교류 Cytometry 기반 약물 세포종 줄기 세포의 세포 분화를 촉진 하는 작은 분자의 식별에 대 한 시스템 검사

요약

효율적인 심사 프로토콜 astroglial 분화 세포종 줄기 세포 (GSCs)에 홍보 하는 작은 분자의 식별을 위해 제공 됩니다. 분석 결과 줄기 세포 감 별 법 기자에 의하여 향상 된 GFP (eGFP)의 식을 인간의 GFAP 발기인에 의해 구동 됩니다 기반으로 합니다.

초록

세포종 (GBM)은 미국 에서만 매년 약 14000 죽음을 일으키는 원인이 되는 성인에서 가장 일반적이 고 가장 치명적인 기본 뇌 종양. 메디아 생존 진단 다음 최대한 외과 절제술, 방사선 및 temozolomide 요법으로 15 개월 미만 이다. 더 효과적인 GBM 치료법 개발에 도전 점점 더 분명 되 고 등의 탄력성이 침입, 표준 치료에 그것의 저항, 그것의 복잡 한 유전 및 분자 적응성, GBM의 모집단 정상 줄기 세포, phenotypic 유사성과 셀 본 세포종 줄기 세포 (GSCs) 라고. GSCs 종양 성장 및 진행을 위해 필요 하기 때문에 차별화에 기초를 둔 치료가 불 치의 신생에 대 한 가능한 치료 양식 적임을 나타냅니다.

다음 프로토콜 플랫폼 GSC astroglial 차별화를 홍보 하는 작은 분자의 식별 목적으로 상영 높은 처리량을 설정 하는 절차의 컬렉션을 설명 합니다. 시스템의 핵심에는 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 차별화 기자-구문입니다. 다음과 같은 일반적인 절차를 포함 하는 프로토콜: (1) 설립 GSC 차별화 기자 라인; (2) 테스트/유효성 검사 GSC 자체-갱신/clonogenic 용량; 기자의 관련성 그리고 (3) 높은-용량 cytometry 마약 검사를 기반으로.

심사 플랫폼 GSCs 차별화를 홍보 하는 작은 분자를 식별 하는 간단 하 고 저렴 한 접근을 제공 합니다. 또한, FDA 승인 약품의 라이브러리의 활용 더 급속 하 게 내리거나 수 에이전트의 식별에 대 한 가능성을 보유 하고있다. 또한, 암 줄기 세포 분화를 촉진 하는 치료 대상 및 주로 더 차별화 된 암 세포를 제거 하기 위해 표시 되었습니다 현재 "표준 치료" 치료 공동 성으로 작동 하도록 예상 된다.

서론

최근 연구는 작은 인구를 포함 하는 종양 세포, 암 줄기 세포 (CSCs) 또는 시작 하는 종양 세포 나의 종양 진행, 전이, 그리고 항 암 치료 및 라디오 치료 ^1, 저항에 대 한 책임은 ². 암 줄기 세포 및 종양 내의 그들의 분화 progenies intratumoral이 추진 하는 중요 한 요소를 간주 하 고 따라서 암³치료에 주요 장애물을 나타냅니다. 종양 세포 계층, 암 줄기 세포 이론에 의해 제공 된 치료 암 ⁴새로운 전략의 개발 영감 하고있다. 암 줄기 세포를 대상으로 하는 한 가지 방법은 식별 하 고 영향을 받는 장기의 배아 발달 동안에 필요한 것으로 알려져 있습니다 신호 경로 억제 하는 것입니다. 사실, 우리와 다른 사람 신경 줄기 세포 관련 신호 경로 소닉 고슴도치와 노치 세포종^5,,67에 대 한 지속적인 요구를 설명 하는 여러 논문을 출판 이전 했습니다. 이 작품은 여러 GBM 임상 시험에 대 한 근거를 응고에 도움이....

프로토콜

참고: Astroglial 및 신경 lentivirus 기자 시스템 사전 패키지, 집중 lentiviral 준비로 구매 되었다. 교류 cytometry 기술의 기본 지식이 필요 합니다. 또한,이 프로토콜을 사용 하는 전체에 대 한 사용자 흐름 cytometer 높은 처리량 용량 (샘플 소스로 96 잘 접시를 허용)에 대 한 액세스를 해야 합니다.

1. lentiviral Transcriptional 기자 시스템

참고: 모든 흐름 cytometric 분석에 사용 하 여 부모, 비 불리고, 셀 또는 벡터 불리고 (비 형광) 셀 설정 기준 형광. 또한, 유의 하십시오, 기계적 분쇄 이라고 어디 모든 단계에서 부드러운. 가혹한 분쇄 연약한 GSCs의 상당한 수를 죽 일 고 흐름 cytometry 결과 영향을 미칠 수 있습니다.

