방법 논문

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

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DOI:

10.3791/56186

⸱

2017년 8월 29일

 ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular Medicine Cologne (CMMC), University of Cologne, 2Cologne Center for Genomics (CCG), University of Cologne, 3Cologne Excellence Cluster for Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), Research Center and Systems Biology of Ageing Cologne, University of Cologne

이 논문에서

요약

여기, 우리는 chromatin immunoprecipitation (칩) 및 칩 seq 라이브러리 준비 프로토콜 낮은 풍부한 닭 배아 샘플에서 글로벌 epigenomic 프로 파일 생성을 설명 합니다.

초록

Chromatin immunoprecipitation (칩) post-translationally 수정된 히스톤, 히스톤 변형, 녹음 방송 요인, 또는 주어진된 장소에서 또는 게놈 넓은 규모로 chromatin 수정 효소의 지역화를 매핑하기 위한 널리 사용 기법입니다. 다음-세대 시퀀싱 (즉, 칩 Seq) 칩 분석 실험의 조합 세계적으로 유전자 규제 네트워크를 폭로 하 고 특히 비 코딩 규제 시퀀스의 유전자의 기능 주석 개선 하기 강력한 접근 이다. 칩 프로토콜은 일반적으로 많은 양의 세포 소재, 따라서 희귀 세포 유형 또는 작은 조직 생 검 조사 하는 것이 방법의 적용 제외 필요 합니다. 칩 분석 결과 얻어질 수 있는 일반적으로 생체 내에서 초기 척추 embryogenesis 동안 생물 학적 물질의 양을와 호환을 위해 여기 있는 단계 수를 완료 하는 데 필요한 간단한 칩 프로토콜 설명 합니다 분석 결과 샘플 손실을 최소화 하기 위해 감소 했다. 이 칩 프로토콜은 다양 한 배아 닭고기와 성인 마우스 조직 낮은 중간 셀 숫자 (5 x 104 -5 x 105 셀)를 사용 하 여 다른 히스톤 수정 조사를 성공적으로 사용 되었습니다. 중요 한 것은,이 프로토콜은 표준 라이브러리 준비 방법을 사용 하 여 칩 seq 기술과 호환, 관련성이 높은 배아 조직에 지도 글로벌 epigenomic 제공.

서론

히스톤 포스트 번역 상 수정 녹음 방송, 복제 및 DNA 복구1,2,3를 포함 하 여 다양 한 chromatin 종속 프로세스에 직접 참여 하는. 또한, 다른 히스톤 수정 보여 긍정적인 (예를 들어, H3K4me3 및 H3K27ac) 또는 음수 (예를 들어, H3K9me3 및 H3K27me3) 유전자 발현 상관 관계 광범위 하 게 정의 될 수 있는 활성화 또는 억압 적인 히스톤 표시로 각각2,은3. 따라서, 글로벌 히스톤 수정 지도, epigenomic 지도 라고도 기능적으로 척 추가 있는 게놈4,5주석을 강력 하 고 보편적인 도구로 떠오르고 있다. 예를 들어 원심 규제 시퀀스와 같은 강화를 확인할 수 있습니다에 따라 특정 chromatin 서명의 존재 (예를 들어, 활성 강화: H3K4me1 및 H3K27ac)는 근 위 발기인 지구에서 그들을 구분 (예를 들어, 활성 발기인: H3K4me3)6,,78. 다른 한편으로, 정체성 규정 하는 주요한 세포 기능을 가진 유전자는 일반적으로 넓은 chromatin 도메인 기본 유전자의 transcriptionally 활성 또는 비활성 상태에 따라 H3K4me3 또는 H3K27me3, 각각 표시 된9 발견 ,10. 마찬가지로, 주요 셀 정체성 유전자의 표현을 자주 여러 고 공간적 제어를 클러스터 강화 (즉, 슈퍼 강화), 광범위 한 H3K27ac 표시 된 도메인11로 확인 될 수 있다 보인다.

