교류 Cytometry 기반 약물 세포종 줄기 세포의 세포 분화를 촉진 하는 작은 분자의 식별에 대 한 시스템 검사

요약

효율적인 심사 프로토콜 astroglial 분화 세포종 줄기 세포 (GSCs)에 홍보 하는 작은 분자의 식별을 위해 제공 됩니다. 분석 결과 줄기 세포 감 별 법 기자에 의하여 향상 된 GFP (eGFP)의 식을 인간의 GFAP 발기인에 의해 구동 됩니다 기반으로 합니다.

초록

세포종 (GBM)은 미국 에서만 매년 약 14000 죽음을 일으키는 원인이 되는 성인에서 가장 일반적이 고 가장 치명적인 기본 뇌 종양. 메디아 생존 진단 다음 최대한 외과 절제술, 방사선 및 temozolomide 요법으로 15 개월 미만 이다. 더 효과적인 GBM 치료법 개발에 도전 점점 더 분명 되 고 등의 탄력성이 침입, 표준 치료에 그것의 저항, 그것의 복잡 한 유전 및 분자 적응성, GBM의 모집단 정상 줄기 세포, phenotypic 유사성과 셀 본 세포종 줄기 세포 (GSCs) 라고. GSCs 종양 성장 및 진행을 위해 필요 하기 때문에 차별화에 기초를 둔 치료가 불 치의 신생에 대 한 가능한 치료 양식 적임을 나타냅니다.

다음 프로토콜 플랫폼 GSC astroglial 차별화를 홍보 하는 작은 분자의 식별 목적으로 상영 높은 처리량을 설정 하는 절차의 컬렉션을 설명 합니다. 시스템의 핵심에는 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 차별화 기자-구문입니다. 다음과 같은 일반적인 절차를 포함 하는 프로토콜: (1) 설립 GSC 차별화 기자 라인; (2) 테스트/유효성 검사 GSC 자체-갱신/clonogenic 용량; 기자의 관련성 그리고 (3) 높은-용량 cytometry 마약 검사를 기반으로.

심사 플랫폼 GSCs 차별화를 홍보 하는 작은 분자를 식별 하는 간단 하 고 저렴 한 접근을 제공 합니다. 또한, FDA 승인 약품의 라이브러리의 활용 더 급속 하 게 내리거나 수 에이전트의 식별에 대 한 가능성을 보유 하고있다. 또한, 암 줄기 세포 분화를 촉진 하는 치료 대상 및 주로 더 차별화 된 암 세포를 제거 하기 위해 표시 되었습니다 현재 "표준 치료" 치료 공동 성으로 작동 하도록 예상 된다.

서론

최근 연구는 작은 인구를 포함 하는 종양 세포, 암 줄기 세포 (CSCs) 또는 시작 하는 종양 세포 나의 종양 진행, 전이, 그리고 항 암 치료 및 라디오 치료 ^1, 저항에 대 한 책임은 ². 암 줄기 세포 및 종양 내의 그들의 분화 progenies intratumoral이 추진 하는 중요 한 요소를 간주 하 고 따라서 암³치료에 주요 장애물을 나타냅니다. 종양 세포 계층, 암 줄기 세포 이론에 의해 제공 된 치료 암 ⁴새로운 전략의 개발 영감 하고있다. 암 줄기 세포를 대상으로 하는 한 가지 방법은 식별 하 고 영향을 받는 장기의 배아 발달 동안에 필요한 것으로 알려져 있습니다 신호 경로 억제 하는 것입니다. 사실, 우리와 다른 사람 신경 줄기 세포 관련 신호 경로 소닉 고슴도치와 노치 세포종^5,,67에 대 한 지속적인 요구를 설명 하는 여러 논문을 출판 이전 했습니다. 이 작품은 여러 GBM 임상 시험에 대 한 근거를 응고에 도움이 되었습니다. 암 줄기 세포를 대상으로 두 번째 방법은 그들의 차별화 홍보 하는 것입니다. 이 방법은 retinoic 산 (ATRA, 비타민 A 아날로그)와 급성 promyelocytic 백혈병 치료에 전 임상 및 임상 연구에서 유리한 결과로 인해 지원 많이 받았습니다. 여기 ATRA 성숙 블록을 제거 하 고 암 세포 감 별 법⁸촉진 발견 됐다. 더 최근에, Piccirillo와 동료 우아하게 나타났습니다 BMP-4 중요 한 안티-GBM 효과 생체 외에서 그리고 vivo에서⁹이다에 GSC 차별화를 촉진.

