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방법 논문

Zebrafish Spermatogonia 전체 Testes 바늘의 cryopreservation 몰입 울트라-빠른 냉각

7.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56118

⸱

2018년 3월 4일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Aquaculture, Szent István University

이 논문에서

요약

이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 vitrification (NIV) 절차 전체 zebrafish testes cryopreserve에 몰입 했다. 또한, 5 개의 다른 zebrafish 긴장에서 방법의 반복성 시험 되었다.

초록

생명 공학 및 과학의 현재 동향 breeding 식민지 유지의 일반적인 관행을 넘어 유전 자원의 안전한 저장을 위한 새로운 방법에 대 한 필요성에 따라서 선도 모델 생물에서 새로운 라인의 수천의 창조 될. 이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 vitrification (NIV) 절차 전체 zebrafish testes cryopreserve에 몰입 했다. 전체 testes에 의해 초기 단계 세균 세포의 cryopreservation 이니라 제공 합니다 zebrafish의 스토리지에 대 한 가능성 유전 자원, 특히 이후 이식 후 그들은 둘 다 남성과 여성 gametes로 성숙 수 있습니다. 침술 바늘, 두 cryoprotective 미디어 (평형 솔루션 1.5 M 메탄올 및 1.5 M 프로필 렌 글리콜; 및 vitrification 솔루션 3 M 디 메 틸 sulfoxide 및 3 M 프로필 렌 글리콜을 포함)에 equilibrated에 testes excised 했다 그리고 액체 질소에 뛰어들었다. 샘플 3 결과 지구 온난화 솔루션의 시리즈에는 예 열 했다. 이 기술의 주요 장점은 다운스트림 조작; 촉진 따뜻하게 testes의 소화 후 (1) 정 충의 부족은 (2) 매우 빠른 따라서 냉각 및 cryoprotectants; 그들의 독성을 줄일 필요 농도 감소를 극대화 하는 액체 질소에 조직의 최적의 노출 사용 냉각 (3) 동기 여러 testes의, 노출에 cryoprotectants 액체 질소; 그리고 (4) 반복성의 5 개의 다른 zebrafish 긴장에서 50% 이상의 생존 여 시연.

서론

생명 공학 및 과학 소설 동향은 쥐, 초파리, zebrafish의 모형 유기 체 생물 의학에 및 다른 과학1로 사용 하는 다른 종의 새로운 돌연변이 라인의 수천의 창조에 이르렀다. 또한, 새로운 기술을 개발 하 고 사용할 수 있게 되는, 돌연변이 라인의 숫자는 꾸준히2증가. 식민지를 번 식 유지의 일반적인 관행을 넘어 유전 자원의 안전한 저장에 대 한 필요성을이 끈다. 시간이 무기한 기간에 대 한 유전 자원의 안전한 저장을 수 있는 방법으로 cryopreservation 장점이 많은 생식 시즌의 확장 circumvents broodstock, 지속적인 유지 관리를 위해 필요 하 고 그것은 더 많은 비용-와 같은 고 효율적인 노동2.

정자 cryopreservation는 지난 몇 년 동안2,3,4 중 개발에 대 한 프로토콜 zebrafish 남성 유전 물질의 성공적인 저장소에 대 한 기회를 제공 합니다. 그러나, 계란이 나 생선에는 태아의 cryopreservation 불가능 아직 그들의 복잡 한 구조와 노 른 자 물자의 다량. 최근, 원시 생식 세포 (PGCs) 또는 spermatogonial 줄기 세포 (SSCs) 이식의 연습 이식5후 정자와 난 기능으로 개발 하 여이 방 벽을 우회를 제공 합니다. 따라서, SSCs의 cryopreservation 희귀 하 고 귀중 한 유전자 자원의 보존에 새로운 프론티어를 제공합니다.

Cryopreservation 많은 장점을 제공, 비록 느린 속도 동결 과정 세포 손상2로 이어질 수 있는 몇 가지 조건을 생성 합니다. 이러한 세포와 extracellular 얼음 대형, 탈수, cryoprotectant 독성 등이 포함 됩니다. 세포내 얼음 손상 세포, extracellular 얼음 셀의 기계적 분쇄 동안 느린 속도 동결 세포에서 물 보급 탈수6으로 이어질 수 있습니다 하는 동안 발생할 수 있습니다. 최근, 얼음 대형의 부정적인 효과 방지 하는 기술로 vitrification 물고기 gametes7,,89의 cryopreservation에 적용 되었습니다. 통해 내부 및 외부 미디어 얼음7,10에 crystalizing 없이 비정 질/유리 상태로 설정 하는 매우 빠른 냉각 기법을 제공 합니다. 고환 및 난소 조직의 성공적인 vitrification 조류 및 포유류 종10,,1112, 따라서 물고기, 뿐만에서 자사의 응용 프로그램에 대 한 가능성을 열어 입증 되었습니다.