현재, 히스톤 수정 지도 칩 (칩 microarrays 결합) 같은 이전 방법에 비해 더 적은 소음, 큰 범위, 및 낮은 적은 유물 높은 해상도 제공 하는 칩 seq 기술을 사용 하 여 생성 됩니다. 비용12. 그럼에도 불구 하 고, epigenomic 맵 칩 seq 기술을 사용 하 여 생성의 한계, 주로 관심의 샘플에서 칩을 성공적으로 수행 하는 능력을 연관 있다. 전통적인 칩 프로토콜은 일반적으로 수백만의 세포를 체 외에서 세포를이 방법의 적용 라인 또는 세포는 제한 쉽게 격리 수 vivo에서 (예를 들어, 혈액 세포) 필요 합니다. 지난 몇 년 동안, 여러 수정된 칩 프로토콜 낮은 셀 숫자와 호환 설명된13,14,,1516되었습니다. 그러나, 이러한 프로토콜은 다음-세대 시퀀싱 (즉, 칩 seq)와 결합 하도록 특별히 설계 된 그리고 그들은 일반적으로 임시 라이브러리 준비 방법13,14, 를 사용 하 여 15 , 16.

여기, 우리는 히스톤 수정 프로필 중간에 낮은 셀 숫자 (5 x 104 -5 x 105 셀)를 사용 하 여 조사 하는 데 사용할 수 있는 칩 프로토콜 설명 (즉, 칩 정량) 중 선택한 loci 또는 전역 (즉, 칩 seq) (그림 1). 칩 seq 기술 결합 때 우리의 칩 프로토콜 표준 라이브러리 준비 방법, 따라서 많은 실험실10에 광범위 하 게 액세스할 수 있도록 함께 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 여러 히스톤 부호를 조사 하기 위해 사용 되었습니다 (예를 들어, H3K4me3, H3K27me3, 및 H3K27ac) 다른 닭 배아 조직 (예를 들어, 척추 신경 관 (SNT), frontonasal 굴지, 및 epiblast)에. 그러나, 우리는 그것은 다른 유기 체는 생물학적 및 임상 관련 샘플만 얻을 수 낮은 금액에 광범위 하 게 적용 해야 예상.

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프로토콜

기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 승인이 독일 동물 보호 지침에 따라 닭 배아 실험을 수행 하는 데 필요한 했다. 로컬 지침에 따라 닭 HH44 (18 일) 배아와 이전 실험만 IACUC 승인이 필요합니다. 그러나,이 연구에 사용 된 배아 배아 개발의 초기 단계에서 모두 있었다 (즉, HH19 (72 h)).

참고:이 프로토콜의 목적에서 정량 또는 다음-세대 시퀀싱 (즉, 칩 seq) 히스톤 수정 조사를 효과적으로 결합 될 수 있다 칩 분석 결과 대 한 자세한 설명을 제공 하는 낮은 풍부 배아 샘플 (5 x 10 4에서 배열-각 칩 반응에 대 한 5 x 10 5 셀) 및 다른 조직 유형 ( 그림 1). 프로토콜은 바인딩 프로필 녹음 방송 요인과 공동 활성 (예를 들어, p300)의 조사에 적용 해야 합니다. 그러나, 이러한 규제 단백질의 더 낮은 풍부 때문 큰 핸드폰 번호 필요 (5 x 10 5-각 칩 반응에 대 한 5 x 10 6 셀) 될 가능성이 있습니다.

1.의 달걀과 닭고기 SNT의 기정

참고: 조직에 조직에서 및 동물 모델을 동물 모델에서 microdissections에 대 한 절차는 기술적으로 다른. 이 섹션 해 부 프로토콜에서 가져오는 데 사용 상 완 SNT 섹션 단계 HH19 닭 배아 예를 들어 자세히 설명 합니다.

