인간 유래 다 능성 줄기 (hiPS) 세포의 강력한 유도는 피부 섬유 아세포의 비 통합 적 센다이 바이러스 (SeV) 벡터 매개 재 프로그램 화를 사용하여 달성되었다. 재조합 인간 라미닌 521 (LN-521) 매트릭스 및 필수 E8 (E8) 배지를 사용하여 제노 프리 및 화학적으로 한정된 배양 조건을 사용하여 hiPS 세포 유지 및 클론 확장을 수행 하였다.
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이 논문에서
요약
초록
Xeno-free 및 완전 정의 된 조건은 균질 한 사람 유도 pluripotent stem (hiPS) 세포의 강력하고 재현성있는 생성을위한 핵심 매개 변수입니다. 피더 세포 또는 정의되지 않은 매트릭스상의 hiPS 세포의 유지는 배치 차이, 병원성 오염 및 면역 원성의 위험에 취약하다. 제노 프리 및 정의 된 배지 배합물과 조합하여 정의 된 재조합 인간 라미닌 521 (LN-521) 매트릭스를 사용하면 변이가 감소하고 hiPS 세포의 일관된 생성이 가능해진다. 센다이 바이러스 (SeV) 벡터는 비 통합 RNA 기반 시스템이므로 벡터 통합 벡터가 가질 수있는 게놈 무결성에 대한 파괴적인 효과와 관련된 우려를 회피 할 수 있습니다. 또한, 이들 벡터는 진피 섬유 아세포의 재 프로그래밍에서 비교적 높은 효율을 입증 하였다. 또한, 세포의 효소 단일 세포 passaging은 줄기 세포의 실질적인 사전 경험없이 hiPS 세포의 균질 유지를 용이하게합니다문화. 여기서는 재현성과 사용 용이성에 중점을두고 광범위하게 시험하고 개발 한 프로토콜을 기술하여 섬유 아세포에서 정의되고 이종없는 인간 hiPS 세포를 생성하는 강력하고 실질적인 방법을 제공합니다.
서론
다카하시 (Takahashi) 등에 의한 hiPS 세포주의 일차 유도 이후, 1 , 2 , hiPS 세포는 질병 모델링, 약물 발견 및 재생 의학 3 에서 세포 치료법을 생성하기위한 원료 물질로서 유용한 도구를 제공합니다. hiPS 세포 배양은 오랫동안 섬유 모세포 피더 세포 4 , 5 또는 Matrigel 6 및 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 배지 배합물과 함께 공 배양에 의존 해왔다. 일괄 배치 (batch-to-batch) 편차는 이러한 배양 조건의 정의되지 않은 특성의 공통적 인 결과이며 예측할 수없는 변형을 가져 오며 이는 이러한 프로토콜의 신뢰성을 저해하는 주요 원인입니다. Essential 8 (E8) 8 및 정의 된 세포 배양 기질, 예를 들어 LN-521 9 와 같은 한정 배지의 개발은재현성있는 프로토콜을 확립하고 homogenous hiPS cell
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프로토콜
환자 물질의 수집 및 hiPS 세포의 유도는 2012 년 3 월 28 일 스톡홀름 윤리 검토위원회 (Statics Review Board)에서 승인합니다. 등록 번호 : 2012 / 208-31 / 3. 달리 명시되지 않는 한 세포 배양 단계는 바이오 안전성 캐비닛에서 수행되어야합니다. 세포 작업시 항상 멸균 취급 기술을 연습하십시오. 시작하기 전에 미디어, 플레이트 및 시약이 실온에 도달하도록하십시오. 고습도에서 37 ° C, 5 % CO 2 에서 세포를 배양하십시오.
1. 피부 생검에서 인간 섬유 아세포의 분리
- 배양 배지, 소화 효소, 접시 코팅 및 해부 도구.
- Fibroblast 배지 준비 : Iscoove 수정 된 둘 베코 배지 (IMDM) 44.5 mL, 태아 소 혈청 (FBS) 5 mL 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PEST) 500 μL ( 표 1 참조)를 4 ° C에서 보관하십시오.