이 연구에서 우리 전체 zebrafish testes의 cryopreservation 바늘 몰입 vitrification (NIV) 절차를 제시. 오염 및 다른 세포, 특히 정 충의 낮은 존재와 상대적으로 높은 양의 초기 생식 세포 생성 cryopreservation 과정 없이 zebrafish 초기 세균 세포 절연에 대 한 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다. 우리의 지식 최선을이 물고기 gonadal 조직과 zebrafish 생식 세포의 초 급속 한 냉각에 대 한 상세한 시각화 된 프로토콜을 설명 하는 첫 번째 연구 이다. 또한, 방법의 반복성 5 다른 zebrafish 긴장에서 설명 된다: AB 야생 타입, 캐스퍼 (로-/-; nacre-/-), 레오 파 드 (레오t1/t1), 바사 [Tg (vas::eGFP)]와 Wilms 종양 [Tg (wt1b::eGFP 1)] 유전자 변형 라인.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 헝가리 동물 복지 법률에 의해 승인 되었습니다.

1. 시 약 준비

  1. 재고 솔루션
    1. 그것은 완전히 해소 될 때까지 잘 dH2오 믹스의 1 mL에 트 레 할 로스가 수화물의 0.378 g를 추가 하 여 1 M 트 레 할 로스를 준비 합니다.
    2. 그것은 완전히 해소 될 때까지 잘 dH2오 믹스의 1 mL에 자당의 0.342 g를 추가 하 여 1 M 자당을 준비 합니다.
    3. 그것은 완전히 해소 될 때까지 잘 HEPES의 0.238 g dH2오 믹스의 1 mL에 추가 하 여 1 M HEPES를 준비 합니다.
    4. PBS의 5 mL을 100 mg을 추가 하 여 20 mg/mL 콜라 (290 U/mg)를 준비 합니다. 그것은 디졸브 때까지 철저 하 게 혼합. 0.2 µ m 필터를 통해 살 균 필터입니다. 0.2 mL PCR에 aliquot 50 µ L 튜브와-20 ° c.에 동결
    5. 15 mg/mL의 트립 신 준비 (~ 10000 U/mg) 5 ml PBS의 75 밀리 그램을 추가 하 여. 그것은 디졸브 때까지 철저 하 게 혼합. 0.2 µ m 필터를 통해 살 균 필터입니다. 0.2 mL PCR에 aliquot 50 µ L 튜브와-20 ° c.에 동결
    6. 1 mg/mL DNase 준비 나 (~ 3000 U/mg) PBS의 5 mL에 5 mg을 추가 하 여. 그것은 디졸브 때까지 철저 하 게 혼합. 0.2 µ m 필터를 통해 살 균 필터입니다. 0.2 mL PCR에 aliquot 50 µ L 튜브와-20 ° c.에 동결
    7. PBS의 10 mL을 trypan 파랑의 40 mg을 추가 하 여 0.4 %trypan 블루를 준비 합니다. 0.2 µ m 필터를 통해 살 균 필터입니다. 1.5 mL 튜브에 aliquot 1 mL입니다.
    8. 200 mg/L MS 준비-222 (Tricaine 메탄 된) 그것은 완전히 해소 될 때까지 잘 dH2오 믹스의 1 L에 MS-222의 200 밀리 그램을 추가 하 여. 또한, MS-222 솔루션 7.0의 중립 pH에 탄산을 버퍼링 합니다.
  2. Vitrification 위한 솔루션
    1. 재래식 솔루션 (ES) 준비: 메탄올 (MeOH; 1.5 M)의 121.5 µ L를 혼합 하 여 ES의 2 개 mL를 준비 프로필 렌 글리콜 (PG; 1.5 M)의 220 µ L FBS (10%), 트 레 할 로스 재고 솔루션 (0.1 m M), HEPES 재고 솔루션 (25mm) 50 µ L 2로 L-15의 1208.5 µ L의 200 µ L의 200 µ L mL 튜브입니다.
    2. Vitrification 솔루션 (VS)를 준비: PG (M 3), 디 메 틸 sulfoxide의 426 µ L의 439 µ L를 혼합 하 여 대의 2 개 mL를 준비 (나2그래서; 3 M), 200 µ L FBS (10%), 트 레 할 로스 재고 솔루션 (0.1 m M), HEPES의 50 µ L의 200 µ L의 재고 솔루션 (25 밀리미터) 및에 L-15의 685 µ L를 2 mL 튜브입니다.
  3. 온난화에 대 한 솔루션
    1. 지구 온난화 솔루션 1 (WS1) 준비: FBS (10%), 자당 재고 솔루션 (3 M)의 450 µ L의 150 µ L를 혼합 하 여 2 mL 튜브에 WS1의 1.5 mL를 준비 및 L-15의 900 µ L.
    2. 지구 온난화 솔루션 2 (WS2) 준비: FBS (10%), 자당 재고 솔루션 (1 M)의 150 µ L의 150 µ L를 혼합 하 여 2 mL 튜브에서 1.5 mL WS2의 준비 및 L-15의 1200 µ L.
    3. 지구 온난화 솔루션 3 (WS3) 준비: WS2 2 mL 튜브에서 1.5 mL 혼합 150 µ L FBS (10%)에 의해 준비 및 L-15의 1350 µ L.
  4. 소화 솔루션 준비: 각 샘플 콜라 재고 솔루션 (2 mg/mL)의 50 µ L, trypsin 재고 솔루션 (1.5 mg/mL)의 50 µ L를 혼합 하 여 소화 솔루션의 500 µ L를 준비, 대 한 DNase의 10 µ L I (20 µ g/mL) 및 2 ml에서 L-15의 390 µ L 튜브.
  5. 해 부 도구 얻기:가 위, microscissors, 핀셋, 곡선된 핀셋, 그리고 침술 바늘.

