방법 논문

자기 조립 펩타이드와 아미노산의 조합을 사용 하 여 수 용액에서 소수 성 화합물의 용 해도

DOI:

10.3791/56158

⸱

2017년 9월 20일

 ,  , 
1Latner Thoracic Surgery Research Laboratories, University Health Network, 2Department of Pediatrics, British Columbia Children's Hospital & University of British Columbia, 3Institute of Medical Science, University of Toronto

이 논문에서

요약

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이 프로토콜 자체 조립 펩타이드와 아미노산 솔루션의 조합을 사용 하는 수성 환경에서 소수 성 화합물을 녹 이기의 임상 적용 방법을 설명 합니다. 우리의 방법은 소수 치료 학, 임상 설정으로 안전 하 고 효율적 수단 가용성 및 배달 방법의 부족의 주요 한계를 해결 합니다.

초록

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자가 조립 펩 티 드 (얼 간)는 임상 응용 프로그램; 소수 성 치료제의 배달에 대 한 유망한 차량 그들의 amphipathic 속성의 수성 환경에서 소수 성 화합물을 분해 하도록 수 있습니다. 그러나, 자가 조립 펩 티 드 솔루션은 가난한 혈액 호환성 (예를 들어, 낮은 osmolarity), 정 맥 행정을 통해 그들의 임상 응용 프로그램을 방해. 우리는 최근이 아미노산 솔루션 (SAP-AA) 약물 용 해도 향상 및 배합 osmolarity 임상 사용에 대 한 요구 사항에 도달 증가 얼 간 결합 소수 성 약물 전달에 대 한 일반화 된 플랫폼을 개발 했습니다. 이 공식 전략 3 구조적으로 다른 소수 성 화합물-PP2, rottlerin, 및 curcumin-그 다양성을 설명 하기 위하여의 맥락에서 철저 하 게 테스트 되었습니다. 또한, 우리 6 다른 얼 간, 낮은 농도에서 20 자연스럽 게 기존 아미노산 및 두 개의 서로 다른 공동 용 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 및 에탄올을 분석 하 여 배합 구성 요소 변경의 효과 검사 합니다. 특정된 소수 성 약물 및 공식화 억제제, PP2, 치료 기능에 대 한 구성 요소를 최적화에 효과가 입증 하는 우리의 전략은 체 외에서 그리고 vivo에서모두 관찰 되었다. 이 원고는 소수 성 화합물 및 기능적 연구에이 공식의 사용 가능성을 향한 첫 걸음으로 용 해도의 분석에 대 한 SAP-AA 조합을 사용 하 여 우리의 일반적인된 배합 방법을 설명 합니다. 우리는 소수 성 화합물, curcumin의 정립에 대 한 대표적인 용 해도 결과 포함 하 고 어떻게 우리의 방법론 미래 생물학 연구 및 질병 모델에 대 한 플랫폼 역할을 토론.

서론

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얼 간 재생 의학1,2,,34에서 3D 공중 발판으로 광범위 하 게 연구 하는 생체 재료의 클래스는. 그러나 최근에, 그들은 있다 되었습니다 악용 치료제 때문에 그들의 독특한 생물 속성5,6,,78의 납품을 위한 차량으로. 얼 간 자연스럽 게 안정 nanostructures9, 마약 캡슐화 하 고 보호 하는 수단 제공으로 조립. 얼 간은 amphipathic, 소수 성 및 친수성 아미노산 반복, 운전의 특정 패턴의 구성 그들의 자기 조립을9,10 , 소수 성 및 친수성 사이 매체 역할을 수 있도록 환경입니다. 따라서, 소수 성 약물-임상 배달에 있는 매우 낮은 생체 이용률과 신체에 흡수 수성 환경11,12 -가용성의 부족으로 인해 얼 간은 배달 약속 차량입니다. 또한, 그들의 순서 패턴 또한 그 얼 간 합리적으로 설계 하 고 수 하 어떤 주어진 약물 호환성 최대화 또는 복합 (즉, 기능 그룹에 따라) 추가 가용성 엔지니어링을 의미 합니다.

얼 간 효과적인 마약 배달 차량 많은 생체 외에서 그리고 vivo에서 설정13,14,,1516으로 적용 되어 있다. 그들은 또한 중대 한 안전 및 생체 적합성 표시. 그러나, SAP 약물 준비의 낮은 osmolarity, 때문에 그들은 임상 설정13에서 정 맥 주사에 대 한 사용할 수 없습니다. 이 구속을 고려 하면 우리 최근 얼 간 독성 공동의 사용을 감소 하 고 배합 osmolarity 증가 아미노산 솔루션과 결합 하는 전략을 개발 했다 따라서, 임상 관련성. 우리 얼 간의 빌딩 블록으로 아미노산을 사용 하기로 이미 임상 허용, 고 얼 간와 함께, 그들은 증가 소수 성 약물의 용 해도17,18필수 SAP의 양을 줄이는.