- 1 mg / mL의 작업 농도에서 소화 효소를 준비하십시오 : wei4ml의 디스 페아 제 및 콜라게나 제 I 형 파우더를 별도의 15-mL 튜브에 분주하고 4 mL의 DMEM / F12 + 1 % PEST에 ....
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결과
생검에서 hiPS 세포로
생체 검사부터 확립 된 hiPS 세포에 이르는 전체 과정은 재 프로그램 벡터가 없으며 특성화를 위해 준비되며 약 16 주 소요됩니다 ( 그림 1 ). 보다 자세한 타임 라인은 그림 2A에 명시되어 있습니다. 섬유 아세포 배양을 확립하고 확장시키기 위해서는 약 4 주가 소요됩니다. 첫 번째 hiPS 세포 콜로니는 센다이 벡터 형질 도입 후 약 3 주 후에 나타났다. 콜로니는 첫 번째 통로에서 기계적으로 골라내어 효소 적으로 단일 세포로 퍼지게된다.
인간 섬유 아세포 배양 물의 확립
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토론
이 프로토콜의 예상 결과는 여러 clonally derived hiPS 세포 라인의 성공적인 생성입니다. 중요하게, 여기에 기술 된 확립 된 hiPS 세포의 유지 및 확대를위한 방법은 신뢰성이 있고 줄기 세포 배양의 경험이 거의없이 수행 될 수있다. LN-521 매트릭스와 함께 ROCKi와 함께 효소 단클론 항체는 식민지 기반의 구강이 10 , 19 , 20을 자극 할 수있는 유도 이질성을 피하면서 핵형 적으로 정상, 다 능성 및 쉽게 분화 할 수있는 것으로 세포를 유지하는 것으로 알려져있다. LN-521에서 배양 된 hiPS 세포는 ROCKi 10을 첨가하지 않고 단일 세포로 계대 할 수 있지만, ROCKi를 첨가하면 경험이 적은 핸들러가 쉽게 프로토콜을 수행 할 수 있으며 hiPS 세포 유도에 필요한 시간이 단축됩니.......
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공개 사항
저자는보고 할 이해 관계가 없습니다.
감사의 글
이 작품은 SSF (B13-0074)와 VINNOVA (2016-04134) 자금 지원 기관에 의해 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | 생검 분해 |
| 콜라겐분해 | 시그마 | C0130 | 생검 분해 |
| 젤라틴 | 시그마 | G1393 | 섬유아세포 매트릭스 |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | 섬유아세포 매체 |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | 섬유아세포 매체 |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Life Technologies | 15070-063 | 항생제 |
| 필수 8 배지 | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS 세포 배양 배지 |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS 세포 배양 매트릭스 |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | 해리 시약 |
| Rho-kinase 억제제 Y27632 | Millipore | SCM075 | Rho-kinase inhibitor (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 재프로그래밍 키트 | Life Technologies | A1377801 | 센다이 바이러스 재프로그래밍 벡터 |
| 35 mm 조직 배양 접시 | Sarstedt | 83.3900.300 | 세포 배양 |
| 60 mm 조직 배양 접시 | Sarstedt | 83.3901.300 | 세포 배양 |
| 24 웰 조직 배양 플레이트 | Sarstedt | 83.3922.300 | 세포 배양 |
| T25 조직 배양 플라스크 | VWR | 734-2311 | 세포 배양 |
| 15 mL 튜브 | Corning | 430791 | Centrifuge 튜브 |
| 1.5 mL 튜브 | Eppendorf | 0030123.301 | 1.5 mL 튜브 |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | 냉동 용기 |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | 섬유아세포 동결 |
| 극저온 1.8 mL | VWR | 479-6847 | 극저온 PSC |
| 냉동 보존 키트 | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell 보충제 |
| 트립신-EDTA (0.05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 섬유아세포 해리 효소 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | 소화 효소 희석제 |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | 생검 준비 |
| 혈구계 | Sigma | BRAND, 718920 | 세포 계수 |
| Parafilm | VWR | 291-1213 | 보관용 밀봉 플레이트 |
참고문헌
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced p....
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