2. 고환 컬렉션

  1. 200 mg/L와 MS를 포함 하는 접시에 그것을 배치 하 여 물고기를 안락사-222 (pH = 7). 해 부와 함께 계속 하기 전에 아가미 이동 중지 하 고 저 산소 증에 의해 죽음을 보장 하기 위해 그 순간부터 그 이상 10 분 통과 있는지 확인 합니다.
  2. 종이 타월에 아 티 하 여 물고기를 말리 고 해 매트에 등 쪽의 측면에 배치.
    1. 첫째로 쉽게 해 부에 대 한 골반과 가슴 지 느 러 미를 잘라.
    2. 수평으로 가슴 지 느 러 미 사이의 물고기의 뱃속에는 피부를 싹 둑 하 고 항문 지 느 러 미까지 피부와 뱃속을 따라 기본 근육을 잘라.
    3. 물고기의 몸에 구멍을 열고 바늘으로 해 부 매트에 왼쪽 및 오른쪽 몸 벽을 고정 합니다.
      참고: Testes 수영 방광 (그림 1)의 양쪽에 위장 기관 위에 있습니다.
  3. 오염을 방지 하기 위해, 할 하지 꺼내 위장 기관, 하지만 부드럽게 한쪽에 밀어와 반대 측에서는 고환 제거. Testes 체 벽에 연결 된 그래서 신중 하 게 그들을 제거 하 고 microscissors에 의해 연결 복을 잘라.
  4. 또한, 오염 방지 하기 위하여 첫째로 소독 testes 2 s, 그리고 다음 장소에 대 한 70% 에탄올에 넣어 얼음에 96 잘 접시에 L-15에 그들.
    참고: 필요한 경우 지방 조직에서 크고 깨끗 한 testes 혈액 혈관을 정확 하 게는 stereomicroscope에서