현재 연구에 대 한 근거 GSCs를 대상으로 "역된 공학" 접근을 기반으로 합니다. GBM와 암의 특징 중 하나 되 고 불 쌍 한 차별화와 광대 한이 감안할 때, 우리는 경우 우리는 호의 베푸는 표현 형-사이토와 같은 상태로 차별화 홍보 수 물었다. 여기, 우리가 특정된 종양 견본에서 GSCs를 유지 하지만 오히려 원하는 표현 형 (예: GFAP 양성) 달성을 목표로 하는 신호 통로의 사전 지식이 필요가 없습니다.

이 보고서는 GSC 차별화 기자-라인 GSC 농축 문화 변환에서 GSC 클론 선택 영역을 설정 하는 데 사용 하는 절차를 설명 합니다. 세포종 neurosphere 라인 사용 병원 산 라파엘 레-밀라노, 이탈리아에서 기본 세포종의 진단 가진 환자에서 교수 안젤로 Vescovi의 실험실에서 설립 되었다. 이 라인은 여러 간행물 ^{6,10,,1112,13,14}에서 광범위 하 게 연구 되었습니다. 그들의 실험실에서 이러한 기술을 구현에 관심이 있는 개인 공부를 계획 하는 세포에서 암 줄기 세포 자체 갱신 용량 기자의 관련성 확인 것이 좋습니다 (이 어떤 기자). 생체 외에서 clonogenic 분석 실험은 분야에서 허용 중 하나에 대 한 자세한 프로토콜이^15,16을 달성 하기 위해 제공 됩니다. 마지막으로, cytometry 기반 약 스크린에 차별화 기자-라인의 활용을 설명 하는 상세한 프로토콜 끝에 제공 됩니다. 노트, 마찬가지로 astroglial 차별화 시스템 설명, 우리 성공적으로 설립 하 고 GSC 기자 라인 MAP2:GFP (신경 분화) 기자를 통합 검증. 따라서,이 방법론 설명 종이 다양 한 세포 계보에 세포 분화 연구에 적용할 수 있습니다.

이 보고서에 있는 숫자 중 일부는 최근 간행물에서 찾을 수 있습니다: "Atracurium Besylate 다른 신경 근육 차단 에이전트 astroglial 차별화 홍보 및 세포종 줄기 세포¹⁸고갈.

프로토콜

참고: Astroglial 및 신경 lentivirus 기자 시스템 사전 패키지, 집중 lentiviral 준비로 구매 되었다. 교류 cytometry 기술의 기본 지식이 필요 합니다. 또한,이 프로토콜을 사용 하는 전체에 대 한 사용자 흐름 cytometer 높은 처리량 용량 (샘플 소스로 96 잘 접시를 허용)에 대 한 액세스를 해야 합니다.

1. lentiviral Transcriptional 기자 시스템

참고: 모든 흐름 cytometric 분석에 사용 하 여 부모, 비 불리고, 셀 또는 벡터 불리고 (비 형광) 셀 설정 기준 형광. 또한, 유의 하십시오, 기계적 분쇄 이라고 어디 모든 단계에서 부드러운. 가혹한 분쇄 연약한 GSCs의 상당한 수를 죽 일 고 흐름 cytometry 결과 영향을 미칠 수 있습니다.

1. 플레이트 1 x 10⁶ 셀 6 multiwell 격판덮개에 완전 한 신경 줄기 세포 성장 매체의 2 ml.
2. Lentivirus 기자 5 크거나 감염 (moi)의 다양성에 추가 하 여 셀 transduce.
3. 8 µ g/mL의 최종 농도 대 한 polybrene의 2 µ L를 추가 합니다.
4. 37 ° C, 5% CO₂ 에서 셀을 밤새 품 어.
5. 다음 날, 성장 매체 언바운드 바이러스 제거를 교체 합니다. 37 ° C, 5% CO₂ 배양 기에 다시 접시를 놓고 24 h에 대 한 품 어.
6. 수확 0.5 mL 전체 볼륨; 360 x g 15 mL 원뿔 튜브에 실 온에서 5 분에 셀 아래로 회전 하 고 열망 하 여 상쾌한을 제거 합니다. 나머지 셀에 신선한 신경 줄기 세포 성장 매체의 0.5 mL을 추가 하 고 지속적인된 확장을 위한 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
7. 분리 시 약의 200 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 품 어
8. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 세포 분열.
   참고: 가혹한 분쇄 GSCs의 중대 한 살해 귀 착될 지도 모른다, 완전 한 분리는 일반적으로 20-30 시간 후 이루어집니다.
9. 셀 첨부 파일 또는 집계를 최소화 하기 위해 800 µ L의 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 1 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다.
10. 각 세포 현 탁 액의 200 µ L 96 multiwell 격판덮개의 우물에 전송.
11. 이 절차에 대 한 96 잘 접시 기능이 여기 블루 레이저와 녹색 형광 단백질을 검출 하는 능력을 갖추고 있는 벤치탑 교류 cytometer를 사용 합니다. 각 인수에 대 한 적어도 10000 가능한 셀 흐름 cytometric 분석을 수행 합니다.
12. Cytometry 여 GFP-긍정적인 세포의 백분율을 결정 합니다.