1. 플레이트 1 x 10⁶ 셀 6 multiwell 격판덮개에 완전 한 신경 줄기 세포 성장 매체의 2 ml.
2. Lentivirus 기자 5 크거나 감염 (moi)의 다양성에 추가 하 여 셀 transduce.
3. 8 µ g/mL의 최종 농도 대 한 polybrene의 2 µ L를 추가 합니다.
4. ....

결과

3 개의 독립적인 환자 파생 neurospheres 라인 Zeocin 저항 카세트 녹색 형광 단백질 (GFP) 융합에 프레임에 대 한 인코딩 lentivirus astroglial 기자와 불리고 되었고 인간의 GFAP 발기인 요소 ( 에 의해 구동 그림 1). 다음 개별 클론 96 잘 접시 (그림 2)에 잘 당 0.7 셀을 도금 하 여 고립 되었다,이 GFP (그림 3)를 표현 하는 세포의 백분율의 흐름 cytometric 결정에 의해 그 뒤를 이었다. Neurosphere 클론, ≤ 5 %GFP-긍정적인 세포를 포함 하는 단일 셀에서 파생 이라고 GL (GFAP 낮은) ≥75 %GFP 긍정적인 세포를 포함 하는 클론 GH (GFAP 높은) 라고 하 고는 GL에 비해 더 분화 될 것으로 간주 됩니다. subclo.......

토론

그들을 정의 하는 표식에 주로 집중 하는 GSCs의 이전 연구의 대부분,이 연구에서 우리가 결정 역 접근 하는 것. 우리는 GSCs (예를 들어, 셀 astroglial와 신경 마커)에 의해 생성 된 차별화 된 progenies에 주로 집중 한다. 여기 우리 인간의 GFAP 발기인 종속 식을 GFP의 기반 시스템 심사 높은 처리량 셀 기반 약물의 사용을 보여 줍니다. 모든 실험 환자 파생 neurosphere 세포종 세포 라인을 활용 하 여 수행 했다. 분리와이 라인의 확장을 설명 하는 상세한 프로토콜 Galli 외¹⁷에 설명 되어 있습니다.

시스템 뿐만 아니라 GSCs의 세포 분화를 유도 할 수 있다 그러나 또한 도움이 우리가 astroglial 분화 마커 GFAP 표현 결정 명백 하 게 결정 하는 작은 분자의 식별에 우리를 원조는 GSC 주파수를 비교 하 여 개별 GBM 셀의 clonogenic 용량. ELDA 분석 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ESGRO Complete Accutase	EMD Millipore	SF006
디메틸설폭사이드(DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)	Sigma Aldrich	H6648
Human GFAP Differentiation Reporter(pGreenZeo, 바이러스)	SBI(System Biosciences)	SR10015VA-1
50ml 멸균 일회용 시약 저수지	Corning	4870
6 웰 플레이트	Thermo Fisher Scientific	130184
96 웰 플레이트	Falcon	353072
Biolite T25 cm² 플라스크 벤티드	써모 피셔 사이언티픽	130189
바이올라이트 T75 cm² 플라스크 벤티드	써모 피셔 사이언티픽	130190
15 ml 원심분리기 튜브	Celltreat	229411
1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브	Fisher Scientific	05-408-129
Ovation 멀티 채널 피펫, 12 채널, 0.5 - 20uL	VistaLab Technologies	1060-0020
Ovation 멀티 채널 피펫, 12 채널, 5-250uL	VistaLab Technologies	1060-0250
멀티 12채널 피펫 팁 25 μ l	VistaLab Technologies	4060-1002
멀티 12채널 피펫 팁 250 μ l	VistaLab Technologies	4060-9025
Guava easyCyte 5HT 벤치탑 유세포 분석기	EMD Millipore	0500-4005
NIH Clinical Collections 1 및 2 small molecule libraries	Evotec
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
>신경 줄기 세포 배지(500mL) 제조용			최종 농도
BSA	GoldBio.com	A-421-250	0.20%
DMEM/F12 10X	Corning	90-091-PB	1X
헤파린 나트륨 염	Sigma Aldrich	H3149	0.0002%
HEPES 1M	Sigma Aldrich	H4036	5.4 mM
인슐린-트랜스페린- 셀레늄 (ITS -G) (100X)	Life Technologies	41400-045	1X
NaHCO3	시그마 알드리치	S-5761	14.5 mM
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL) 100X	Gibco	15140-122	1X
프로게스테론	시그마 알드리치	P8783	16 nM
푸트레신	시그마 알드리치	P5780	4.8 &마이크로; M
Basic FGF (FGF2), Human	GoldBio	1140-02-50	10 ng/ml
EGF, Human	GoldBio	1150-04-100	20 ng/ml
보틀탑 필터, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind	Corning	431160	Sterlize 매체를 필터링하는 데 사용