자연스럽 게 여성 시리아 햄스터에 동작을 보람 있는 하는 동안 Extracellular 신경 전달 물질의 생체 내에서 변화를 측정

요약

이 문서 내용을 사용 하 여 탄소 섬유 전극 효소 바이오 센서 기술에 자연적인 보상 행동 동안 도파민과 높은 시간 해상도와 조미료의 릴리스를 측정 하는 고정 잠재력 amperometric 녹음의 사용은 여자는 햄스터

초록

신경 전달 물질 방출 빠른 시간 규모를 측정 하는 능력 수 있습니다 특정 동작 또는 조작;에 연결 될 neurotransmission의 패턴을 기본 메커니즘 및 회로 elucidating에 강력한 도구입니다. 측정 하는 뇌의 거의 모든 분석을 수십 년 동안 microdialysis의 기술을 사용 하는 동안이 기법은 시간적 해상도 제한 됩니다. 또는 빠른 검색 주기적 voltammetry가 이다 일시적으로 정확 하 고 매우 민감한; 그러나,이 기술적으로 어려운 방법 관심의 분석의 electroactivity에 의존, 때문에 nonelectroactive 물질 (예를들면, 신경 전달 물질 글루타민 산 염)를 검출 하는 가능성은 제거 됩니다. 이 종이 고정 잠재적인 amperometry 및 임시 정밀 electroactive와 nonelectroactive 신경 전달 물질을 측정 하는 효소 바이오 센 싱 결합 하는 턴키 시스템의 사용을 자세히 설명 합니다. 이러한 두 가지 강력한 기술을의 페어링를 비교적 쉽게 토 닉과 phasic neurotransmission의 측정에 대 한 허용 하 고 허용 하는 동시에 여러 신경 전달 물질의 기록. 이 원고의 목표는 도파민과 조미료 neurotransmission에서 비보에 표시의 궁극적인 목표와 여성 햄스터에 자연스럽 게 보상 행동 (즉, 성적 행동)을 사용 하 여 측정 하는 과정을 설명 하는 이 분석 결과 다른 행동과 실험 패러다임 검사의 기술적 타당성

서론

깨어 동작 동물에서 신경 전달 물질 방출 측정 하는 능력을 허용 한다 neurotransmission는 강력한 도구를 조사 메커니즘 및 모두 기본 회로의 공간 및 시간 패턴을 가진 특정 동작을 연결 하는 연구자를 자연 그리고 실시간으로 작동 동작입니다. 역사적으로, microdialysis 뇌¹의 세포 외 환경에서 모두 전기 반응과 nonreactive 물질 측정 하 고용 하고있다. 이 기술은 반 투과성 빈 섬유 막²의 팁과 작은 샤프트 구성 microdialysis 프로브를 통해 extracellular 액체에 유사한 이온 성분의 수성 해결책의 지속적인 흐름을 사용 합니다. 프로브 삽입 후 신경 전달 물질 또는 관심의 다른 analytes 수 있습니다 교차 반 투과성 막 이후 분석에 대 한 간격-고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 수집 되 고 전에 수동 확산에 의해 한 일반적으로, 별도로 활용 하는 분석 화학 기술 식별, 그리고 이질적인 혼합물³구성 요소를 계량.

Microdialysis 관심의 거의 모든 분석을 측정 하는 데 사용할 수 있는 중요 한 기술 이지만, 시간적인 해상도 수십 분^1,2분 순서 최대 샘플링 속도와 낮은. 빠른 스캔 주기적 voltammetry (FSCV), electroactive 종의 산화 환 원 잠재력에 의존 하는 기술 발명 extracellular 액체의 분석의 즉각적인 농도 근처 명료 수 있습니다. 간단히 (참조 로빈슨 외. ⁴ 광범위 한 검토를 위해), 전극 인상 하 고 낮은 전압 빠른 시간 규모⁴에 삼각형 웨이브 패션에 적용 됩니다. 전압이 올바른 범위에 있을 때 관심의 화합물은 반복적으로 산화 고 감소. 작은 교류 전류를 생성 하는 전자의 운동에이 산화 및 감소 결과. 산화 및 감소 마이크로초에 발생 하는 화합물의 초 규모 요금 걸릴 장소를 검색 합니다. 결과에서 프로브에 의해 만들어진 배경 현재 빼서 하나 현재 플롯 각 화합물에 대 한 전압을 생성할 수 있습니다. 전압 진동의 시간 규모 알려져 있기 때문에 이러한 데이터는 현재의 시간의 함수로 계산 하 사용할 수 있습니다. 따라서, 화합물의 상대적인 농도 각 산화에 전송 되는 전자의 수와 감소 반응⁴알려져으로 결정 될 수 있습니다.