2. subclone 선택, 확장, 및 유효성 검사

1. 96-multiwell 격판덮개의 우물 당 0.7 세포의 밀도에서 신경 줄기 세포 매체의 100 µ L에 플레이트 세포.
2. 문화를 37 ° C, 5% CO₂에 11 일에 대 한 복제. 이 단계 높은 종속 셀 종류 이며, 셀 라인 사용에 따라 조정 필요 합니다. 일반적으로 구체 직경 ≥ 100 µ m는 neurospheres에서 clonogenic GSCs의 존재의 좋은 표시 이다.
3. FITC 필터 장착 형광 현미경을 사용 하 우물 단일 neurosphere 포함 하는 셀의 1 ~ 5% 되 GFP-긍정적인 표시 합니다.
   참고: 결정 GFP-긍정적인 세포의 정확한 백분율은이 시점에서 너무 중요 하지 않다. subclones의 각 나중 cytometry에 의해 평가 됩니다. 총을 줄이기 위해이 단계를 수행 하는 수에 의해 시작 되는 neurospheres에 중점을 두고 분석 하는 클론의 undifferentiated, GFAP-부정, GSC.
4. Cytometry 분석에 대 한 셀의 충분 한 수 있습니다 때까지 선택 된 기자 클론을 확장 합니다. ≤ 1.5x10⁵ 셀/mL를 포함 하는 6-multiwell 격판덮개의 하위 confluent 잘 셀의 충분 한 번호를 제공 해야 합니다.
   참고: 격리와 GSCs의 확장에 대 한 자세한 절차는 사용할 수 ¹⁷.

3. Cytometry GFAP:GFP 식의 결정

1. 각 기자 복제 및 GFP-긍정적인 세포의 정확한 비율을 결정 하기 위해 비 불리고 컨트롤 셀 (0.5 mL)의 약 수를 수확. 고려 기자 클론 1 ~ 5 %GFP-긍정적인 세포를 포함 하는.
2. 실 온에서 5 분 동안 360 x g에서 셀 회전 고 열망 하 여 상쾌한을 제거 합니다.
3. 각 펠 릿 세포 분리 시 약의 200 µ L을 추가 하 고 37 ° c 설정 물 욕조에 튜브를 품 어
4. (보통 20 ~ 30 배) 사이의 단일 세포 현 탁 액을 달성 하기 위해 부드럽게 셀 triturate
5. 셀 첨부 파일 또는 집계를 최소화 하기 위해 800 µ L HBSS 1 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다.
6. 각 세포 현 탁 액에서 96 multiwell 격판덮개의 우물 당 200 µ L를 전송 합니다.
7. 이 절차에 대 한 96 잘 접시 기능이 있는 벤치탑 교류 cytometer를 사용 합니다. 각 인수에 대 한 적어도 10000 가능한 셀 흐름 cytometric 분석을 수행 합니다.

4. 엘 다 자기 갱신 분석 결과 Clonogenic 용량을 평가 하

참고: 컨트롤에 대 한 모두 부모의 비 불리고, 뿐 아니라, GFP 표현 lentivirus 불리고 셀 사용 해야 원래 GSC 문화는 그들이에 GSC 차별화 기자 라인의 상대 clonogenic 잠재력을 결정 하 파생.

