학습 할 간단한 신경계 상해 방법론<em&gt; Drosophila</em&gt; 모터 뉴런 변성

요약

여기에 우리는 세 번째 instar 애벌레의 neuromuscular 접합 (NMJ)에서 모터 뉴런의 신경 퇴화를 시각화하고 계량하기 위해 초파리 유충의 분절 신경을 손상시키는 간단하고 널리 액세스 할 수있는 방법을 설명합니다.

초록

뉴런의 퇴행은 정상적인 발달과 상해, 스트레스 및 질병에 대한 반응으로 발생합니다. 신경 세포 변성의 세포 특징은 인간과 무척추 동물에서 이러한 과정을 유도하는 분자 메커니즘과 현저하게 유사합니다. 초파리 Drosophila melanogaster 는 강력하지만 단순한 유전 모델 유기체로서 신경 퇴행성 질환의 세포 복잡성을 연구합니다. 실제로 질병 관련 인간 유전자의 약 70 %는 Drosophila 상 동체를 가지고 있으며 인간의 신경 퇴행성 질환을 연구하기 위해 파리를 사용하여 과다한 도구와 분석법이 기술되었습니다. 더 구체적으로 Drosophila 의 신경근 접합점 (neuromuscular junction, NMJ)은 신경 세포와 근육 사이의 구조적 연결을 분석 할 수 있기 때문에 신경근 질환을 연구하는 효과적인 시스템으로 입증되었습니다. 여기, 우리는 Drosophila의 생체 내 운동 신경 손상 분석에 대해보고합니다.재현 가능하게 24 시간까지 NMJ에서 신경 퇴행을 유도한다. 이 방법론을 사용하여 우리는 운동 신경 세포의 퇴행을 초래하는 세포 사건의 시간 순서를 기술했다. 부상 방법은 다양한 응용 분야를 가지고 있으며, 신경 퇴행에 필요한 특정 유전자를 확인하고 신경 손상에 대한 전사 반응을 해부하기 위해 활용되어왔다.

서론

신경 세포의 퇴행은 정상적인 발달 중에 발생하며 자연 노화 과정, 상해, 스트레스 또는 질병 상태에 의해 유발 될 수 있습니다. 초파리 인 Drosophila melanogaster 는 뉴런의 퇴행을 유발하는 분자 메커니즘의 현저한 유사성으로 인해 신경 퇴화를 연구 할 수있는 간단하고 강력한 모델 유기체를 제공합니다. 이러한 유사점은 질병 관련 인간 유전자의 약 70 %가 Drosophila 동족체를 가지고 있다는 사실에 의해 강조됩니다. ⁽¹⁾ 또한, 많은 분석과 인간의 신경 퇴행성 질환을 연구하는 기술 도구 개발 및 초파리에 활용되고있다. ^{2 , 3} Drosophila 내에서, 신경근 접합부 (NMJ)는 세포 및 전기 생리 학적 성질의 분석을 가능하게하며, 눈에 보이는 n으로 인해 신경근 질환을 연구하는 중요한 시스템임이 입증되었다euron-muscle 연결. ⁽²⁾ 본 연구에서는 분절 신경의 재현 부상을 허용 초파리 유충의 생체 신경 세포의 손상 분석을 설명합니다. 이 motoneuron 부상 NMJ ....

프로토콜

1. 시약 및 장비 준비

1. 1x 절개 버퍼 (70 MM NaCl, 5 MM KCl, 0.02 MM CaCl ₂ , 20 MM MgCl ₂ , 10 MM NaHCO ₃ , 115 MM 자당, 5 MM 트레 할 로스, 5 MM HEPES, pH 7.2)를 준비합니다.
2. 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)을 준비하십시오.
3. 0.01 % Triton X-100 1x PBS를 사용하여 1x PBT를 준비하십시오.
4. 과일 주스 한천 접시를 준비하십시오. ^14, 간단히, H ₂ O 압력솥 700 mL에 30g의 아가를 섞는다. 메틸 파라벤 0.5 g을 에탄올 10 mL에 녹이고 과즙 (포도 또는 사과) 300 mL에 넣는다. 농축 물을 고압 가압 멸균 한천 용액에 섞고 10mm x 35mm 페트리 접시의 뚜껑에 부으십시오.
   참고 : 포도 한천 전원 premix는 여러 회사에서 구입할 수도 있습니다 ( 재료 표 참조).
5. 유충을 기계적으로 손상시키는 크기 5 포셉을 얻습니다.
6. 표준 Drosophila ....