이 화학 특이성 및 높은 시간 해상도 확인 FSCV vivo에서화학 농도 변화를 감지 하는 강력한 기술. 그러나, 이러한 매니폴드 장점에도 불구 하 고이 기술은 광범위 한 기술적 전문성과 고가의 장비 및 설치가 필요합니다. 또한, nonelectroactive 신경 전달 물질 (예, 조미료)이이 기술을 사용 하 여 측정 될 수 없습니다. 다행히도, 이러한 발명의 상용화로 서 전기 화학⁵의 분야에서 기술 발전 깨어 동작 동물에서 비 electroactive 신경 전달 물질을 측정 하는 비교적 간단한 방법 소개 했다 일시적인 정밀도는 기술을 타협 하지 않고 효소 바이오 센서 기술 이라고 합니다. 이 기술은 효소 변환을 사용 관심의 nonelectroactive 신경 전달 물질의 두 개의 기판으로 적용된 가능성^{5에 의해 생성 되는 amperometric 산화 현재로 감지 하는 과산화 수소 electroactive 중 하나는} . 상업적으로 이용 가능한 바이오 센서 프로브 생 interferents의 기여를 경쟁적으로 줄여 관심의 analytes를 측정 선택적으로 ( 그림 1참조). 조미료, 경우 일반적인 interferent ascorbic 산 (AA)의 기여는 경쟁적으로 감소 측정된 전류에 공동 electroactive 비 하 AA를 변환 하는 센서의 활성 효소 표면 산화 효소 AA 지역화 dihydroascorbate 그리고 물입니다. 또한, 부정 청구 Nafion 폴리머 레이어 효소 레이어에서 현재 생 음이온 화합물 제외합니다.

이 같은 바이오 센서 실험 설치 프로그램 electroactive 신경 전달 물질 FSCV에서 측정할 수 있지만 대신 고정 잠재력 기록⁶를 사용 하 여. 진동 전압 FSCV에 적용, 달리 고정 잠재력 기록에서 전압은 유지는 산화 환 원에 관심의 분석에 대 한 잠재적인. 여러 신경 전달 물질은 압도적으로 한 신경 전달 물질 쪽으로 왜곡 하는 뇌 영역에서 동일한 산화 환 원 잠재력, 있을 수 있습니다 FSCV 보다 덜 화학적 선택적 이더라도,이 접근의 턴키 자연 화학 물질의 부족을 능가 하는 것 특이성입니다.

모두 electroactive nonelectroactive 신경 전달 물질 릴리스에 거의 실시간으로 측정 하 고 특정 행동의 이벤트와 연결할 수 수렴 신경 전달 물질 자료를 검토 하는 기회를 제공 한다. 이 원고는 응답 깨어 동작 햄스터에 자연적인 보상으로 도파민, 조미료 neurotransmission가이 시스템의 사용을 자세히 설명 합니다. 이 문서의 목표는 다른 행동과 실험 패러다임을 조사 하기 위한 그것의 타당성을 보여주는 목표와 함께 여성 햄스터에 성적인 행동 중이 신경 전달 물질 자료를 측정 하는 과정을 자세히.

햄스터는 전기 녹음에 사용 하기 위해 이상적인 모델
역사적으로, 쥐 및 쥐 모델 성적 행동의 학문에 고용 되었다 있다. 이러한 설치류 종 귀 방도 추적 하 고 궁극적으로는 여성⁷을 탑재 하는 남성을 유혹 하 고 호핑, 다트를 포함 하는 수많은 여성 요청 동작을 관련 된 동적 copulatory 시퀀스에 참여. 남성 (또는 질 침투 없이)에 의해 장착 기간 동안 여성에에서 종사 하는 그녀의 성적 행동 자세 ( 절곡되 나) 또한 활성 요청 동작을 다시 시작 하기 전에 몇 초 동안만 단 몇 초 지속. 이 패턴의 부동성의 짧은 기간과 interspersed 활동의 높은 수준의 구성 문제의 측정 neurotransmission 동물 행동에 대 한 문제 이다. 첫째, 운동 유물 amperometric 녹음 신경 활동에 관련 되지 않은 수 있습니다. 둘째,는 운동 특정 뇌 영역에 특정 신경 전달 물질의 출시와 함께 연결 됩니다. 예를 들어 도파민 방출 등 쪽과 복 부가^8,9, psychostimulant에 따라 도파민의 microdialysis 측정을 위한 기초를 형성 했다 찾는 운동 활동 결합 되어 있다 관리¹⁰. 때문에 mos에 여성 일반적인 권유 동작어렵게 neurotransmission에 변화만 최근 공동으로 성적 행동의 명시적 구성 요소에 돌리다, t 설치류, 운동 활동의 높은 수준을 포함 하 고 10 분 성적 행동 테스트 일괄으로 표시 됩니다. 분입니다.