  1. 닭 배아 단계 HH19를 3 일 동안 37 ° C와 80% 습도에 가로 방향에서 현지 개종에서 가져온 비옥한 백색 레그 혼 닭이 달걀을 품 어.
  2. 햄버거와 해밀턴 단계 닭 배아 발달 준비 시스템 17 결정.
  3. 차가운 조건 하에서 모든 microdissections 수행; 그렇지 않으면, chromatin 무결성 노출 될 수 있습니다.
  4. HH19 배아 분리.
    1. 배아를 액세스할 수 있도록 하는 blastoderm 낮은 바늘 (0.90 x 40 m m)와 10 mL 주사기를 사용 하 여 알 부 민 3 mL 추출.
    2. 좋은 위를 사용 하 여 계란에 작은 개통을 확인 하 고 로크 솔루션의 1 mL을 추가 (제조 법에 대 한 보충 자료 참조) 여분 미 발달 세포 막의 제거를 촉진 하기 위하여.
    3. 배아의 시각화를 쉽게 하는 blastoderm에서 바늘 (0.55 x 25 m m 2) 1 mL 주사기를 사용 하 여 10% 인도 검정 잉크/로크 솔루션을 주입.
    4. 의료 수술 잘가 위 집게를 사용 하 여 태아를 둘러싸는 여분 미 발달 막 잘라.
    5. 구멍된 숟가락을 사용 하 여 4.5 cm 배양 접시 20 mL PBS 솔루션 x 1의를 포함 하는 배아를 전송.
  5. 는 amnion 및 좋은 시저 및 집게는 stereomicroscope에서 사용 하 여 여분 미 발달 막의 나머지 부분을 멀리 해 부.
  6. Caudally SNT ( 그림 2)을 흉부 지역으로 확장, 태아의 상 완 수준에서 가로 SNT 세그먼트를 잘라.
  7. 옆/ventrally SNT (예를 들어, 옆 격판덮개 mesoderm, ectoderm, notochord, 및 대동맥)를 둘러싸고 조직 제거 집게 ( 그림 2)를 사용 하 여.
  8. 3.5 cm 따뜻한 (37 ℃) 트립 신 (Trypsin/EDTA 솔루션 1: 250)의 5 mL를 포함 하는 배양 접시에에서 각 해 부 치킨 SNT 세그먼트 몰입할.
  9. 트립 신 치료 중지는 stereomicroscope에서 감지 되는 SNT 주위 비 신경 조직의 완화.
    참고: trypsinization 시간 긴밀 하 게 제어 해야-소화 및 신경 조직의 분산을 방지 하 고는 SNT의 구조적 무결성을 유지.
  10. 트립 신 처리 후 나머지 엽 및 ectodermal 조직 준비 깨끗 한 SNT 섹션을 수동으로 제거.
  11. 전송 SNT 섹션 1.5 mL 튜브에와 플래시-액체 질소에서 그것은 동결. 일단 충분 한 SNT 섹션은 누적된 (풀 SNT 하나의 칩 반응 ~ 30 닭 배아에서 섹션)-80에 저장, ° c.
    참고: 경우 충분 한 배아 조직 (즉, 5 x 10 5-5 x 10 6 셀) 단일 또는 몇 가지 닭 배아에서 해 부 수 어 필요 하지 않습니다 그리고 그것은 다음 단계로 바로 진행 가능. 표 1에 있는 문제 해결 가이드를 참조 하십시오.
    참고: 주의! 액체 질소는 매우 낮은 온도, 적절 한 보호 착용.

2. DNA에 교차 결합 시키는 단백질: 하루 1

참고: 달리 명시 하지 않는 한 얼음에 모든 단계를 수행.

  1. 10 %DMEM 추가 500 µ L FBS 및 10 µ L 1 M 나-낙 산 염 냉동된 조직에 직접의 또는, 양자 택일로, 갓 해 부 조직에 즉시. 다시 부드럽게 1 mL 피 펫으로 일시 중단 하 여 셀을 균질.
    참고: 없음-낙 산 염의 추가 선택 사항 이지만 권장 histone acetylation 조사 하는 경우. DMEM-10 %FBS, 대신 0.1 %BSA 1 x PBS에 샘플을 resuspended 수 있습니다. FBS 또는 BSA의 추가 선택 사항 이지만 그것은 이후 원심 분리 단계에서 샘플 판 용이.
  2. 37% 포름알데히드 (1% 포름알데히드 최종)의 13.5 µ L을 추가 하 고 실 온에서 15 분 동안 회전에 그것을 배치.
    참고: 주의! 포름알데히드는 독성이.
  3. 튜브 2.5 M 글리신의 25 µ L을 추가 하 고는 포름알데히드를 풀기 위해 상 온에서 10 분 동안 회전에 그것을 배치.
  4. 탁상 원심 분리기에서 4 ° C에서 5 분 동안 850 x g에서 튜브를 회전합니다. 삭제는 상쾌한.
  5. 감기 500 µ L 한번 펠 릿을 세척 갓된 씻어 850 g x 5 분, 4 ° C에서 원심 분리기 (제조 법에 대 한 보충 자료 참조)를 버퍼링 하 고는 상쾌한 삭제.