우리는 자세히 조사 SAP AA 조합 소수 성 약물의 용 해도 및 후속 배달을 위한 일반화 된 플랫폼으로 여러 단계의 심사 파이프라인을 만들고 Src 반응 억제제, PP2 모델 소수 성 화합물으로 서 그것을 적용 하 여. 이 과정에서 우리는 정립의 구성 요소를 변경-궁극적으로 테스트 6 다른 얼 간, 2 다양 한 농도 (낮은, 높은, 낮은에 따라 기존 임상 응용 프로그램에 높은 농도에서 모두 20 아미노산의 효과 검사 농도 했다 2 배, 3 배, 또는 물에서 각 아미노산의 최대 용 해도 기반으로 하는 임상 농도 5 배), 그리고 2 다른 공동 용 매-및 추가 분석을 위해 PP2 solubilized 선택한 조합. 이 약물 배합 vivo 모델 intratracheal 및 정 맥 행정을 사용 하 여 세포 배양에 약 배달 차량으로 효과가 입증 했다. 마찬가지로, 우리의 작업 solubilizing 여러 SAP AA 조합의 다양성에 감동을; 수성 환경에서 구조적으로 다른 소수 성 화합물 특히,는 약 rottlerin 및 curcumin18. 이 원고는 SAP AA 배합 방법 및 우리의 심사 파이프라인에서 기본 단계의 예로 curcumin 가용성의 분석을 설명합니다. 이 프로토콜 어떤 주어진된 소수 성 화합물을 분해 최적의 SAP AA 조합에 대 한 화면으로 간단 하 고 재현성을 제공 합니다.

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프로토콜

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1. 준비의 아미노산 솔루션

  1. 준비 및 레이블 두 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 각 아미노산에 대 한 (하나 둘 다를 위해 각 " 낮은 " 및 " 높은 " 농도).
  2. 순화 된 물 (18.2 ㏁ 25 ° C에서)를 포함 하는 큰 2 L 플라스 크를 준비.
  3. 원하는 농도 도달 (그램)에서 각 아미노산의 양을 계산 하 고 주걱을 사용 하 여 그들의 각각 50 mL 원심 분리기 튜브로 아미노산의 적절 한 금액을 무게.
    : 참고는 " 높은 " 2의 농도 부정 청구 아미노산, PBS 물 대신 사용 됩니다. 우리는 그들의 낮은 물 가용성 및 낮은 pH를 유지 하기 위해 물 수 대신 PBS를 사용 하 여 그들의 농도 증가 하지 않을 수 있습니다. 또한, 농도 계산 각 아미노산 솔루션에 대 한 40 mL의 최종 볼륨을 사용 하 여 얻은 했다. 모든 아미노산 농도 표 3에 설명 되어 있습니다. 오염을 피하기 위하여 아미노산 사이 주걱을 씻어 해야 합니다. 물 린스, 70% 에탄올으로 닦아 다음 것이 좋습니다.
  4. 순화 된 물 (PBS)의 각 50 mL에 추가 40 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 튜브. 튜브와 소용돌이 닫습니다 또는 해산 때까지 적극적으로 악수. 물 목욕 쥡니다 (실내 온도, 130 W, 40 kHz) 용 해도 프로세스에 도움을 사용할 수 있습니다.
    참고: 다음 아미노산 솔루션은 빛에 민감한 및 알루미늄 호 일로 덮어야 한다: 트립토판, 페닐알라닌, 티로신 (이루어져 방향족 고리 구조) 시스테인 (반응-SH 그룹).

2. SAP-AA 솔루션의 준비

  1. 준비 20 mL 섬광 튜브 자기 조립에 대 한 펩 티 드. 주어진된 자기 조립 펩 티 드에 대 한 준비 아미노산 솔루션 (각 조합에서에서 이루어집니다 별도 유리병) 당 한 유리병을 준비.
  2. 각 유리병의 바닥에 약 1 ± 0.2 mg 펩 티 드의 무게 (와 함께 한 가독성 또는 그이 하 0.1 mg까지), 높은-성능 분석 균형을 사용 하 여. 무게 후 뚜껑과 뚜껑에 펩 티 드의 정확한 무게를 기록
  3. 펩 티 드, 펩 티 드 (0.1 mg/mL 16 아미노산의 길이가 긴 펩 티 드 또는 0.2 mg/mL에 대 한 자기 조립의 원하는 농도 도달 하기 위하여 포함 된 각 유리병에 적절 한 양의 아미노산 솔루션 (섹션 1에서 준비 하는) 플라스틱 8 아미노산의 길이가 짧은 펩 티 드).
  4. 는 물 목욕 sonicator (130 W, 40 kHz) 실내 온도에, 튜브 내에서 솔루션 물 목욕에 완전히 몰입 하 보장에서 10 분 Sonicate.