여성 성적인 행동의 neurochemical 프로필을 분석 하이 랩 종은 성적 행동을 동반 하는 최소한의 운전 활동을 추구. 시리아 햄스터 (Mesocricetus auratus)에 copulatory 시퀀스 neurochemical 녹음 권유 행동 일반적으로 쥐 및 쥐¹¹본의 부족에 이상적입니다. 결과적으로, 여성 햄스터 입력 하 고 테스트 세션¹²10 분 중 9 분 이상을 위한 절곡 자세 유지. 여성, vivo에서 외부 운동 운동의 부족으로 남자와의 성적인 상호 작용의 구성 요소와 연관 될 수 있는 전기 녹음을 얻을 수 있습니다.

햄스터에 copulatory 관찰
소개 후에 남성 자극 동물의 테스트 챔버로, 남성 그녀의 (그림 2A)를 탑재 하기 전에 여성의 anogenital 조사 (AI)에 처음 참여 한다. 위해서 탑재 하 남성, 여성 절곡, 그녀 그녀를 다시 아치 고 장착 남성 성 기에 대 한 액세스 그녀의 음부를 얻을 수 있도록 그녀의 꼬리를 굴절 이라고 받아들이는 성적 자세를 가정 합니다. 남성 여성, 두 발 (그림 2B), 그녀의 엉덩이 쪽을 clasping 탑재 하 고 성 기 수단 (그림 2C)를 얻기 위해 시도에서 밀어 시작 것입니다. 남성은 뿐만 아니라 여러 번 결국 루를 달성 하기 전에 intromit 마운트 (삽입) 없이 여성 것입니다. 마운트 및 사정에 지도 하는 intromissions의이 시퀀스 "copulatory 시 합" 이라고 불린다. 남성은 단일 세션 내에서 여러 copulatory 복싱을 있을 것 이다.

프로토콜

여기에서 설명한 모든 절차 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 미네소타의 대학에 의해 승인 되며 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 ¹³ .

1. 동물과 Cannulation 수술

나이의 대략 55 일에 일반적인 동물 공급 업체에서

1. 받기 시리아 햄스터.
   참고: 다양 한 실험적인 패러다임의 제약으로 인해 동물의 나이 다르지만 성적 행동에 대 한 그것은 성적으로 성숙 동물을 모두 대략 같은 나이 얻기 위해 중요 한.
2. 집 동물 제어 온도 (22 ° C)와 (14 h 빛 뒤에 10 h 13시 h 소등 어두운) 조명 환경, 음식과 물을 사용할 수 있는 광고 libitum 제외 하 고 실험 테스트의 기간 동안.
   참고: 햄스터 계절 재현, 이후이 14시 10분 명암 주기 싫어 하지 그들의 자연 번 식 조건.
3. 는 1 주일 새 환경 순응 실험실에, 다음과 같은 무 균 양자 ovariectomies 및 intracranial stereotaxic cannulations (예를 들어, pentobarbital), 전신 마 취하에 수행 하 고 관리할 적절 한 제도 승인 수술 후 진통제 및 항생제 치료로 설명한 ^{14 , 15}.
   참고: 성적인 행동의 연구를 위해 ovariectomies은 동물 실험 일정에 따라 외 인 호르몬과 성적 감수를 균일 하 게 유도 될 수 있다 성 호르몬의 주요 생 소스를 제거 하는 데 필요한.
   1. Dopaminergic와 glutamatergic 프로브 이식에 대 한 stereotaxically 임 플 란 트 가이드 cannulae (0.7 m m 직경; 그림 3) 관심의 영역으로 (예를 들어,이 실습 대상 바로 핵 accumbens (NAc)) ¹⁵ stepwise 세부 다른 곳에 설명 된 대로.
      참고: 비록 동물 당 1 개의 조미료 또는 도파민 프로브의 단일 센서 녹음에서 제시 하는 데이터는,이 시스템 수 있습니다 단일 동물; 최대 4 센서 동시 녹음에 대 한 따라서, 1-4 cannulae 원하는 실험 설계 및 결과 따라 이식 될 수 있었다.
      1. Stereotaxic atlas를 사용 하 여 관심 영역의 이식 좌표 결정 (예를 들어, 골든 햄스터 두뇌 Morin에 의해 & 나무), 센서 뇌 조직으로는 정 아래 1 m m를 확장 하는 마음에 유지.
   2. 는 정 stereotaxically 복 부 등의 원하는 위치에 낮춘 다, 후 치과 아크릴, 스테인리스 뼈 나사와 플라스틱 머리 확보에서 건설 하는 모자를 사용 하 여 두개골에 부착 마운트 ( 그림 3 ; ¹⁵ 대 한 자세한 내용은 참조).
   3. 탄소 섬유 테스트용 contralateral 반구에 (350 μ m 직경, 길이 7.5 m m) 기준 전극 삽입.
      참고: 특정 위치 또는 거리는 정에서 필요; 하지 않습니다. 참조 전극 편리 contralateral 반구에서 어디 든 지 놓일 수.