3. 고환 조직 울트라-빠른 냉각

  1. 마크 바늘 샘플에 따라 적절 한 레이블 입력 하 고 평형 (ES)와 vitrification 솔루션 (VS) 준비.
  2. 살 균 침술 바늘에 잘 더 큰 접시 또는 접시와 핀 2 ~ 3 testes (이상의 바늘의 크기에 따라) testes를 전송.
    1. 첫째 곡선된 핀셋 위에 고환 위치. 고환 가운데 바늘의 포인트를 놓고 조심 스럽게는 핀셋으로는 고환 위쪽으로 당겨.
    2. 고환, puncturing 후 부드럽게 당겨 위쪽으로 바늘의 위쪽. Testes 서로에서 분리 되어 그리고 그들은 하지 떨어지고는 또는 아래로 슬라이딩 다는 것을 확인 하십시오.
    3. 장소 2 mL 튜브에 고정 된 고환과 바늘 가득 L-15 vitrification까지 (25 ˚C;에서 저장 시간 초과 하지 않아야 합니다 1 시간).
      주: 바늘에 고환을 고정 빨리 밖으로 건조에서 testes을 방지 하기 위해 수행 한다.
  3. 재래식 솔루션으로 고환과 바늘을 전송 하 고 25˚C에서 5 분 동안 품 어.
  4. Vitrification 솔루션으로 바늘을 전송 하 고 30 품 어 25˚C에서 s.
  5. Vitrification 솔루션에서 바늘을 제거, 신속 하 고 부드럽게 살 균 종이 타월에 의해 조직에서 나머지 솔루션을 흡수. 주의 사용 하 여 종이 타월에 집착 하거나 떨어지 testes를 피하기 위해.
  6. 신속 하 게 스티로폼 상자에 배치 하는 액체 질소에 바늘을 놓습니다.
    참고: 조직의 액체 질소 증기에 노출에 신속 하 게이 단계를 수행 액체 질소의 낮은 볼륨을 사용 하 여 샘플의 교차 오염을 방지 하기 위해.
  7. 5-10 분에 대 한 닫힌된 스티로폼 상자에 액체 질소에 바늘을 두십시오.
  8. 쿨 열된 4.5 mL cryotube와 같은 상자에서 그것의 모자.
  9. 5-10 분 후 액체 질소의 표면 아래에 별도 cryotube에 각 바늘을 전송 하 고는 cryotube를 닫습니다.
    주의: 항상 때 보호복 (절연된 장갑) 등을 사용 노출 심한 동상으로 이어질 수 있습니다 액체 질소와 협력.
  10. Cryotube 금속 지팡이에 놓고 최대한 빨리 cryobank 용기에 배치. 샘플 용기 저장에서 저장 dewar 추가 사용까지.

4. 지구 온난화 절차

  1. 별도로 각 바늘을 따뜻한. 25 ° c.에 모든 지구 온난화 솔루션 이어야 한다
  2. 금속 지팡이에서 cryotube를 분리 하 고 스티로폼 상자에 저장 된 액체 질소로 급락.
  3. 액체 질소 증기 (집게를 사용 하 여)에 cryotube을 열고 액체 질소에 바늘을 해제 합니다.
  4. 첫 번째 지구 온난화 솔루션으로 매우 빠르게 바늘을 전송 하 고 (25 ° C)에서 1 분 동안 품 어. 신속 하 게 전송 하는 동안 공기에 그것의 온난화 방지 하기 위해 바늘을 전송 해야 합니다.
  5. 두 번째 지구 온난화 솔루션으로 바늘을 전송 하 고 (25 ° C)에서 3 분 동안 품 어.
  6. 3 지구 온난화 솔루션으로 바늘을 전송 하 고 (25 ° C)에서 5 분 동안 품 어.
  7. 곡선된 핀셋으로 그들을 아래쪽으로 밀어 바늘에서 testes를 놓습니다. 별도 우물 (96 잘 접시)에 개별적으로 각 따뜻하게 고환 L-15 10% 보충의 250 µ L로 가득 장소 FBS. 우물 샘플에 따르면 개는 다는 것을 확인 하십시오. 모든 샘플은 따뜻하게 될 때까지 얼음에 잘 접시까지 추가 작업을 계속.

5. 조직 소화

  1. 각 샘플에 별도 2 mL 튜브 분리 솔루션의 500 µ L를 준비 합니다. 이 샘플의 코드에 따라 튜브 라벨. 실 온에서 5 분 동안 준비 된 분리 솔루션을 품 어.
  2. 따뜻하게 조직 소화 솔루션에 추가 하 고 작은 위 적어도 30 움직임에 의해 그것을 작은 조각으로 잘라.
  3. 25 ˚C에서 90 분 떨고 접시에 잘라 조직 품 어.
  4. FBS의 L-15 및 100 µ L의 400 µ L을 추가 하 여 소화 프로세스를 중지 (10% FBS v/v). 짧게 솔루션을 동요 하 고 실 온에서 1 분 동안 품 어.
  5. 1.5 mL 튜브에 50 µ m 필터를 통해 얻은 솔루션을 필터링 합니다. 튜브를 따라 레이블을 지정 합니다.
  6. 25 ˚C에서 10 분 동안 200 × g에서 필터링된 솔루션 원심
  7. 조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 L15 10% 보충의 20 µ L에서 펠 릿 resuspend FBS. 펠 릿은 완전히 용 해 될 때까지 수동으로 튜브를 흔들. 추가 사용까지 얼음에 또는 4 ˚C에서 셀 정지를 유지.

