방법 논문

수동 선명도 삭제 마우스 난소의 혈관 구조의 3 차원 재구성

DOI:

10.3791/56141

⸱

2017년 12월 10일

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Medicine and Neurobiology, School of Basic Medical Sciences; Institutes of Brain Science, Brain Science Collaborative Innovation Center, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Institute of Acupuncture and Moxibustion, Fudan Institutes of Integrative Medicine, Fudan University, 2Program of Reproductive and Stem Cell Biology, Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine, Stanford University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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여기 우리는 그대로 마우스 난소에서 수동 선명도 난소 맥 관 구조 및 follicular 모세 혈관의 시각화를 위한 3D 재구성 방법의 적응을 제시.

초록

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난소는 여성의 생식 시스템의 주요 기관 이다 하 고 여성 gametes의 생산에 대 한 복잡 한 구조 관계와 3 차원 (3D) 맥 관 구조 아키텍처의 내 분 비 시스템을 제어 하기 위한 필수적 이다는 난소는 잘 기술 된다. 3D 연결과 그대로 난소에 혈관의 아키텍처를 시각화 하기 위해 첫 번째 중요 한 단계는 광학 투명 난소를 만드는 것입니다. 피하 조직의 수축, 우리가 사용 하는 하이드로 겔 고정 기반 수동 선명도 (아크릴 때 교배 고정 취소 지질 교환 이미징 / Immunostaining/에서 제자리 교 잡-호환 조직 히드로) 메서드는 그대로 난소를 프로토콜 . Immunostaining, 고급 multiphoton confocal 현미경 검사 법, 그리고 3D 이미지 복원 다음 난소 혈관 및 소 낭 모양 모 세관의 시각화를 위해 사용 되었다. 이 방식을 사용 하 여, 우리는 상당한 긍정적인 상관 관계 보였다 (P < 0.01) follicular 벽의 볼륨과 follicular 모 세관의 길이 사이.

서론

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여 포는 난소의 기본적인 구조상과 기능 단위 이며 그 개발 높은 난소 내에서 맥 관 구조에 관련 된. 혈관 영양과 모 낭에 호르몬을 공급 하 고 따라서 성장과 낭1의 성숙에 중요 한 역할.

선택적 혈관 마커, 유전자 변형 마우스 모델 및 제약 개발을 포함 하 여 기술의 조합 난소 혈관 네트워크, 신생, 혈관의 기능에 대 한 우리의 지식을 증가합니다 folliculogenesis입니다. 난소는 그것 folliculogenesis와 배 란 기간 동안 다양 한 조직 및 혈관 네트워크를 개장 하기 때문에 활성 장기로 알려져 있다. 혈관의 구조와 크기에 이러한 활성 개장 하는 것은 개발 및 낭의 생물 학적 기능을 위한 필요 이다.

난소 및 혈관의 immunolabeling를 사용 하 여 전통적인 조직학 및 histomorphometric 메서드는 2 차원 (2D) 이미지2. 3 차원 (3D) 재구성 기술 개발 조직 조각의 2D 이미지 3 차원 구조를 만들기 위해 중첩 수 있습니다 하지만이 방법은 여전히 몇 가지 한계가-조직의 단면 마이크로 구조의 일부를 파괴할 수는 조직, 자주 그리고 상당한 노동은 조각에서 얻은 이미....

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프로토콜

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동물 주제와 관련 된 모든 절차에서 상해 의학 대학, 복 단 대학 (승인 번호 20160225-013) 동물 윤리 위원회의 지침에 따 랐 다.

1입니다. 투명 마우스 난소의 준비

  1. 솔루션의 준비
    1. 준비 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션 (1 M, pH 7.6) 0.1% 트라이 톤 X-100 (PBST). 10 x PBS 재고 솔루션 1 L을 혼합 87 g의 NaCl, NaH2포4 · 3.1 g 2 H2O, 그리고 나2HPO4 ·12H2오의 28.7 g dH2O L 1과 볶음 ~ 2 h. pH 7.4에 조정 1 N NaOH를 추가 하 고 상 온에서 저장. 1/10이 10 배 재고 솔루션을 희석 0.1% 이며 dH2O를 사용 하 여 PBS에 트라이 톤 X-100.
    2. Mixings 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA) 솔루션, 4% (wt/vol) 아크릴, 0.05% (wt/vol) bisacrylamide, 및 0.25% (wt/vol) VA-044 초기자 두 번 증 류 물 얼....