2. 바이오 센서 및 탄소 섬유 테스트

1. 수술에서 회복의 1 주, 다음 성적 감수 유도 호르몬 못쓰게 처방 관리.
   1. Estradiol benzoate 면 화씨 기름 0.1 ml에서의 10 µ g을 피하 주사 (사우스 캐롤라이나), 약 48 h와 테스트, 성적 감수 남성 ¹¹ 쪽으로 유도를 하는 성적 행동에 앞서 24 h.
   2. 면 화씨 기름, 사우스 캐롤라이나, 성적 감수 ¹¹ 유도 남자의 소개 이전에 4 h의 0.1 ml에서 황 체 호르몬의 주사 500 µ g.
2. 설치류의 사회적 행동 흰 빛과 붉은 빛 조건 ^{16 , 17} 테스트에서 변경 될 수 있습니다으로 그들의 매일 주기의 어두운 단계의 시작에서 모든 동물 테스트 ^{, 18}.
3. 효소 바이오 센서 조미료 테스트, 센서에는 생체 외에서 ( 그림 4) ^{15 ,} 이전에 설명 된 대로 사용 하기 전에 보정 ¹⁹.
   1. 게 보정 솔루션 20 mL 유리에서 테스트의 날에 신선한 원심 관. 분석 솔루션에 대 한 부드럽게 튜브를 거꾸로 하 여 7.4 m g L-글루탐산의 울트라 순수 H ₂ O의 10 mL에 녹. 매우 순수한 H ₂ o.의 10 ml에서 176.1 mg AA를 용 해 하 여 interferent 솔루션으로 만들기
   2. 설정 기본 랩 링 스탠드의 기지에는 자력을 배치 하 여 교정 자력, 위에 20 mL 외피 비 커를 배치 하 고 중간 2 단자 클램프를 사용 하 여 장소에 클램프.
      1. 추가 자석 저 어 바와 100 m m 인산 염의 20 mL 외피 비 커에 식 염 수 (PBS)를 버퍼링. 37 버퍼 솔루션 열 순환 물 목욕에 외피 비 커를 연결 ° c.
         참고: 효소 바이오 센서 교정에서 수행 해야 체온 때문에 효소 활동은 온도 의해 영향을 받습니다.
   3. 외피 비 커 위에 센서 캘리브레이션 홀더를 배치 하 고 4 채널 교정 프리 앰프 위에 직각 클램프를 사용 하 여 장소에 보안 설정. 기록 캘리브레이션 데이터를 데이터 컨디셔닝 및 수집 디바이스는 프리 앰프 연결.
   4. 교정 홀더 꼭대기에 프로브를 배치 하 여 실험 녹음 하기 전에 조미료 (또는 다른 상업적으로 이용 가능한 바이오 센서 프로브 예, 포도 당에 대 한 관심의 다른 analytes) 각 효소 바이오 센서의 감도 테스트를 자 켓된 비이 커, 감지 캐비티와 염화는 (AgCl) 참조의 일부 물속 버퍼 솔루션에 연결 합니다.
   5. 4 채널 교정 프리 앰프에 포트 테스트 (4)까지 각 센서를 연결 하기 전에 무료 다운로드 수집 소프트웨어를 활용 하 여 컴퓨터 인터페이스에 새 녹음을 시작. 안정적인 기준선에 도달 센서 허용.
   6. 센서 안정 기준선에 도달 실정이 주사를 추가 시작. 교정 홀더에서 구멍을 사용 하 여 버퍼 솔루션에 피 펫 팁을 소개. 레코딩 소프트웨어에서 빠른 키 주석 도구를 사용 하 여 주석을 주사 될 때. 버퍼 솔루션에 분석 솔루션의
      1. pipetting 40 여 조미료의 만들 10 µ M 추가 μ. 센서 추가 사이 안정화를 기다립니다. 분석 솔루션의 3 주사 interferent AA 솔루션 (250 μ M 변화 농도에 대 한 50 μ 주입 볼륨)에서 단일 주사를 추가 하기 전에 추가.
         참고: 경우 보정 조미료 농도 변화 (2.12 단계에서 효소 실험 기록 중 본) amperometric 신호에 변화 변환할 수 있다. 단계적 교육에 대 한 참조 ¹⁵를 참조 하십시오. Dopaminergic 프로브가이 실험실에서 사용 되는 상업적인 공급자에 의해 제조 과정에서 보정 됩니다. 그들의 감도 효소 구성 요소 저하 ¹⁹ 시간이 지남에 줄일 수로 사용 시 조미료 프로브를 보정 해야 합니다. 탄소 섬유 전극 저하를 받아야 하지 않습니다, 때문에 이전에 선적 회사에 의해 수행 하는 교정 만으로는 따라 t로여기는 추가 처리를 통해 얇은 탄소 섬유 (350 μ m 직경) 손상의 증가 가능성.
4. 침구 동물에서 가져온 테스트 챔버를 라인 ' s 홈 케이지.
   참고:이 여성 증가 ' s 친숙 테스트 챔버, 뿐만 아니라 여성 estradiol 치료에 대 한 응답에서에 의해 배 부 되었다 후 각 짝짓기 신호를 성적으로 자극 하는 남성 노출.
5. 가볍게 isoflurane 또는 다른 휘발성 마 취 유도 실에서 프로브 삽입 전에 동물을 anesthetize.
6. 가이드 정에서 폐색 obdurator를 제거 하 고 탄소 섬유 전극 또는 가이드 샤프트를 통해 효소 프로브 삽입.
7. 프로브 삽입 후 테스트 챔버에 동물 놓습니다.
   참고:이 실습 사용 10 갤런 유리 수족관 (24.5 x 48.9 x 29.4 cm), 하지만 같은 영역의 둥근 약 실 또한 고용 수 있습니다.
8. 상용 소프트웨어 프로그램, 비디오 및 시간 고정 amperometric 신호를 기록 하는 시작에에서 대해서 자세히 설명 다른 ¹⁵.
9. 녹음 시스템에 센서가 연결: 전기적 차폐 된 케이블 및 전기 회전을 통해 potentiostat. 헤드 마운트에 핀 첨부를 속이 고 하 여 센서 연결을 고정 시켜야 합니다. 필요한 경우 랩 필름을 사용 하 여 연결을 강화.
   참고: 사용자 지정된 연결선 탄소 섬유 전극과 참조 전극에 연결할 potentiostat, 효소 조미료 센서는 potentiostat에 직접 연결 될 수 있습니다 하는 동안 필요 하다.
10. 허용 실험 테스트 하기 전에 두뇌에 있는 equilibrate를 센서.
    참고: 평형 시간 기록 센서 마다 다릅니다 (예를 들어, 효소 센서 필요 2-4 h 평형, 탄소 섬유 전극만 약 30 분을 필요로 하는 동안). 두 종류의 센서를 이식 하는 경우 장시간 효소 센서에 대 한 equilibrate.
11. 센서 평형 후 테스트 챔버로 자극 남성 소개.
12. 실험 목표에 따라 추가 10-30 분에 대 한 녹음을 계속 자극 남성에 의해 성 기 삽입 (불리 수단)와 첫 번째 산 다음.
13. 여성 분리 행동 테스트, 다음 ' s 센서.
14. 테스트 약 실에서 두 햄스터를 제거합니다. 침구를 제거 하 고 70% 에탄올을 사용 하 여 챔버 청소.
    참고: 때문에 탄소 섬유 녹음에 필요한 간단한 평형 단계 2.3 2.14 같은 날에 여러 동물 테스트를 반복할 수 있습니다. 효소 센서에 필요한 평형의 약 4 h, 때문에 동물의 차이로 인해 가능한 간 주제 변화를 제한 하는 일 당 하나의 동물을 테스트 하는 반면, ' 테스트에서 circadian 시간.

