셀 무료 녹음 방송 번역 플랫폼의 새로운 세대 생화학 시스템에 생체 외에서 유전자 회로 실행을 통해 구성 설계 되었습니다. 이 문서에서는, 우리는 모든 대장균 세포 무료 TXTL 시스템을 사용 하 여 그들의 게놈에서 살 균 소 MS2, ΦΧ174, T7, 등는 합성 하는 방법을 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
셀 무료 전사-번역 (TXTL) 시스템, 더 큰 다양성 및 모듈화, 테스트 튜브 반응에서 기초 및 응용 과학을 수행 하기 위해 새로운 기능을 제공 하기 위해 설계 된의 새로운 세대. 지난 10 년간, TXTL 셀 무료 소설 종합 연구 분야 관련된 양적 및 합성 생물학의 광범위 한 범위에 대 한 강력한 기술 되고있다. 새로운 TXTL 플랫폼은 생성 하 고 합성 또는 자연 유전자 회로 실행을 통해 생화학 시스템 심문 특히 유용 합니다. 생체 외에서 TXTL 입증 정리로 빠르게 프로토 타입 규제 요소와 뿐만 아니라 생물 네트워크에 편리한 메커니즘 생활 시스템에서 발견 하는 자기 조립 분자. 이 문서에서 설명 하는 어떻게 전염 성 살 균 소, 등 MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA), 그리고 T7 (dsDNA), 전적으로 모든 대장균, 셀 프리 TXTL 시스템을 사용 하 여 한 냄비 반응에 그들의 게놈에서 합성 됩니다. 3 coliphages의 합성 상 패 분석 결과 사용 하 여 정량 이다. 우리는 합성된 살 균 소의 수확량 반응의 생 화 확 적인 설정에 따라 결정 하는 방법을 보여줍니다. 던지다 8000의 제어 집중을 통해 에뮬레이션 분자 크롤 링, magnitudes의 명령에 의해 합성된 페이지의 금액에 영향을 줍니다. 우리는 또한는 페이지를 증폭 하는 방법 및 그들의 게놈을 정화 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 및이 작품에서 제시 하는 결과 집합이 셀 무료 합성 생물학 및 생명 공학에 종합 연구 참여에 대 한 관심의 이어야 한다.
서론
지난 10 년간, 셀 무료 식 기술 긴급 종합 연구 분야 관련 합성 및 양적 생물학에서 주소 새로운 응용 프로그램을 설계 되었습니다. 원래 독립적인 생명체의 단백질을 표현 하는 데 사용, 새로운 셀 무료 TXTL 시스템 모두 기초 및 응용 과학1,2, 상당히이 기술의 범위 확대에 대 한 개발 되었습니다. TXTL 플랫폼의 새로운 세대는 사용자 친화적인, 수 있도록 설계 되었습니다 더 효율적 (도달 배치 모드3에서 단백질 합성의 2 mg/mL), 더 전사4의 수준에서 다양 하 고 게로 이렇게 모듈형 쉽게 통합 자연 소설 또는 기존 생물 학적 시스템5,6의 기능을 확장 하는 합성 함수. 특히, TXTL 시스템 셀 무료 되 규제 요소 등 작은 유전자 회로7,,89, 유전 프로그램의 신속한 프로토 타입에 대 한 편리한 디자인-빌드-테스트를 줄....
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프로토콜
참고: 다음 증폭 단계와 추출 방법은 크게 받아들이기는 많은 이중 가닥 DNA 살 균 소, 예를 들어, 살 균 소 T7, enterobacteria 살 균 소 T4, 또는 enterobacteria 살 균 소 λ (L). 그들은 주로 그 게놈은 쉽게 상업적인 근원에서 구입할 수 있는 살 균 소 사용 됩니다.
1. 살 균 소 증폭
참고: 단일 플 라크, 멀티 사이클 (SPMC) 살 균 소 생산 기술은 잘 첸, 그 외에 T4 파지에 대 한 설명 14 다음 페이지 확대 및 DNA 추출 방법은 대장균 이중 가닥 DNA 페이지, 예를 들면, T7, T4, 또는 L와 함께 사용 하기 위해 일반화 프로토콜의 궁극적인 성공을 심하게 선택한 호스트 세포 변형에 따라 달라 집니다 ' superinfection 조건을 견딜 수 s. 경우 호스트 셀 superinfection, 아래 안정 또는 superinfection 결코 도달 하 고, 세포는이 중요 한 단계에 도달 하지, confluent 세포의 용 해 프로토콜 진행 최상 이다. 고속 원심 분리 및 살 균 소 ultracentrifugation....