3. 세포의 용 해 및 쥡니다

  1. 준비 완전 한 세포의 용 해 버퍼 (파운드) (제조 법에 대 한 보충 자료 참조)와 얼음에 진정. 1 mL 사용 파운드, protease 억제제 집중 (25 x), 40 µ L 및 100%의 10 µ L의 950 µ L PMSF.
  2. Pipetting으로 완전 한 파운드의 300 µ L에 펠 릿을 resuspend 고 10 분 락 플랫폼에 4 ° c.
  3. Sonicate 다음 설정을 사용 하 여 샘플: 온도 4 ° C = 총 시간 = 7 분, “에 ” 간격 = 30 s, “에서 ” 간격 = 30 s, 진폭 = 25%
    참고: 쥡니다 조건 각 조직에 대 한 최적화 하 고 사용 sonicator 따라 달라 집니다. 200에서 600까지 깎인된 DNA 결과 최저 쥡니다 설정을 사용 하는 것이 좋습니다 bp 크기. 기울이기 quanti 조직 유형에 따라 크게 달라 집니다.타이, 쥡니다 볼륨, 가교 조건 및 장비. 표 1에 있는 문제 해결 가이드를 참조 하십시오.
  4. 작은 세포질 파편을 4 ° C에서 10 분 동안 16000 x g에서 sonicated 샘플을 회전.
  5. 전송 lysate (상쾌한) 신선한 1.5 mL 튜브.
    참고: 시작 물자 2 칩 실험에 대 한 충분 한 간주, 다음 완전 한 파운드의 300 µ L에 추가할 수 있습니다 sonicated chromatin (즉, 최종 볼륨: 600 µ L).
  6. 10%의 추가 30 µ L octylphenol의 모든 300 µ L에 대 한 ethoxylate sonicated lysate (최종 농도: 1%) pipetting으로 혼합.
    참고: 주의! Octylphenol ethoxylate는 심하게 독성 (구강, 피부, 흡입).

4. 항 체 외피

  1. 약 수는 330 µ L의 sonicated 두 1.5 mL 튜브 lysate: 칩 및 입력된 제어 (시작 물자의 10%)으로 30 µ L 300 µ L. 저장소는 " 30 µ L 입력된 컨트롤 샘플 "에서-20 ° c.
    참고: 두 칩 반응의 660 µ L sonicated lysate 다음 동일한 샘플에서 수행 되는 경우 배포 될 수 있다 3 1.5 mL 튜브 (300 µ L 칩 #1, 칩 # 2, 300 µ L 및 입력된 제어 (각 칩의 시작 물자의 20%)으로 60 µ L ).
  2. Sonicated chromatin aliquot 및 혼합 반전의 300 µ L에 항 체의 3-5 µ g 추가.
    참고:이 연구에서 각 칩 반응 수행 되었다 히스톤 H3 트라이 K4에 갠 특정 항 체와 (H3K4me3), K4에 갠 히스톤 H3 디 (H3K4me2), 히스톤 H3 트라이 K27에 갠 (H3K27me3), 및 히스톤 H3 트라이 acetylation K27에서 (H3K27me3). 이 프로토콜의 성공은 전적으로 사용 하는 항 체의 품질에 의존 이다. 항 체는 특정 특정 단백질의 immunoprecipitation에서 효율적 이어야 한다. 사용할 수 있는 immunoprecipitate 가교 된 단백질-DNA에 복잡 한 항 체의 크기를 결정 중요 하다. 또한, 항 체의 특이성은 올바른 단백질 검출 되도록 서쪽 오 점 하 여 확인할 수 있습니다. 여러 일반 밴드를 검출 하는 항 체 칩에 대 한 권장 하지 않습니다.
  3. 장소 4 ° C에서 하룻밤 (12-16 h) 항 체를 바인딩할 락 플랫폼에 튜브는 chromatin.
    주: 표 1에 있는 문제 해결 가이드를 참조 하십시오.