3. 희생과 관류

1. euthanizing 에이전트와 함께 여성 테스트 주제 anesthetize 깊이 테스트 기간에 따라 (예를 들어이 실험실 0.2 mL phenytoin pentobarbital 솔루션의 복 주사를 사용 하 여) .
2. Transcardially perfuse 25 mM PBS, pH 7.6, 다음 20 분 고정 4 %paraformaldehyde-PBS를 사용 하 여 모든 순환 혈액 제거와 동물.
3. 두뇌를 제거 하 고에 후 위 ~ 30 mL 50 mL 원뿔 튜브를 하룻밤에 4 %paraformaldehyde 솔루션의. 직렬 섹션 준비까지
   1. 스토어는 10%에서 뇌 자당 PBS 솔루션.
      참고: 두뇌 저장 될 수 있습니다 2-주, 오염 물질의 잠재적인 성장을 방지 하기 위해 매주 자당 솔루션 변경.
4. 직렬 섹션 40 µ m에 뇌 동결 톰으로 이식된 영역을 통해 조각 또는 cryostat 앞에서 설명한 ¹⁹.
5. 상용 접착제 코팅 슬라이드에 분할 영역을 순차적으로 탑재 (또는 ²⁰을 참조). 적어도 하룻밤 건조 허용.
6. 얼룩, cresyl 보라색 염료와 슬라이드 및 coverslip 앞에서 설명한 ²⁰.
7. 이미지 센서의 해 부 위치를 확인 하려면 밝은 분야 현미경 검사 법을 사용 하 여 슬라이드.