3. DMSO 약물 또는 약물 에탄올 재고 솔루션의 준비

  1. 결합 (이 경우에는 100 %DMSO curcumin)에서 약물의 1 mg와 두 개의 재고 솔루션을 만드는 100% 에탄올과 다른 1mg.
    참고: 우리는 DMSO curcumin와 에탄올 curcumin 주식 되었고 5 mg/mL 2.5 mg/mL, 각각, 각 용 매;에 있는 다양 한 가용성 때문에 DMSO와 400 µ L 에탄올의 200 µ L을 추가 그러나, 그것은 재고의 집중 관심의 소수 성 약물에 따라 조정 되어야 한다 주의 하는 것이 중요입니다. 약물 용 해도 등 효과적인 생물학 농도 요인이이 가치 결정에 중요 하다. 또한, 그 재고 것입니다 희석 약 및 50-fold DMSO와 에탄올 정립에서 각각, SAP AA 솔루션 (섹션 4 참조)와 함께 하는 마음에 계속. 공식 요구의 수에 따라 재고의 더 큰 볼륨을 준비를 선호 수 있습니다 –이 경우에, 약 1 mg 이상 사용 될 것 이라고. 주식-20 ° C에 저장 될 수 있다 얼음에 소용돌이 사용 하기 전에 해 동.
  2. 소용돌이 15 리 바이 알 약을 완전히 분해 하는 s.

4. 약물 제형의 준비

  1. 준비, 1.5 mL microcentrifuge 튜브 각 배합에 대 한. 펩 티 드, 아미노산 (고 농도), 자체 조립 하는 의도를 레이블 튜브 반드시과 공동 용 매.
  2. 마약 DMSO 주식, 또는 적절 한 microcentrifuge 튜브 20 µ L 마약 에탄올 재고 추가 10 µ L.
  3. 추가 990 µ L의 SAP AA 산 성 솔루션을 적절 한 분류 마약 DMSO 주식과 마약 에탄올 주식 포함을 980 µ L을 포함 하는 microcentrifuge 튜브. 이 1 %DMSO 또는 2% 에탄올 1 mL 약물 제형 생산.
    참고: 모든 curcumin 공식의 최종 농도 프로토콜에 따라 0.5 mg/mL 이었다. 다시 말하지만,이 때 달라 집니다 다른 소수 성 화합물을 사용 하 여 또는 다른 재고 농도와 시작 (단계 3.1 참조)
  4. 30에 대 한 적극적으로 소용돌이 s 30 분 동안 휴식을 공식 허용

5. 가용성 테스트

  1. 휴식 기간, 소용돌이 적극적으로 한 번 다시 30 후 미
  2. 1 분에 대 한 14,220 x g에서 공식 원심
  3. 강수량 microcentrifuge 관의 하단 (시각화) 하 여 분석.

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결과

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소수 성 약물, curcumin에 대 한 우리 공식 증거의 원칙으로 하나의 SAP, EAK16-II와 함께에서 낮은 농도에서 아미노산을 자연스럽 게 존재 하는 모든 20를 사용 하 여 제작. 우리는 또한 공식 공동 용 매로 DMSO와 에탄올을 사용 하 여 테스트. 총에서이 각각 서로 다른 구성 요소를 포함 하는 40 curcumin 공식 생산. Src 억제제, PP2를 사용 하 여 우리의 이전 연구에 우리 SAP (6 총)와 아미노산 농도 대 한 더 많은 옵션을 포함, 주의 하는 것이 중요 하다 (임상, 높은 농도 뿐만 아니라)는 480 다른 정립의 총 생산. 이 작품에서 동향으로이 연구에 대 한 SAP EAK16 II를 선택할 때 계정에 찍은. 다양 한 부품의 농도 표 1, 표 2및 표 3 에 참조로 포함 됩니다. 모든 소수 성 약물 제형 시각화, 약물 용 해도 대 한 상영 고 ...

