Macroinvertebrates 사용 하 여 그룹별 수생 rDNA 뇌관의 유전 직감 콘텐츠 분석을 위한 실험실 프로토콜

요약

Macroinvertebrates의 가장 일반적인 직감 콘텐츠 분석은 시각. 먹이 생물의 형태학 상 다양성에 대 한 강렬한 지식을 요구, 그들은 부드러운 바디 먹이 놓치지 고, 때문에 먹이의 강한 분쇄, amphipods를 포함 한 어떤 유기 체에 대 한 거의 불가능 하다. 우리는 macroinvertebrate에 대 한 자세한, 소설 유전 접근 먹이 amphipods의 식단에 식별을 제공 합니다.

초록

음식 웹 분석 생태계의 더 나은 이해를 위해 근본적 이다. 예를 들어 식품 웹 상호 작용 비 원주민 종족의 침공으로 인 한 심한 변화를 받을 수 있습니다. 그러나, 필드 약탈자 먹이 상호 작용의 정확한 식별 대부분의 경우에서 어렵습니다. 이러한 분석은 종종 본질적인 내용에 대 한 시각적 평가 또는 안정 동위 원소 비율 (δ¹⁵N 그리고 δ¹³C)의 분석 기반으로 합니다. 이러한 방법이 필요 포괄적인 지식에 대해, 각각, morphologic 다양성 또는 개별 먹이 생물, 먹이 생물의 정확한 식별에서 장애물을 선도에서 동위 원소 서명. 단식, 섭취 및 먹이 생물의 소화 어려울 특정 종의 식별 하기 때문에 비주얼 직감 콘텐츠 분석 특히 부드러운 바디 먹이 생물을 과소 평가. 따라서, 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 전략, 예를 들어 그룹-특정 뇌관의 사용 설정, 식품 웹 상호 작용의 수사를 위한 강력한 도구를 제공 합니다. 여기, 우리가 핵 ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA)에 대 한 그룹-특정 뇌관 세트를 사용 하 여 필드에서 macroinvertebrate 소비자의 본질적인 내용을 조사 하기 위해 상세한 프로토콜을 설명 합니다. DNA 수 (작은 taxa)의 경우 전체 표본에서 추출 하거나 표본 수집 분야에서의 본질적인 내용. 존재와 DNA의 기능 효율성 테스트 개인에서 직접 확인 될 필요가 보편적인 뇌관을 사용 하 여 DNA의 각 소 단위를 대상으로 설정. 우리는 또한 소비 먹이 후속 단일 가닥 구조 다형성 (SSCP) 분석 polyacrylamide 젤을 사용 하 여 수정 되지 않은 그룹 특정 한 뇌관으로 PCR 통해 종 수준 추가 결합 결정 될 수 있다 보여줍니다. 또한, 우리는 레이블로 다른 형광 성 염료를 사용 하 여 자동된 조각 분석을 통해 여러 창 콘텐츠 샘플에서 다른 먹이 그룹의 DNA 파편에 대 한 병렬 심사 수 보여줍니다.

서론

약탈자 먹이 상호 작용, 영양 상호 작용 및 음식 웹 역동성의 대부분을 구성 하는 물질과 식품 웹 시간과 생태계 생태학의 주요 목표 중 하나는 사이 걸쳐 에너지의 플럭스 특성 주요 측면은 ¹. 소스 결정과 탄소와 영양소의 흐름 생태계²사이의 생태 연결의 이해 발전 이다. 그러나, 생태계, 강과 그들의 catchments 같은 생물³의 움직임에 의해 뿐만 아니라 유기 물질과 영양소의 용만 연결 되지 않습니다. 따라서, 그 시스템을 연결 하는 자원의 흐름을 방해 하는 서식 지 변경 변경할 수 있습니다 강력 하 게 두 생태계의 음식 웹 직접 뿐만 아니라 또한 간접적으로 포식 자-먹이 커뮤니티의 각각 구성 변경 하 여. 예를 들어, 음식 웹의 변화 한 포식 종 (예를 들어, 무지개 송어)⁴의 움직임에 연결 될 표시 되었습니다. 이러한 변화는 잠재적으로 생물 다양성 및 수생 생태계의 기능을 위협 한다. 따라서 필드에 약탈자 먹이 상호 작용 분석 인간 유발 환경 변화, 등 물 관리 관행, 수생 생태계의 네이티브 생물 다양성에 미치는 영향을 결정 필수적 이다.