4. 행동 코딩

1. 보기 무료 상업적으로 다운로드할 수 있는 소프트웨어를 사용 하 여 비디오에 주석을 추가 하 고 (재료의 표 참조) 정확 하 게 코드 동작 시간-amperometric 신호에 잠겨 슬로우 모션에서.
   참고: 분석에서 MATLAB 코드를 사용 하 여 (참조 ), 시작 및 끝 각 여성 주석 ' s와 남성 ' s 행동.
2. 여성 그녀의 dorsoflexion를 시작 하 고 그녀의 꼬리를 위쪽으로 결함 때 프레임에서 주석 startLordosis
   . 여성 여성 테스트 실에서 다른 위치로 readjusts 때 자주 발생 하는이 자세를 종료 되 면 endLordosis 주석.
   1. 주석을 startAI 여성 절곡 자세에서 이며 남성 여성 쪽으로 그의 주 둥이 이동 ' s anogenital 지역, 스니핑, 사슬, 또는 그녀의 교장의 쾌 감 발생할 수 있습니다. 남성은 여성에 가까운 근접에서 그의 주 둥이 제거할 때 endAI 주석을 ' s anogenital 지역.
   2. 남성에 접근 하 고 그의 forepaws 마운트 시도 (예를 들어, 측면, 엉덩이)의 방향에 장착 자세에서 여성에 배치 하는 때 startMount를 주석을.
   3. 주석을 startIntromission 성공적인 밀어 여성에 탑재 된 남성 성 기 액세스를 얻을 때 ' s 질.
      참고: 한 수단은 행동 탑재 밀어 남성 가시 그의 몸으로 그의 위 사지를 끌어, 앞으로, 그의 골반을 thrusts 및 침투를 나타내는 그의 꼬리를 위쪽으로 컬로 수단, 이전 발생 하 구별 (참조 < 강력한 클래스 "xfig" = > 그림 4 C).
      1. 해당 하는 경우 주석을 루.
         참고: 짝짓기 시 합을에 함께 성공적인 수단, 남성은 사정 됩니다. 하나는 실제 방출 시각화 수, 남자 햄스터는 주석을 발 운동의 발생에 루는 수단 ²¹, 동안 그들의 뒷 발 움직임 속에 따라서 특성.
   4. 남성과 그의 앞 두 발을 제거 했다 따라서,가 여자와 접촉 하는 때 endIntromission 및 endMount 프레임에 동시에 주석. 시각화를 자주 못하는 때문 그의 철수, 동시 관찰 짝짓기에 걸쳐 일관성과 신뢰성에 대 한 수 있도록 이러한 두 가지 동작이 코드.
      참고: 짝짓기 시 합 다음과 성공적인 사정 또는 여성 하나 이상 탑재 다음 절곡 자세 휴식 때.

5. 예제 데이터 분석

참고: 도파민에 대 한 고정 잠재력 탄소 섬유와 효소 녹음의 사용을nd 조미료, 각각, 강장제 및 전기 릴리스의 phasic 패턴을 측정 하는 능력에 대 한 수 있습니다. 이 연구소는 무료, 상업 수집 시스템을 사용 하 고 기록 하 고 변환 소프트웨어 기록 아날로그에서 디지털으로 신호 (바이어스 0.600 V, 샘플링 속도 = 1 Hz).

