 를 버핑하는이 새로운 방법은 손으로 뽑은 마이크로 피펫 팁을 사용하는 입 피펫팅의 필요성을 없애줍니다. 따라서 프로세스를보다 안전하고 훨씬 더 효율적으로 만듭니다. hypostome의 신경 세포가 제거되었는지 확인하기 위해 anti-tyrosine-tubulin을 이용한 면역 조직 화학 법을 시행합니다.
서론
히드라 의 신경계는 상피 조직층과 관련된 뉴런과 함께 신경 네트로 구성됩니다 1 . 신경망은 hypostome과 peduncle에서 밀도가 높고 body 칼럼 2 에서는 밀도가 낮습니다. 신경 세포는 분비 세포, 혈구 세포, 배아 세포 및 뉴런을 생성하는 다 능성 줄기 세포 인 간질 줄기 세포에서 기원합니다 1 . 분열 된 세포를 죽이는 식물 유래 독소 인 콜히친 3 , 4로 처리하여 히드라 분비 선의 간질 세포를 제거 할 수 있습니다. colchicine이 다른 유기체에서 미세 소관의 중합을 억제하는 것으로 밝혀졌지만, 이전의 연구에 따르면 microtubules은 Hydra 3 에서 전체적으로 콜히친이 이런 작용을하지 않는다는 것을 시사하는 전체 치료 과정에서 Hydra 에 존재한다는 사실이 밝혀졌습니다. 또 다른 성udy는 Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas 및 Schizosa....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 더블 콜히친 치료
- Hydra 배지 3 , 4 , 17에 0.4 % 콜히친 (중량 / 부피) 용액을 만듭니다.
주의 : 콜히친은 급성 독성이며, 삼키면 치명적이며, 유전 적 결함을 유발할 수 있으며, 눈에 손상을 줄 수 있습니다. 흄 후드에서 분말을 다루고 완전한 개인 보호 장비 (Personal Protective Equipment, PPE)를 착용하십시오. - 어둠 속에서 실온에서 8 시간 동안 페트리 디쉬에 콜히친 용액 1 mL 당 5 Hydra 의 비율로 0.4 % 콜히친에서 24 시간 동안 굶어 놓은 Hydra vulgaris (AEP 균주가 여기에 사용 됨)를 품는다.
참고 : 5 Hydra / mL 콜히친은 Hydra로 접시를 과밀하게 지나치는 것을 피하기 위해 사용할 솔루션의 양을 결정하기위한 지침입니다. 이후의 세척 및 솔루션 변경에는 동일한 볼륨의 솔루션을 사용하십시오. - 콜히친 솔루션을 제....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
초기 8 시간 콜히친 치료 직후 모든 히드라는 생존합니다. 이 히드라 중 일부는 촉수 스텁을 남기고 ( 그림 3A ), 나머지는 촉수를 완전히 잃을 것입니다 ( 그림 3B). 다음 1 또는 2 일 동안, 촉수는 모든 히드라 가 촉수를 잃을 때까지 계속 줄어들 것입니다. 치료 후 약 일주일 후 Hydra 는 촉수가 완전히 재생되기 전에 ( 그림 3 D ) 촉수와 같은 작은 스터브 ( 그림 3 C )와 함께 촉각 재성장의 징후를 보여줍니다. 원래 히드라 의 약 50-60 %는 결국 치료 후 1-2 주 사이에 촉수를 재생합니.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이드 라 간질 세포는 이중 콜히친 치료를 통해 제거 할 수 있습니다 3 , 4 . 첫 번째 치료를 한 다음날에는 히드라 조각이 변형 된 히드라와 융합되는 것을 피하기 위해 개별 히드라 간의 접촉을 방지하는 것이 중요합니다. 또한, 두 번째 콜히친 치료는 그러한 동물에서 잔여 간질 세포를 제거하기에 충분하지 않을 수 있으므로, 첫 번째 치료 후 보조없이 섭취 할 수있는 동물은 제거해야합니다. 두 번째 콜히친 치료 후 신경이없는 히드라 의 생존율을 극대화하려면 첫 번째 치료에서 회복 한 후 가능한 한 많은 Artemia 를 공급해야하며, 회복과 성장을 위해 1 ~ 2 일의 사료 공급이 필요합니다. 각 콜히친 치료는 세포가 배출 될 때 Hydra의 크기가 현저하게 줄어들 기 때문에 각 치료 전에 Hydra
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자들은 신경이없는 동물을 생성하고 유지하기위한 원래의 프로토콜에 대해 토론하기 위해 Dr. Dick Campbell (UC Irvine)에게 감사하고, 주사기와 바늘 기술을 적용하는 데 도움을 준 Rui Wang과 Danielle Hagstrom 및 Dr. Rob Steele (UC Irvine)에게 원고에 대한 의견을 말했습니다. 이 연구는 RCSA 및 NSF 보조금 CMMI-1463572에 의해 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 mL 주사기 | BD | 301025 | |
| 소금물 새우 달걀 | 소금물 새우 다이렉 | N/A | 현지에서 구입할 수 있습니다 |
| 소금물 새우 부화장 접시 | 소금물 새우 다이렉 | N/A | |
| 60 mm x 15 mm 페트리 접시 | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" 피하 주사 바늘 | Covidien | 1188830340 | 27G 바늘도 사용할 수 있습니다 |
| x 파인 팁 핀셋 | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| 염소 안티 마우스 lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| 메스 | Fisher | 08-920A | |
| 소 태아 혈청 (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS 정제 | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| 과산화수소 | 시그마 | 216763 | |
| 파라포름알데히드 (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X - 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| 우레탄 | Sigma | U2500 | |
| 공기 펌프 | Tetra | 77846-00 | |
| 유리 파스퇴르 피펫 | VWR | 53283-916 | 피펫의 길이는 중요하지 않습니다 |
| 15 mL 튜브 | VWR | 89039-670 | |
| P320 사포 | 3M | IBGABBV00397 | 지역 주택 개조 상점에서 구입할 수 있습니다 |
참고문헌
- Bode, H. R. The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution. J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).
- Hager, G., David, C. N. Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migratio....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