1. 위에서 설명한 대로 차별화 기자 subclones 단일 셀 정지로 해리.
2. 플레이트 셀 셀 밀도 잘 당 5, 500 세포 사이에서 완전 한 신경 줄기 세포 성장 매체의 100 µ L에서 96 multiwell 격판덮개에.
3. 37 ° C, 5% CO₂에서 9 ~ 11 일에 대 한 셀을 품 어.
4. Neurospheres는 가벼운 현미경의 직접 시각화 하 여 긍정적인 웰 스 점수. 잘 "긍정적인" 적어도 하나의 큰 neurosphere 포함 하는 경우 고려 되어야 한다.
5. 데이터 연결: 웰 스 분석 및 http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html에서 사용할 수 있는 엘 다 온라인 인터페이스를 사용 하 여 양수 우물의 수.

5. 약물 라이브러리 희석 준비

1. -80 ° C에 저장에서 라이브러리 번호판을 제거, 알루미늄 호 일 커버 (빛에 민감한 화합물 보호). 실 온에서 1 시간 30 분 약 thaw.
2. 12 채널 멀티 채널 pipettor를 사용 하 여 완전 한 신경 줄기 세포 매체에 0.2 m m를 라이브러리 화합물을 희석. 성장 매체에서 10 %DMSO 희석
   참고: DMSO의 최종 농도 0.1% 셀에 추가 해야 합니다. 문화에 있는 DMSO의 높은 농도 독성에 발생할 수 있습니다. 이러한 이유로, 치료 전에 사용 세포 선에서 DMSO에 감도 테스트 하는 것이 좋습니다.
3. 차량 제어로 DMSO를 사용 하 여 셀 (열 1, 12; 각 판의 왼쪽 및 오른쪽 열에서 발견 치료 웰 스 A H 통해)입니다.
4. 커버 알루미늄 호 일로 희석된 라이브러리 접시 하 고 장기 저장을 위한-80 ° C 냉장고를 원래 라이브러리 접시를 반환 합니다.

6. 약 스크린

참고: DMSO 치료 셀 설정 기준 형광 게이팅 조정 하는 사용 되어야 한다.

1. 5 x 10³ 셀 완전 한 신경 줄기 세포 성장 매체의 99 µ L에서 96 multiwell 격판덮개에 격판덮개.
2. 12 채널 멀티 채널 pipettor를 사용 하 여 셀 2 µ M (세포 현 탁 액의 99 µ L에 0.2 m m 약 1 µ L)의 최종 농도에 희석된 라이브러리 화합물 또는 DMSO (제어) 취급 합니다. 37 ° C, 5% CO₂에서 72 h에 대 한 번호판을 품 어.
3. 12 채널 멀티 채널 pipettor를 사용 하 여 각 잘 하 셀 분리 시 약의 150 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 20 분 동안 품 어
4. 단일 셀 서 스 펜 션 (20 ~ 30 번) 사이 보통 달성 될 때까지 부드럽게 12 채널 멀티 채널 pipettor 함께 분쇄 하 여 세포를 분리. Neurospheres를 완전히 분리 하는 데 필요한 시간의 양을 GSC 라인 사이 달라질 수 있습니다. 권장된 셀 분리 시 안전은 (자료 참조) 최대 45 분간 인큐베이션 했다 생존 능력에 영향을 주지 않습니다 여러 GSC 라인 테스트 하는 동안 심사에 사용 될 각 GSC 라인에 대 한 확인 합니다.
   참고: 각 최종 볼륨 잘 이어야 한다 대략 250 µ L (세포 현 탁 액의 100 µ L +의 세포 분리 시 약 150 µ L).
5. GFAP:GFP 기자 cytometry로 표현 하는 세포의 백분율을 결정 합니다. 표준 제어 전략을 사용 합니다. 먼저, 셀 크기와 생존의 일반적인 감각을 얻을 하 고 측면 없앤다 플롯. 다음 가능한 단일 세포 인구에 게이트를 놓습니다. 이것은 인구 녹색 형광 (eGFP) 결정 됩니다. "히트" 긍정적으로 간주 됩니다 (DMSO 처리) 어떤 화합물 GFP-긍정적인의 비율에 있는 증가 세포 3 표준 편차에 의해 제어 이 임계값에 따라 특정 응용 프로그램 및 원하는 엄중 조정 되어야 한다.
   참고: 높은 처리량에 대 한 스크린은 권장 단일 GSC 기자 subclone를 사용 하 여. 히트 식별 다음 각 히트 같은 GSC 선에서 추가 기자 subclones에 대 한 확인 되어야 합니다. 사실 조회에 대 한 신뢰도 증가 하는 또한 것이 좋습니다 라인 다른 GSC neurospheres에서 격리 화합물 기자 subclones에 대 한 테스트.