5. 마그네틱 구슬의 준비: 주 2

  1. Aliquot 50-100 µ L 1.5 mL microfuge에 각 칩 반응에 대 한 단백질 G/자석 구슬 슬러리의 얼음에 관
  2. 세척 3 번 감기 블록 솔루션으로 자석 구슬 (제조 법에 대 한 보충 자료 참조) (4 ° C). 반전 또는 flicking 500 µ L 찬 블록 솔루션 및 믹스를 추가 합니다. 자석 홀더도 튜브를 넣어 고 튜브의 측면에 정착 구슬 기 다. 명확한 액체를 부 어와 반복. 마지막 세척 후 젤 로드 팁 모든 액체 제거.

6. Immunoprecipitation는 Chromatin의

  1. 씻어 구슬에 항 체 바인딩 chromatin의 300 µ L을 추가 하 고 혼합 반전.
  2. 구슬에 항 체를 바인딩할 적어도 4 h 4 ° C에서 튜브 회전자에 세로로 회전.

7. 세척, Elute, 그리고 반대는 Crosslinks

  1. RIPA 워시 버퍼 진정 얼음, 65 ℃, 물 목욕을 설정 하 고 쿨 4 원심 분리기 (제조 법에 대 한 보충 자료 참조) ° c.
  2. 차가운 RIPA 워시 버퍼의 1 mL에 4 번 chromatin 바인딩된 비즈를 세척 하 고 얼음에 계속. 이렇게 하려면, 반전 또는 flicking 차가운 RIPA 워시 버퍼와 섞어 1 mL를 추가 합니다. 자석 홀더는 튜브를 삽입 하 고 튜브의 측면에 정착 구슬 기다립니다. 명확한 액체를 부 어 하 고 반복.
    참고: RIPA 워시 버퍼와 세척 수 최적화를 해야 샘플 유형, 샘플 풍부, 및 사용 되는 항 체의 따라. 세척의 수를 증가 것 이다 백그라운드를 축소 하지만 또한 다운스트림 분석 정량 또는 칩이 손상 수 있습니다 복구 된 DNA의 총량을 감소 것입니다
  3. 테/50 m m NaCl의 1 mL 튜브에 추가 하 고 위에서 설명한 대로 자석 홀더를 사용 하 여 액체를 제거 하기 전에 신선한 1.5 mL microfuge 관 테/50 m m NaCl chromatin 바인딩된 구슬 전송.
  4. 900 x g 4 ° C에서 3 분에 구슬 회전, 튜브 자석 홀더에 다시 놓고 나머지 모든 테 젤 로드 팁 제거.
  5. 차입 버퍼의 추가 210 µ L (제조 법에 대 한 보충 자료 참조) 실내 온도와 터치 하 여 resuspend.
  6. 흔들어 동안 열 블록에 65 ° C에서 15 분 동안 Elute.
  7. 실내 온도에서 1 분 동안 16000 x g에서 구슬 회전 하 고 튜브 자석 홀더.
  8. 구슬 정착 되 면 신선한 microfuge 관 (~ 200 µ L) 상쾌한 전송.
  9. (단계 4.1에서에서 냉동) 실내 온도-20 ° C에서 입력된 컨트롤 샘플 (30 µ L)을 녹여, 차입 버퍼 (90 µ L)의 3 볼륨을 추가 하 고 간단히 vortexing에 의해 혼합.
  10. 65 ° C에서 하룻밤 (12-16 h)는 crosslinks를 칩 및 제어 샘플을 품 어.