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결과

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우리는 수동 난소 follicular와 혈관 구조를 보존 하 고 혈관과 모 낭의 레이블이 표시에서 높은 형광 신호를 취득 하는 동안 지우기에 대 한 신속 하 고 간단한 방법으로 수동 선명도 메서드를 적응. Follicular 맥 관 구조의 3D 아키텍처 CD31, 내 피 세포6표식에 대 한 immunostaining에 의해 결정 되었다. 필 라 멘 트 알고리즘을 사용 하 여 및 follicular 모 세관 및 기본 및 보조 모 공 (그림 1) 사이의 상호 관계를 보여주었다 CD31 성인 쥐의 난소에 얼룩 추적 했다.

티로신 hydroxylase immunostained oocytes granulosa와 thecal 층을 감지 하 고 낭7.......

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토론

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현재 연구에서 선물이 3D 이미징 모세 혈관과 개별 성장 낭 사이의 관계를 평가 하기 위해. 우리의 이전 작품에서는 동일한 프로토콜 9를 사용 하 여, 우리는 큰 맥 관 구조, 모 공, 그대로 마우스 난소에서 난 포의 위치 사이 상호 작용의 역할을 공부 했습니다. 수동 선명도 접근 수 마이크로 및 매크로 vasculatures, folliculogenesis, corpora lutea의 다른 발달 단계에서 난소 아키텍처를 재구성으로 낭도 간의 상호 관계를 공부 하 고 있었습니다.

데이터를 얻기 위해 3D 이미지 그대로 직물의, 개간 과정은 중요 한 첫걸음 이다. 두 가지 주요 전략-탈수 방법 및 수동 선명도10같은 친수성의 시 약-기반 방법. 탈수 방법 종종 형광 신호 감소 이어질 종종 독성 유기 솔루션 폐기물 생산 때문에 우리는 다양 한 조직 유형으로 사용 하기 위해 수동 선명도 방법의 몇 가.......

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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이 연구는 초나라에 대 한 중국 특별 기금에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (YF No. 2014T70392), 국립 자연 과학 재단의 중국 YF (No. 81673766), 새로운 교사를 못쓰게 기금, 복 단 대학의 Zuoxue 재단 및 개발 상하이 최대 분야 통합 의학 (20150407)의 프로젝트.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아크릴아미드Vetecv900845http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845
Alexa Flour 488 (희석 1:50) Life TechnologiesA11039https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039
Alexa Flour 594 (희석 1:50)Life TechnologiesA11012
https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 비사크릴아미드Amresco172http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx
검은 벽 유리 바닥 접시 (Willco-Dish)Ted Pella14032http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall
붕산Sinopharm 화학 시약10004818 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818
인산수소 나트륨 (Na2HPO4 12H2O)Sinopharm 화학 시약10020318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318
FocusClearCelexplorerFC-102http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1
ParafilmBemisPM996http://www.parafilm.com/products
ParaformaldehydeSinopharm Chemical 시약80096618
http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 PECAM1/CD31, 혈소판-내피 세포 접착 분자 1 (희석 1:10)Abcamab28364
http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html 광개시제 VA044Wakova-044/225-02111
http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm 아지드화나트륨그마S2002http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US
염화나트륨(NaCl)시노팜 화학 시약10019318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318
인산이수소나트륨(NaH2PO4 2H2O)Sinopharm 화학 시약20040718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718
나트륨 도데 실 설페이트Sinopharm 화학 시약30166428http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428
수산화 나트륨 (NaOH)Sinopharm 화학 시약10019718
http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 Triton X-100Sinopharm 화학 시약30188928http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928
티로신 하이드록실라제 (TH, 희석 1:50)Abcamab76442http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html
시

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
  2. McFee, R. M., et al.

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