1. 예제 데이터 분석 프로토콜의 설명
   1. 다른 프로그램을 사용할 수 있지만 계량 강장제 및 MATLAB을 사용 하 여 기록 된 전기 신호에 phasic (과도) 변화.
      1. 제시 데이터에 대 한 토 닉 신호 50 포인트 이동 평균 필터를 사용 하 여 계산. 신호의 과도 전용 정규화 된 표현 원시 데이터에서 토 닉 신호를 빼서 계산 됩니다. 다양 한 알고리즘 옵션 있다 phasic 봉우리를 식별 하는 경우 (예를 들어, 변경으로 1 보다 더 많은 신호에 봉우리를 라벨 평균 위에 SD).
      2. 식별이 봉우리, 즉, 로컬 맥시 마의 위치, 정규화 된 신호에서 신호의 제곱 평균 설정 최소 피크 진폭 MATLAB 함수 peakfinder를 사용 하 여. 정규화 된 신호에서 감지 하는 봉우리의 위치에서 각 피크 진폭 추출에 사용 되었다. 와, 또는 상대 피크 neurochemical 조사에서 운전 수 시간 동기 행동의 식별에 대 한 봉우리를 검색할 수 있습니다.
   2. 행동 주석 (3 단계 참조)에 따라 처리 된 데이터 세그먼트, 학생 ' s t-테스트 토 닉 신경 전달 물질 수준, 과도의 발생의 진폭의 차이 평가 하는 데 사용 했다 복싱 짝짓기 하는 동안 절곡 대 절곡 미리 짝짓기 시 합 중의 과도 전기 방출의 토 닉 패턴에 변화를 측정, 하 절곡 위치 (즉, 미리 짝짓기 시 합 lordosis) 짝짓기 시 합 전에 직접 동안 발생 하는 데이터 요소 짝짓기 시 합 중 데이터 요소에 비교 했다 t-테스트를 사용 하 여 세션
2. 설명된 데이터 분석 프로토콜에 대 한 원시 데이터의 준비
   참고: 명시 된, 있지만 다른 프로그램 또는 분석 될 수 있습니다 동등 하 게 가능한 옵션, 위에서 설명한 MATLAB 코드를 사용 하려면 원시 데이터를 준비 해야 합니다에 다음과 같은 방법으로:
   1. 주석 및 전압 파일 내보내기. 이렇게 하려면, 아래는 ' 파일 ' 탭을 선택은 ' 수출 ' 작동 하 고 선택는 ' 주석 ' 주석을 저장을 탭. 아래는 ' 파일 ' 탭을 선택은 ' 수출 ' 작동 하 고 선택는 " TSV ' 전압 측정 TSV 확장 파일로 저장을 탭.
   2. 스프레드시트 프로그램으로 각 파일 열기 및 다른 이름으로 저장 ' xls/xlsx ' 파일 MATLAB과 호환 수 있도록.
      : 참고는 ' 주석 ' 파일, 추가 수동으로 해야 하는 주석 추가 후 수출 스프레드시트 프로그램을 시작 및 끝 (PreMBlordorsis 주석이 달린 두는 미리 짝짓기 시 합 절곡의 지시에 )와 짝짓기 시 합을 했 듯이이 시간 포인트 직접 비교 될 수 있다 단계에서 5.1.2.
   3. 절곡 동작 또한 (startLordosis)을 시작으로 동시에 미리 짝짓기 시 합 절곡 (startPreMBlordosis)의 시작 주석을 탑재 동작을 포함 하 고 또한 새로운 것의 시작에 짝짓기 가릴 경우 여성 절곡 자세 유지.
   4. 시작 처음 탑재 될 때 미리 짝짓기 시 합 절곡 (endPreMBlordosis)의 끝에 주석을.
   5. 이 짝짓기 시 합 시작을 의미 하는 대로 endPreMBlordosis의 동시에 짝짓기 시 합 (startMB)의 시작을 주석을.
   6. 는 탑재 루를 포함 하는의 끝에 짝짓기 시 합 (endMB)의 끝에 주석을 (단계 4.1.4.1 참조), 또는 다음 여성 ' 절곡 자세 (endLordosis)의 s 종료.

결과

전기 화학 및 코딩 방법론 위에서 설명한 동작을 사용 하 여,이 연구소는 vivo에서 성적인 행동의 기록 중 토 닉과 도파민에 조미료 phasic 변동 특성 하기 시작 했다. 이 방법론의 일시적으로 정확한 방식으로 인해 우리 보다 정확 하 게 성적인 행동; 동안 neurotransmission을 특성 수 있습니다. 뿐만 아니라 개별 copulatory 동작 (예를 들어, 수단, 사정)의 여성의 접수 기간 동안 짝짓기 관찰 하 고 해당 과도 변동 하는 동안 해당 토 닉 변경 릴리스 패턴에 특정 변화를 돌리다 장착 남성.

특히, 우리는 도파민과 별도 동물의 NAc에 조미료의 릴리스 패턴 측정에 초점이 방법론을 사용 합니다. NAc²² 처리 보상에 관련 된 중요 한 지역 이며, 성적 행동

토론

비록 비교적 간단 하 고,이 기술을 채용 하는 경우 몇 가지 문제가 발생할 수 있습니다. 첫째, 조사의 stereotaxic 배치 정확 해야: microdialysis 샘플 조사를 둘러싼 extracellular 환경에의 더 넓은 반경, 달리이 기술은 허용 직접 접촉으로 오는 신경 전달 물질의 측정 와 조사. 둘째, 섬유의 작은 폭으로 인해 탄소 섬유 녹음의 경우 파손 발생할 수 있습니다, 그리고 신중한 주의 프로브를 삽입 해야 합니다. Glutamatergic 바이오 센서의 경우 효소 저하는 프로브 3 주 보장된 기간 내 사용 하지 않은 경우 발생할 수 있습니다. 다행히도, 이러한 모든 문제는 주소 지정, 그리고 적절 한 주 및 세부 사항에 주의 함께 삭제 될 수 있다.