결과

여기에 제시된 절차를 사용하여, 우리는 기계적 신경 상해가 신경 퇴행성 사건의 일시적인 해부를 허용한다는 것을 증명했습니다. ^{14 , 18} 사건의 순서는 이전에 특징 지어졌고 세포 골격의 즉각적인 붕괴, 축색 성 인신 매매 결함, ubiquitinated 단백질의 축적, 그리고 후속 적으로 24 시간의 신경 손상 이후에 시작된다. 손상되기 전에, WT NMJs는 전체 NMJ ( 그림 1A )에 걸쳐 postsynaptic 마커 Dlg에 apposition에 presynaptic 활성 영역 마커 Brp를 보여줍니다. 분절 신경의 기계적 손상은 중등도에서 중증의 신경 변성을 유도 할 수 있는데, Dlg로 염색 된 부음에는 현재 시냅스 활성 영역 단백질 Brp가 결핍되어 있습니다 (

토론

앞에서 설명한 신경 손상은 여기에서 입증되었는데 Drosophila 유충의 분절 신경에서 상해 / 스트레스를 유도하는 데 사용될 수 있습니다. ^{4, 5, 6, 14이} 실험 기술은 신경 퇴행을 초래하는 이벤트의 시간적 순서를 해부뿐 아니라 부상을 올리는 운동 신경 세포체에 전사 변화를 조사하기 이전에 사용되어왔다. ^{5 (14)} 또한,이 기술은 관찰 초파리 유충에서 축삭 변성 및 재생을 연구하기 위해 마이크로 유체 칩과 관련하여 기술되었다. 이 기술의 ⁷ 제한으로 인해 부상의 도입 동안 표피의 천자에 유충의 죽음을 포함한다. .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
미세 해부 가위	Fine Science Tools	15000-08
Dumont #3 집게	Fine Science Tools	11231-30	어떤 사람들은 크기 3을 선호하고 다른 사람들은 크기 5를 선호
Dumont #5 집게	Fine Science Tools	11251-30	어떤 사람들은 크기 3을 선호하는 반면 다른 사람들은 크기 5를 선호
CO2 Air Tank	Tech Air	UN 1013	다양한 탱크 크기를 구입할 수 있습니다
CO2 마취 장치	Genesee Scientific	59-114
스테인리스 스틸 핀, 크기 0.1	Fine Science Tools	26002-10
SylGard 184 실리콘 엘라스토머, 염기 및 경화제	Dow Corning	3097358-1004	해부 플레이트를 붓기 위해
Bouin's Solution	Sigma	HT 10132-1L	항체는 Bouin's 및 PFA에서 효율성을 테스트해야
인산염 완충 식염수(PBS)의 4% 파라포름알데히드(PFA)	Affymetrix	FLY-8030-20	항체는 Bouin's 및 PFA
Dissecting Stereo MIcroscope	AmScope	SM-1BZ
광원	AmScope	HL150-AY-220V
anti-nc82 항체에서 효율성을 테스트해야 합니다.	발달 연구 Hybridoma Bank	nc82-s
anti-discs large antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	AF3
Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase	Jackson Immunoresearch	123-545-021; 123-585-021; 123-605-021	One can you Alexa Fluor® 488, 594 또는 647
Flystuff 포도 주스 한천 프리믹스	Genesee Scientific	47-102
현미경 슬라이드	Genesee Scientific	29-101
유리 커버슬립	Fisher Scientific	12-545-87
Thermo Scientific Nalgene 유틸리티 박스	Fisher Scientific	03-484C	유충 회복을 위한 습한 챔버를 만드는 데 사용

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