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토론

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수립 절차에서 다양 한 중요 한 단계 및 문제 해결에 고려해 야 할 점이 있다. 첫째, 우리는 다양 한 구성 요소와 농도 일으로 프로토콜을 통해 여러 개의 소용돌이 단계 모든 농도 균일 하 고 올바른 인지 확인 합니다. 고 농도, 소수 성 아미노산 솔루션의 일부 수 있습니다 여전히 하지 완전히 용 해 vortexing, 후 고이 경우에, 그들은 과정에서 도움을 손으로 적극적으로 흔들릴 수 있습니다. 마찬가지로, 그것은 필수 SAP AA 솔루션 얼 간 자연스럽 게 하는 경향이 단계 2.4에서에서 설명한 쥡니다 단계 받아야 집계 및 쥡니다 분할 SAP 클러스터, 더 획 일 한 해결책에 따라서 결과에 도움이 될 것입니다. 둘째, 주어진된 소수 성 약물에 대 한 재고 및 SAP AA 공식 내에서 최종 농도 생물 학적 설정에서 화합물의 효과적인 농도에 달려 있어야 한다. 프로토콜이 활성 농도 맞게 적절 하 게 수정 한다. 또한, 마약 적재 능력은 또한 고려; 하는 중요 한 요소 그것은 각 약물이이 전략을 사용 하 여 독특한 로드 용량 해...

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회에 의해 지원 하 고, 걸 레-42546 및 걸 레 119514 부여 운영 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
EAK16-I캔펩타이드 Inc.맞춤형 펩타이드서열: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-말단 아세틸화 및 C-말단 아미드화, HPLC
EAK16-IICanPeptide Inc맞춤형 펩타이드서열: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-말단 아세틸화 및 C-말단 아미드화, HPLC
EAK16-IVCanPeptide Inc맞춤형 펩타이드서열: AEAEAEAEAEAKAKAK, N-말단 아세틸화 및 C-말단 아미드화, HPLC
EFK8-IICanPeptide Inc맞춤형 펩타이드서열: FEFEFKFK, N-말단 아세틸화 및 C-말단 아미드화, HPLC
A6KECanPeptide Inc맞춤형 펩타이드서열: AAAAAAKE, N-말단 아세틸화 및 C-말단 아미드화, HPLC
P6KECanPeptide Inc맞춤형 펩타이드서열: PPPPPPPKE, N-말단 아세틸화 및 C-말단 아미드화>, HPLC
알라닌시그마-알드리치A7469-100GL-알라닌
이소류신시그마-알드리치I7403-100GL-이소류신
류신시그마-알드리치L8912-100GL-류신
메티오닌시그마-알드리치M5308-100GL-메티오닌
프롤린시그마-알드리치P5607-100GL-프롤린
발린시그마-알드리치V0513-100GL-발린
페닐알라닌시그마-알드리치P5482-100GL-페닐알라닌
트립토판시그마-알드리치T8941-100GL-트립토판
티로신시그마-알드리치T8566-100GL-티로신
글리신, 시그마-알드리치G8790-100G, L-글리신
아스파라긴, 시그마-알드리치A4159-100G, L-아스파라긴
글루타민, 시그마-알드리치G8540-100G, L-글루타민
세린, 시그마-알드리치A7219-100G, L-세린
, 트레오닌, 시그마-알드리치T8441-100G, L-트레오닌
히스티딘시그마-알드리치H6034-100GL-히스티딘
라이신시그마-알드리치L5501-100GL-라이신
아르기닌시그마-알드리치A8094-100GL-아르기닌
아스파르트산시그마-알드리치A7219-100GL-아스파르트산
글루탐산시그마-알드리치G8415-100GL-글루탐산
시스테인시그마-알드리치C7352-100GL-시스테인
디메틸 설폭사이드시그마-알드리치D4540-500MLDMSO
에탄올시그마-알드리치277649-100ML무수
커큐민시그마-알드리치08511-10MG소수성 약물, 커큐민
로틀러린EMD 밀리포어557370-10MG소수성 약물, 로틀러린
PP2엔조 BML-EI297-0001소수성 약물, PP2
섬광 바이알VWR2650-66022-081붕규산 유리, 나사 캡 포함, 20mL. 펩타이드 칭량용 바이알.
Falcon 50 mL 원추형 원심분리 튜브VWR352070폴리프로필렌, 멸균, 50 mL. 아미노산 용액용.
.에 의한 >95% 순도.에 의한 >95% 순도.에 의한 >95% 순수.에 의한 >95% 순도.에 의한 >95% 순도, ,, , , ,

참고문헌

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