영양 관계....

프로토콜

1. 필드에서 Macroinvertebrates를 수집 하 고 유전자 직감 콘텐츠 분석에 대 한 샘플 준비.

각 사이트에서

1. 수집 macroinvertebrates 개인 소비자 종의 단일 튜브에 대 한 관심의 밖으로 정렬 하 고 직접 액체 질소 나 드라이 아이스 용기 클리어런스 및 DNA의 저하를 방지 하기 위해 그들을 동결.
   참고: 알콜, 샘플 저장 일부 macroinvertebrates 알콜 그들을 죽이기 전에 역류 하는 경향이 있기 때문에 피하기.
2. 만 사용 하는 위장 지역 중간 크기 및 큰 (약 > 3 m m) macroinvertebrate 종 유전 직감 콘텐츠 분석 표본의 나머지 문제는 다른 절차 (예를 들어, 안정 동위 원소에 대 한 사용할 수 있도록 분석)입니다. Note에 해당 물 진드기 처럼 매우 작은 taxa를 조사할 때. 따라서, 1.2.1, 1.2.2 단계를 건너뛸 수 있습니다.
   1. 약간 개인 녹 하 고 신중 하 게 그것의 위장 지역 좋은 스테인레스 스틸 집게를 사용 하 여 stereomicroscope에서 해 부. 펑크 물질의 손실을 방지 하기 위해 위장 관을 하지 있는지 확인 하십시오.
   2. 클린 집게 각 위장의 준비 후에 DNA와 RNA 오염 제거....

결과

우리는 성공적으로 다른 연구에서 다이어트 분석이 프로토콜에 설명 된 단계를 사용 합니다. 이 섹션에서 우리는 프로토콜의 다른 섹션의 적용을 설명 하는 예제를 제시.

예를 들어, 저자²⁸ 및 SSCP 분석에 의해 PCR 제품의 추가 다운스트림 분석의 잠재력에 의해 설립 하는 그룹-특정 뇌관 세트의 효과 설명 하는 먹이 실험 실시 했다. 포식 자와 먹이로 체니스 종 애벌레로 Dikerogammarus villosus 의 개인 라인 backwaters 카를스루에 (독일) 근처에서 체포 했다. 실험실에서 포식 자와 먹이 taxa는 20 ° C에서 필터링 된 스트림 물에 별도로 보관 했다 하 고 36 시간 동안 굶 어 했다. 실험에 대 한 amphipod 표본 필터링 된 스트림 물 (100 mL) .......

토론

여기, 우리는 동일한 견본의 다른 비 분자 분석 결합 될 수 있는 rDNA 지역에 대 한 그룹-특정 뇌관 통해 필드 샘플에서 약탈자 먹이 상호 작용의 PCR 기반 결정에 대 한 간단 하 고 비용 효율적인 방법 제시. 그러나, 몇 가지 중요 한 단계는 프로토콜 내에서 있다. 첫째, 사용 하는 뇌관의 특이성을 확보 필수적 이다. 둘째,는 위장의 준비 및 후속 DNA 추출 하는 동안 오염 및 창 자 콘텐츠 자료의 손실을 피하기 위해 결정적 이다. 크로스-샘플 오염 먹이 DNA의 거짓인 긍정적인 탐지를 이어질 수 있습니다, 하는 동안 창 소재는 거의 실종으로 이어질 수도 있습니다 콘텐츠 손실 먹이 종의 소비. 각 소 단위 및 분석 (제 2의 프로토콜) 사용 하는 서식 파일의 기능 효율성에 속하는 rDNA의 존재의 확인은 소비 하는 먹이 대 한 대표적인 정보 수집을 위한 필수적입니다. 이것은 특히 중요 한 소비자 먹이로 되어 먹이 그룹의 아무 DNA 검출된^25,