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결과
우리는 4 개의 대표적인 결과 보여줍니다. 그림 1에서는 셀 무료 TXTL 시스템 및 살 균 소 DNA 주식 생활 오염 되지 되도록 부정적인 컨트롤 집합 소개 대장균 세포. 우리 셀 무료 TXTL 시스템은 그대로 대장균 의 무료 확인 모두 비 인 큐베이 팅 및 incubated 반응 솔루션 genomic DNA (그림 1A 와 그림 1B)의 무효를 도금 하 여 오염 셀. 경우 셀 무료 TXTL 시스템 대장균 세포 오염 되었다, 성장 접시에 관찰 될 것 이다. 또한, 우리 확인 셀 무료 반응 그리고 그러므로 어떤 가능한 오염 물질 셀, 살 균 소의 합성에 대 한 책임 도금 살 균 소 게놈 (
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토론
첸, 그 외 에 기술에 따라 SPMC에 대 한 14 , superinfection 적절 한 조건을 결정할 때 중요 한 단계에 도달입니다. 가장 가깝게 superinfection 견딜 호스트 스트레인의 능력을 제어 하는 매개 변수 자주 감염 살 균 소의 초기 농도 이다. 호스트 세포는 살 균 소의 아주 작은 금액을 초기 감염 전에 대 수 성장 단계에 있어야 합니다. 결국, 페이지 또한 로그 성장을 도달 하 고 목표 살 균 소 숫자 빠르게 셀 카운트, 각 호스트 셀에 페이지의 여러 복사본에 대 한 허용을 능가 하는. 이렇게 하면 어디 그것은 세포의 용 해를 받게 될 것 이다 준 안정 상태로 셀. 이 상태에 도달 하지 경우 셀 연계, confluent 세포를 받아야 하 고 그들의 바이러스 부하를 풀어 것입니다. Superinfection 위의 초기 바이러스 농도 사용 하 여 연결할 수 없습니다, 후속 시도 하기 전에 10의 요인에 의해 감염의 초기 다양성을 낮은. 수확을 하기.......
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공개 사항
저자 선언 다음 경쟁 금융 interest(s): Noireaux 실험실 MYcroarray, MYtxtl 셀 무료 단백질 식 키트의 대리점에서에서 연구 자금을 받습니다.
감사의 글
이 자료는 해군 연구 사무실 보너스 번호 N00014-13-1-0074 (V.N.)를 지 원하는 작업을 기반으로, 인간 프론티어 과학 프로그램 부여 번호 RGP0037/2015 (V.N.), 그리고 한국군 과학 재단 부여 2014400 (V.N.).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 초원심분리 튜브 | Beckman Coulter | 344057 | |
| 원뿔형 튜브 | Falcon | 352070 | |
| 그라디언트 메이커 | BioComp 그라디언트 마스터 | 항문 Biochem 참조.1985년 7월; 148(1):254-9. | |
| 주사기 및 블런트 캐뉼라 | Monoject | 8881513918 및 888202017 | |
| 와이드 보어 피펫 팁 | Fischerbrand | 02-707-134 | |
| 플라크 카운터 | New Brunswik Scientific | Colony Counter Model C-110 | |
| Culture tubes | Fischerbrand | 14-961-33 | |
| Cell-free system | Mycroarray Inc | Mytxtl | |
| BioComp Gradient Master | BioComp Instruments | 모델 105ME | |
| LB 한천 플레이트 레시피 | 25 g/L Luria-Bertani 배지(LB Broth, Miller - Fisher BioReagents, 제품 번호 BP1426) 및 15 g/L Bacto-Agar 고체(Brenton, Dickenson and Company - 제품 번호 214010). |
참고문헌
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol Adv. , (2011).
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metab Eng. , (2011).
- Caschera, F., Noireaux, V.
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재인쇄 및 허가