6. 생존 능력 평가 셀 계산

  1. 세포 현 탁 액 및 레이블이 표시 된 0.2 mL PCR 튜브에 0.4 %trypan 블루 솔루션의 5 µ L의 혼합 5 µ L. 다른 볼륨을 사용 하는 경우 1:1 남아의 희석 비율.
  2. 실 온 (25 ° C)에서 1 ~ 3 분이 서 스 펜이 션을 품 어.
  3. 현미경 hemocytometer에 각 샘플의 생존 능력을 확인 합니다.
  4. 라이브 셀 (trypan 블루 흠 없는) 15 필드 수를 계산 합니다. 세포 현 탁 액의 20 µ m에 있는 셀의 총 수를 계산 합니다. 현 탁 액은 지금 모든 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 준비.
    참고: 큰 신체 크기와 다른 종족에 대 한 절차를 최적화 하는 때 동등한 무게의 고환 조각을 사용 합니다. 모든 실험적인 그룹에 대 한 한 개인에서 testes를 사용 하 여 결과에 개별 가변성을 피하기 위하여. Zebrafish, 경우 우리 이용 했다는 사실에 왼쪽 및 오른쪽 고환 생식 세포13 의 동일한 (또는 매우 유사한) 번호를 포함 해야 합니다 (대표 결과 참조). 왼쪽된 고환은 오른쪽 고환 vitrified/예 열 동안 제어로 유지 되었다. 생존 비율 계산 했다 신선한 고환에서 격리 하는 셀의 수에 비해 vitrified 따뜻하게 고환에서 격리 하는 셀의 수.

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결과

평균적으로, 초기 단계 세균 세포는 하나의 신선한 zebrafish 고환에서 격리 수 물고기의 크기에 따라 40, 000와 200000 셀 사이의 다양 합니다. 모든 5 종자에 신선한 zebrafish testes 소화 때 초기 생식 세포만 셀 셀 정지 (그림 2)에 아니었다. 초기 단계 세균 세포 옆에 수많은 정 충도 발견 됐다. 다른 한편으로, cryopreserved testes의 소화 후 훨씬 적은 정 충 했다. 정 충이 매우 빠른 냉각 프로토콜 생존 하지 않습니다 그리고 초기 단계 세균 세포의 많은 청소기 정지 이며 소화 과정 제거 그들은 가장 가능성이 있다는 표시.

3 AB zebrafish 남성 (일방통행 ANOVA의 신선한 testes를 소화 하 여 한 개인의 왼쪽 및 오른쪽 고환 (1 ± 0.5...

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토론

이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 몰입 울트라-빠른 냉각 절차 조류 및 포유류 종10,11,12 물고기 고환 (zebrafish 모델의 cryopreservation를 개발 했다 유기 체)입니다. Zebrafish 유전 자원의 cryopreservation에 관한 이전 연구의 대부분 zebrafish 정자2,,34의 cryopreservation에 주로 집중 되었다. 그러나, 성숙한 oocytes에서 배아의 cryopreservation 프로토콜 개발 하지 않은, 아직 일부 최근 연구 초기 단계 oocytes의 그 cryopreservation 입증 하더라도 그럴듯한

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 연구는 국가 연구, 개발 및 혁신 사무실의 헝가리 (그랜트는 ÁH를 116912), 비용 사무실에 의해 지원 되었다 (음식과 농업 비용 액션 FA1205: AQUAGAMETE), Stipendium Hungaricum 장학금 프로그램 (ZM 부여)와 새 헝가리 국가 우수 Predoctoral 친교 (EK 부여).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Leibovitz 매체 (L-15)Sigma-AldrichL1518L-글루타민
소 태아 혈청 (FBS)Sigma-AldrichF9665
트리카인 메탄 설포 네이트 (MS-222)Sigma-AldrichE10521
HEPESSigma-AldrichH3375
자당Acros 유기물57-50-1
TrehaloseAcros Organics99-20-7Dihydrate
MethanolReanal20740-0-08-65
프로필렌 글리콜Reanal08860-1-08-65
Dimethyl sulfoxideReanal00190-1-01-65
CollagenaseGibco9001-12-1
TrypsinSigma-AldrichT8003
DNase IPanreac AppliChemA3778
Trypan blueSigma-AldrichT6146
인산염 완충 식염수(PBS)200ml PBS 용액 제조용Sigma-AldrichP4417
보충 정제

참고문헌

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