결과

3 개의 독립적인 환자 파생 neurospheres 라인 Zeocin 저항 카세트 녹색 형광 단백질 (GFP) 융합에 프레임에 대 한 인코딩 lentivirus astroglial 기자와 불리고 되었고 인간의 GFAP 발기인 요소 ( 에 의해 구동 그림 1). 다음 개별 클론 96 잘 접시 (그림 2)에 잘 당 0.7 셀을 도금 하 여 고립 되었다,이 GFP (그림 3)를 표현 하는 세포의 백분율의 흐름 cytometric 결정에 의해 그 뒤를 이었다. Neurosphere 클론, ≤ 5 %GFP-긍정적인 세포를 포함 하는 단일 셀에서 파생 이라고 GL (GFAP 낮은) ≥75 %GFP 긍정적인 세포를 포함 하는 클론 GH (GFAP 높은) 라고 하 고는 GL에 비해 더 분화 될 것으로 간주 됩니다. subclo...

토론

그들을 정의 하는 표식에 주로 집중 하는 GSCs의 이전 연구의 대부분,이 연구에서 우리가 결정 역 접근 하는 것. 우리는 GSCs (예를 들어, 셀 astroglial와 신경 마커)에 의해 생성 된 차별화 된 progenies에 주로 집중 한다. 여기 우리 인간의 GFAP 발기인 종속 식을 GFP의 기반 시스템 심사 높은 처리량 셀 기반 약물의 사용을 보여 줍니다. 모든 실험 환자 파생 neurosphere 세포종 세포 라인을 활용 하 여 수행 했다. 분리와이 라인의 확장을 설명 하는 상세한 프로토콜 Galli 외¹⁷에 설명 되어 있습니다.

시스템 뿐만 아니라 GSCs의 세포 분화를 유도 할 수 있다 그러나 또한 도움이 우리가 astroglial 분화 마커 GFAP 표현 결정 명백 하 게 결정 하는 작은 분자의 식별에 우리를 원조는 GSC 주파수를 비교 하 여 개별 GBM 셀의 clonogenic 용량. ELDA 분석 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ESGRO Complete Accutase	EMD Millipore	SF006
디메틸설폭사이드(DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)	Sigma Aldrich	H6648
Human GFAP Differentiation Reporter(pGreenZeo, 바이러스)	SBI(System Biosciences)	SR10015VA-1
50ml 멸균 일회용 시약 저수지	Corning	4870
6 웰 플레이트	Thermo Fisher Scientific	130184
96 웰 플레이트	Falcon	353072
Biolite T25 cm² 플라스크 벤티드	써모 피셔 사이언티픽	130189
바이올라이트 T75 cm² 플라스크 벤티드	써모 피셔 사이언티픽	130190
15 ml 원심분리기 튜브	Celltreat	229411
1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브	Fisher Scientific	05-408-129
Ovation 멀티 채널 피펫, 12 채널, 0.5 - 20uL	VistaLab Technologies	1060-0020
Ovation 멀티 채널 피펫, 12 채널, 5-250uL	VistaLab Technologies	1060-0250
멀티 12채널 피펫 팁 25 μ l	VistaLab Technologies	4060-1002
멀티 12채널 피펫 팁 250 μ l	VistaLab Technologies	4060-9025
Guava easyCyte 5HT 벤치탑 유세포 분석기	EMD Millipore	0500-4005
NIH Clinical Collections 1 및 2 small molecule libraries	Evotec
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
>신경 줄기 세포 배지(500mL) 제조용			최종 농도
BSA	GoldBio.com	A-421-250	0.20%
DMEM/F12 10X	Corning	90-091-PB	1X
헤파린 나트륨 염	Sigma Aldrich	H3149	0.0002%
HEPES 1M	Sigma Aldrich	H4036	5.4 mM
인슐린-트랜스페린- 셀레늄 (ITS -G) (100X)	Life Technologies	41400-045	1X
NaHCO3	시그마 알드리치	S-5761	14.5 mM
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL) 100X	Gibco	15140-122	1X
프로게스테론	시그마 알드리치	P8783	16 nM
푸트레신	시그마 알드리치	P5780	4.8 &마이크로; M
Basic FGF (FGF2), Human	GoldBio	1140-02-50	10 ng/ml
EGF, Human	GoldBio	1150-04-100	20 ng/ml
보틀탑 필터, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind	Corning	431160	Sterlize 매체를 필터링하는 데 사용