초파리 Melanogaster 성인 간접 비행 근육의 광 단면 근육 면적 결정

Summary

우리는 초파리 성인 근육 질량을 결정 하는 간접적인 방법 근육 영역을 측정 하는 방법을 보고 합니다. 간접 비행을 분석 하 여 우리의 방법론의 응용 근육 Myotonic 영양 질병의 초파리 모델에서 설명 합니다.

Abstract

근육 질량을 낭비 하 고, 근육 위축으로 알려진 신경 근육 학 질병의 초파리 모델에 일반적인 표현 형 이다. 우리는 파리, 특히 dorso 경도 근육 (DLM), 위축 형 다른 유전적 원인에 의해 초래 하는 측정 대상 실험으로 간접 비행 근육 (IFMs)를 사용 했습니다. 이 프로토콜에서 우리 반 얇은 단면에 대 한 비행 흉부 근육을 포함 하는 방법, 근육과 주위 조직 사이 좋은 대조를 방법 및 반자동 수집 가능한 데이터의 광학 현미경 이미지를 처리 하는 방법을 설명 하 고 분석입니다. 우리는 방법론 파이프라인의 세 가지 특정 응용 프로그램을 설명합니다. 첫째, 우리가 어떻게 방법 myotonic 영양 플라이 모델; 근육 퇴보를 계량에 적용할 수 있는 표시 둘째, 근육 단면적의 측정 홍보 하거나 근육 위축 및 근육 퇴보; 방지 유전자를 식별 하는 데 도움이 수 있습니다. 셋째,이 프로토콜 후보 화합물은 크게 질병 유발 돌연변이 의해 유도 된 주어진된 위축 한 표현 형을 수정할 수 있는지 여부를 결정에 적용할 수 있는또는 환경 방 아 쇠.

Introduction

과일 파리의 흉부 비행 근육, 기능, 생리학 및 해부학 적 구분의 두 개의 서로 다른 클래스를 포함 합니다. 이 근육은: dorso 경도 (DLM)와 (DVM) dorso-복 부 근육 (그림 1), 및 동기 비행으로 구성 된 간접 비행 근육 (IFM), 제어 근육^1,2. 이 근육은 함께 비행에 필요한 높은 기계적인 힘을 생성 합니다. 크기, 분포 및 rostro 꼬리 처리는 IFMs의 횡단 단면³ (그림 2A)에 대 한 쉬운 방향을 허용. 이러한 이유로, 우리는 이러한 근육 근육 위축 초파리 melanogaster에서 공부 하를 선택 했습니다.

그림 1입니다. 보여주는 간접적인 비행 근육 (IFMs) 배열 하는 과일 파리의 흉....

Protocol

1. 고정 및 수 지 포함

1. 이산화탄소 (CO₂) 또는 저체온증 얼음 블록을 사용 하 여 통해 파리 anesthetize (전체 비행을 보고 낮은 확대)와 함께 해 현미경과가 위를 사용 하 여 다리, 날개, 머리와 복 부는 정착 액의 침투를 촉진 하기 위하여의 터미널 부분을 제거 하. 시체의 신중한 처리는 흉부의 변형 방지 하려면이 단계에서 필요 합니다.
   참고: 프로시저의 끝에서 제대로 처리 된 개인의 충분 한 숫자를 보장 하기 위해 유전자 당 최소 12 파리와 시작.
2. 솔루션 1의 얼음 (관 당 6 개인의 최대 배치) 포함 200 µ L에 1.5 mL 튜브에 시체를 전송.
   참고: 시체 20 분 이상에 대 한 솔루션 1에에서 남아 있을 수 없습니다.
   1. 솔루션 1에 대 한 혼합이 볼륨 비율 구성 요소: ¼ 4 %paraformaldehyde, ¼ 8%도, ¼ 0.2 M 나₂HPO₄ 및 ¼ 0.2 M NaH₂포₄.
3. 솔루션 2의 200 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 얼음에 품 어.
   1. 해결 방법 2: 솔루션 1과 1:1 (v/v) 비율에 OsO₄ 혼합.
      주의: Os....

Results

척도 MblC의 overexpression 또는 Abp1의 관리 Myotonic 영양 비행 모델의 위축 형에 어떤 영향을 미쳤다 여부를 우리가 IFMs (그림 1)의 일부인 DLMs에 집중 했다. 우리는 모델 파리는 Myosin 중 연쇄 발기인 (Mhc)에 의해 구동 하는 근육에 걸쳐 250 비 코딩 CTG 반복 표현 결정-Gal4, 파리 제어에 비해 근육의 50% 감소 했다. 반면, 동일한 드라이버 MblC 및 확장 된 CTG 반복의 공동 식 강력 하 게 억제 같은 표현 형 그리고 crossectional 근육 지역 제어 (일반)의 70%를 했다. 영양 미디어에서 Abp1 hexapeptide의 관리는 마찬가지로 위축 형, 그리고 화합물 DM1 파리;의 전형 50% (대신 정상적인 근육의 대략 60%를 보여준 찍은 모델 파리 억제 그림 2E)입니다.......

Discussion

초파리 melanogaster 인간의 신경 근육 학 질병^7,,1011, Myotonic Dystrophies의 모양으로 특징을 포함 하 여 연구에 유용한 모델 임을 입증 되었습니다. 근육 위축입니다. 여기에 제시 된 프로토콜 발병 또는 플라이 모델에서 특정 질병의 진행으로 인 한 근육 퇴보를 측정을 위한 유용한 도구입니다. 예를 들어 따라 다양 한 연령대의 파리에서이 분석을 수행 하 여 근육 섬유의 변성을 계량 하 이기도 합니다.

프로토콜에 중요 한 단계가 있습니다. 그들의 고정 하기 전에 파리를 해 부 하는 데 필요한 시간이 조직의 저하를 방지를 최소화 시켜야 한다. (그림 6) 근육에서 통 솔루션의 침투에 대 한 제거 머리, 날개, 다리의 내부에 솔루션에 대 한 액.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Image-J 소프트웨어	, National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/
초박 절편기	Leica Leica	UC6
현미경	Leica Leica	MZ6	명시야 기술.
면도날	전자 현미경 과학	71970	여러 대체 제공 업체가 있습니다.
Scissors	World Precision World	14003	여러 대체 공급자가 있습니다.
임베딩 금형	전자 현미경 과학	70900	여러 대체 제공 업체가 있습니다.
글루타르알데히드	플루카(시그마)	49624	독성.
OsO4	Polyscience	0972A	매우 독성이 있습니다.
프로필렌 옥사이드	시그마 알드리치	82320-250ML	매우 독성이 있습니다.
수지 (Durcupan)	Sigma Aldrich	44611-44614	중합되지 않은 경우 발암성.
Toluidine 블루	Panreac	251176	독성.
장착, 매체 (DPX)	Sigma Aldrich	44581	위험.
파라포름 알데히드	시그마 알드리치	P6148-500G	유해한.
Na2HPO4	Panreac	122507	0.2M 희석.
NaH2PO4	Panreac	121677	0.2M 희석.
붕사	Panreac	3052	독성.