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
액체 질소	Any	NA	거대 무척추 동물의 현장 샘플을 실험실로 운송하기 위해.
1.5 ml 반응 튜브 - Safelock	Any	NA	현장에서 소비자 표본을 수집하고 이후 액체 질소 반응 튜브에서 보존하기 위해 반드시 PCR을 세척할 필요는 없습니다. 튜브가 폭발하는 것을 방지하려면 튜브의 뚜껑을 바늘로 뚫어야 합니다.
Stereomicroscope	Any	NA	: 확대가 관심있는 소비자의 크기의 위장관을 준비하기에 적합한지 확인하십시오.
페트리 접시	Any	NA	입체 현미경 아래에서 소비자 표본의 위장관을 해부합니다.
스테인레스 스틸 foceps : Dumont 집게 No. 7	Bioform	B40d	이 구부러진 스테인레스 스틸 집게는 때때로 위장관에 구멍을 뚫지 않고 구부러진 부분 사이에 고정 된 표본을 유지하는 데 매우 헬풀 할 수 있습니다.
스테인리스강 초점: Dumont 집게 Electronic No. 5	Bioform	B40b	이 미세한 스테인리스강 집게는 소비자 표본의 위장관 준비에 이상적입니다.
DNA-ExitusPlus	AppliChem	A7409,1000RF	DNA 및 RNA 오염 제거를 위한 오염 제거 솔루션
보풀 없는 종이 타월	모든	NA
실험실 저울	모든	NA	정밀도는 0.01g 이상이어야 합니다.
마이크로리터 피펫(0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L)	모든	NA
Safe-Lock 튜브 2.0 ml	VWR	211-2165	이 raction 튜브에는 DNA, DNase, RNase 및 PCR 억제제가 없는 것이 중요합니다(PCR clean)!
Safe-Lock 튜브 1.5 ml	VWR	211-2164	이 raction 튜브에는 DNA, DNase, RNase 및 PCR 억제제(PCR clean)가 없는 것이 중요합니다!
염화나트륨 ≥ 99.5%, P.A., ACS, ISO	CARLROTH	3957.3	염 추출 버퍼(SEB) 및 DNA 추출에 필요한 5M NaCl 용액.
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris	carlroth	4855.2	염 추출 완충액 (SEB) 및 TBE 완충액
Microlitre 피펫 (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L)	carlroth	8043.1	염 추출 완충액(SEB) 및 TBE 완충액
붕산 ≥ 99.8 %, P.A., ACS, ISO	CARLROTH	6943.2	TBE 버퍼. 상업적으로 이용 가능한 TBE 버퍼를 얻은 경우에는 필요하지 않습니다.
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)	carlroth	4360.1	DNA
단백질 분해 효소 K lyophil 추출용.	carlroth	7528.1	10mg/ml를 함유한 작업 용액을 준비합니다.
시료의 균질화를 위한	TissueLyser II	Quiagen	85300
스테인레스 스틸 비즈, 5mm	Quiagen	69989	샘플의 균질화용.
가열 Thermoshaker	Any	NA
Vortex Mixer	모든	NA
냉장 원심분리기: himac CT 15 RE	Hitachi	NA	DNA 추출 중 원심분리에 사용되는 냉장 원심분리기(프로토콜 1).
이소프로판올	칼로스	6752.5
에탄올 99.8 %, p.a.	모든	NA
Water 분자생물학 등급(ddH2O)	AppliChem	A7398,1000	뉴클레아제가 없는(스트림 멸균 및 DEPC 처리) DNA의 재현탁액에 사용되며 원고 내에서 ddH2O를 참조할 때마다
Unmodified Olegonucleotides	Eurofins MWG Operon	NA	Primers unlabeled
Modified olegonucleotides	Metabion International AG	NA	프라이머 라벨링
peqGOLD Taq 올 인클루시브	VWR Peqlab	01-1000	Taq 모두 포함 PCR 반응 혼합물(반응 버퍼 Y 및 S, dNTP 및 MgCl2)용
Primus 96 고급 그래디언트 열순환기 또는 peqStar96x 범용 그래디언	Peqlab	NA	프라이머 세트는 원래 Primus 96 고급 그래디언트 열순환기에 설정되었습니다. 이 사이클러는 꽤 오래되었기 때문에 peqSta96x(이전 모델도 시뮬레이션할 수 있음)를 사용하여 동일한 조건에서 프라이머 세트가 효율적이고 구체적인지 확인했습니다. 그러나 테스트 결과 프라이머가 잘 작동하고 구형 기계의 시뮬레이션을 사용하지 않고도 여전히 특이적(Koester et al. 2013 참조)인 것으로 나타났습니다.