잠재적으로 문제가 있는 경고 고정 잠재력 탄소 섬유 녹음의 특이성에 발생합니다. 녹음은 모두 신경 전달 물질을 릴리스 하는 영역에서 만들어진 경우 도파민에 대 한 적용된 가능성 노르, 같은 다른 monoamin...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Nembutal	오크 제약 Inc.	76478-501-50	펜토바르비탈 나트륨 주사제, USP. 이 실험실은 체중 8.5mg/100g을 사용하여 페로틴 내 주사를 사용합니다.
Loxicom 진통제	노브룩 연구소	6451603670	NSAID는 수술 후 통증 조절에 사용되는 항염증 및 진통제입니다. 일반: meloxicam.
엔로플록스 항생제	노브룩 연구소	5552915411	수술 후 감염 예방을 위한 플루오로퀴놀론 항생제. 제네릭: 엔로플록사신.
뷰타나시아-D	Merck Animal Health	00061047305	펜토바르비탈 나트륨, 페니토인 나트륨 안락사제.
뼈 나사	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	1/8" 뼈 나사 (Pkg. 16)는 두개골 캡을 두개골에 고정하는 데 사용됩니다.
치과용 아크릴 (Bosworth Duz-All)	Bosworth	166261C	자체 경화 치과 용 아크릴은 캐뉼라를 고정하고 두개골에 헤드 마운트를 부착하기 위해 두개골 캡을 구성하는 데 사용됩니다.
하드웨어 바이오센서 설정	피나클 테크놀로지스, Inc.	8400-K2	피나클은 쥐용 테더링 바이오센서 시스템의 신규 사용자를 위한 완벽한 하드웨어 키트를 제공합니다. 키트에는 정류자, 프리앰프, 데이터 컨디셔닝 및 수집 시스템이 포함되어 있습니다.
기본 비디오 컴퓨터 패키지	Pinnacle Technologies, Inc..	9000-K1	기본 컴퓨터 패키지에는 충분한 하드 디스크 저장 공간, 고화질 모니터, 키보드 및 마우스, 무정전 전원 공급 장치 및 필요한 모든 케이블이 있는 사전 구성된 컴퓨터가 포함되어 있습니다.
비디오 EQ700 EverFocus 카메라  패키지	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K10	독립적인 IR 소스가 있는 EQ700 야간 투시경 가능 박스 카메라는 Pinnacle 비디오 컴퓨터 패키지의 일부로 획득했습니다. 돔 카메라(9000-K9) 및 HD 카메라(9000-K11) 옵션도 사용할 수 있습니다.
Sirenia 인수 소프트웨어	Pinnacle Technologies, Inc.	무료 - pinnaclet.com Sirenia에서 다운로드 가능	Acquisition은 모든 Pinnacle 하드웨어 시스템의 데이터를 기록하기 위한 단일 플랫폼을 제공합니다. 이 소프트웨어는 모든 데이터 스트림의 동기화, 사용자 구성 가능한 설정, 데이터 통합 및 다중 내보내기 옵션을 제공합니다. 또한 이 소프트웨어에는 바이오센서 기록을 위한 기본 검토 및 분석 모듈이 포함되어 있습니다. 시레니아  데이터 수집 및 검토에 이상적인 무료 LL-in-One 소프트웨어를 제공합니다.
묶인 쥐  시험관에서  교정 키트	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-베이스	바이오센서에 의해 측정된 현재 변화를 분석물 농도의 실제 변화와 관련시키려면 동물에 이식하기 전에 바이오센서를 보정해야 합니다. 이 프로세스는 또한 센서의 무결성과 선택성을 확인합니다.  보정 키트에는 20 mL 재킷 비커(#7058), 1/2" x 1/8" 자기 교반 바(#7059), 직각 클램프(#7056), 2핀 단일 조정 클램프(#7055), 4채널 보정 프리앰프(#7053) 및 보정 홀더(#7051)가 포함되어 있습니다.
젓는 접시	Corning	6795-410D	Corning 디지털 교반기, 5" x 7", 120 VAC는 글루타메이트 바이오센서의 in vitro 보정 중에 재킷 비커에서 자기 교반기를 회전시키는 데 사용됩니다.
폐쇄 루프 순환이 가능한 수조	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L 표준 디지털 가열 순환 수조, 120VAC 수조는 플라스틱 튜브와 함께 사용되어 자켓 비커를 생리학적 온도로 가열했습니다.
BASi rat cannulae	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	도파민 신경 전달을 기록하는 데 사용되는 탄소 섬유 전극.
Ag/AgCl 기준 전극	Pinnacle Technology, Inc.	7065	탄소 섬유 녹음에 필요합니다.
글루타메이트 바이오센서	피나클 테크놀로지, Inc.	7001	글루타메이터성 신경 전달을 기록하는 데 사용되는 효소 바이오센서 프로브.
BASi 가이드 cannulae	Pinnacle Technologies, Inc.	7030	프로브를 안내하기 위해 관심 있는 뇌 영역에 이식된 가이드 캐뉼러.
쥐를 위한 BASi 캐뉼라 플라스틱 헤드피스	피나클 테크놀로지스, Inc.	7011년	헤드마운트는 프로브를 안정화하고 potentiostat에 부착합니다.