표준 96 웰 PCR 플레이트	VWR Peqlab	732-2879	PCR 반응에 사용됩니다.
로우 프로파일 튜브 스트라이프 0.15 ml 플랫 캡 스트라이프	VWR Peqlab	732-3223	PCR 플레이트를 닫는 데 사용되는 캡 스트라이프.
Agarose	Peqlab	35-1020	겔 전기영동에 사용됩니다.
마이크로파	모든	NA
원추형 플라스크	모든	NA
측정 실린더	모든	NA
수평 전기 영동 장치 및 이빨이 있는 각 빗	모든	NA	아가로스 젤 전기 영동용.
전기영동 전원 공급 장치 PS3002	Life Technologies	NA
에티듐 브로마이드 용액 1 %	carlroth	2218.1	아가로스 젤용 염색조를 준비하는 데 사용됩니다.
포름아미드	carlroth	6749.1	SSCP 분석을 위한 변성 완충액에 필요.
Bromphenol blue	AppliChem	A3640.0010	아가로즈 젤 전기영동을 위한 로딩 염료에 필요합니다.
설탕	carlroth	4621.1	아가로스 겔 전기영동을 위한 로딩 염료에 필요합니다.
100 bp-DNA-Ladder extended	carlroth	T835.1	아가로스 겔 전기영동을 위한 크기 표준.
UV-문서화 시스템	Any	NA	겔 전기영동 결과를 시각화합니다.
Rotiphorese NF-아크릴아미드/비스 용액 40%(29:1)	carlroth	A121.1	폴리아크릴아미드 겔 제조용.
암모늄 퍼 옥시 디설페이	칼로스	9592.2	폴리 아크릴 아미드 겔의 제조.
폴드백 클립(32mm)	Any	NA	폴리아크릴아미드 겔 제조용.
사각형 모양의 플라스틱 상자 (21 > 6.5 × 5 cm)	모든	NA	폴리 아크릴 아미드 겔의 제조.
테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)	칼로스	23.67.1	폴리아크릴아미드 겔 제조용.
Beaker	Any	NA
RC 10 디지털 냉각기	VWR	462-0138	폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용한 SSCP 분석용.
수직 전기영동 장치 P10DS (OWL 분리 시스템)	VWR	700-2361	폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용한 SSCP 분석용.
노치 유리판	VWR	730-0261	폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용한 SSCP 분석용.
빈 유리판	VWR	730-0260	폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용한 SSCP 분석용.
스페이서	VWR	730-0262	폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용한 SSCP 분석용.
25개의 이빨이 있는 빗	VWR	730-0294	폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용한 SSCP 분석용.
쉐이킹 플랫폼	Any	NA	염색조의 지속적인 쉐이킹을 위해.
GelStar 핵산 염색제(Lonza Rockland, Inc.)	Biozym	850535 (50535)	폴리 아크릴 아미드 겔의 염색.
GenomeLab DNA 크기 표준 키트 400bp	AB Sciex	608098	자동 단편 분석용. 배치 B를 위한 크기 stanard.
GenomeLab DNA 크기 표준 키트 600bp	AB Sciex	608095	자동 단편 분석용. 배치 A를 위한 stanard 크기.
시료 로딩 솔루션 (SLS)	AB Sciex	608082	자동 단편 분석용.
시퀀징 플레이트 - 96 웰 폴리프로필렌 PCR 마이크로플레이트	Costar	6551	자동 단편 분석용.
플레이트 원심분리기, PerfectSpin P	VWR Peqlab	NA	미니 플레이트 원심분리기는 PCR 제품을 스핀다운하는 데 사용됩니다.
버퍼 플레이트 - 96 웰 EIA/RIA 투명 평면 바닥 폴리스티렌 처리되지 않음 마이크로플레이트	Corning	9017	자동 단편 분석용.
GenomeLab 분리 완충액	AB Sciex	608012	자동 단편 분석용.
분리 겔 - LPAI	AB Sciex	608010	자동 단편 분석용.
Sequenzer - CEQ8000 유전자 분석 시스템	Beckman Coulter	NA	자동 단편 분석용.
GeneMarker V1.95	Softgenetics	NA	자동화된 단편 분석 결과를 분석합니다.