8. 다이제스트 세포질 단백질 및 RNA: 하루 3

  1. 8.1At 온도 룸, 튜브 (SDS 희석) 당 TE 버퍼 1 볼륨을 추가 하 고 혼합 반전: 테의 120 µ L에 추가 컨트롤 샘플의 120 µ L 및 칩 샘플의 200 µ L에 테의 200 µ L.
  2. 추가 RNase A 0.2 mg/mL 최종 농도를 반전 혼합: 컨트롤 샘플의 240 µ L를 20 mg/mL RNase A 칩 샘플의 400 µ L의 4 µ L 20 mg/mL RNase A의 2.4 µ L을 추가.
  3. RNA를 소화 하기 위해 2 시간을 위한 물 욕조에 37 ° C에서 튜브를 품 어.
  4. 추가 가수분해 K 0.2 mg/mL 및 반전의 최종 농도에 혼합: 20 mg/mL 가수분해 K의 2.4 µ L에 추가 컨트롤 샘플의 240 µ L 및 20 mg/mL 가수분해 K 칩 샘플의 400 µ L의 4 µ L.
  5. 2 h 물 욕조에 55 ° C에서 단백질을 소화 하 고 DNA를 정화 하 품.

9. 칩-정량

참고: 보충 자료에 설명 된 대로 DNA 추출 및 정화, 수행.

참고: 보충 자료, 200-500 bp DNA 파편 ( 그림 3) 가져온 확인에 설명 된 대로 쥡니다 효율 확인.

참고: 중요 한 단계 칩 실제로 작동 하는 경우 확인 하는 것입니다. 관심사의 단백질에 대 한 게놈 바인딩 사이트 알고 있는, 뇌관 디자인 될 수 있다 정량 PCR (정량)에 대 한 알려진된 사이트 칩 DNA에 구체적으로 농축 됩니다 경우 확인 하려면 부정 제어 영역 준수할 것으로 예상에 비해 칸디날짜 단백질입니다. 예를 들어,이 일 H3K4me3에 대 한 수행 하는 칩과 칩 정량 결과 보여준다 (활성 발기인 히스톤 마크) 및 H3K27me3 (비활성 발기인 히스톤 마크) SNT 섹션 HH14 병아리 태아에서 분리 ( 그림 4A ).

  1. 같은 튜브 각 뇌관 쌍 (정방향 및 역방향)을 혼합 하 고 준비 20 µ M에서 재고 농도 사용 하 여 각 dH 2 O (표 2).
    참고: 각 뇌관 쌍의 효율 칩 정량 분석 하기 전에 평가 해야 합니다.
  2. 사용 칩 및 20% 입력된 제어 단계 8.5 정량 최적화에서에서 얻은 DNA.
    참고: DNA는 일반적으로 입력 정량 분석 (칩 반응에 사용 되는 시작 물자의 1%)로 20 배 희석.
  3. PCR의 각 10 µ L에 대 한 PCR 관에는 다음 구성 요소를 혼합: DNA mastermix (칩 또는 1% 입력)에서 dH2O, SYBR 녹색 믹스의 2.5 µ L 및 DNA의 1 µ L의 2 µ L 추가; mastermix 뇌관으로 dH2O, SYBR 녹색 믹스의 2.5 µ L의 앞으로 역 뇌관 믹스의 0.125 µ L 2.375 µ L 추가.
  4. 2 s와 짧게 1 분에 900 x g에서 원심 분리기에 대 한 vortexing에 의해 샘플을 혼합
  5. 수행 실시간 PCR (여기 사용 뇌관 및 자전거의 예를에서 찾을 수 있습니다 표 2와 표 3, 각각).
    참고: 칩 정량 데이터 분석: 칩 신호 입력의 %로 계산 됩니다. 짧게, 한 번 Ct 값 가져온 각 정량 반응, 100 또는 6.644 사이클의 희석 비율 (100의 log2) 입력 DNA 반응을 얻은 Ct 값에 적용 됩니다. 그런 다음 관심 (즉, 뇌관 쌍)의 특정된 지역에 대 한 칩 신호는 다음과 같이 계산:
    입력 조정 Ct (입력)-6.644 =
    칩 신호 = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)

10. 칩 seq 라이브러리 준비; 최종 선: 하루 4

  1. 100 희석 차입 버퍼의 60 µ L에서 칩-DNA의 ng (자료 표 참조).
  2. 끝의 추가 40 μ 믹스를 복구 하 고 부드럽게 10 번 플라스틱.
  3. 열 cycler에 30 분 동안 30 ° C에서 품.
  4. 소용돌이 자석 구슬 끝 복구 혼합을 포함 하는 튜브에 160 μ를 추가. 10 번 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 실 온에서 15 분을 품 어.
  5. 자석 홀더에 튜브를 놓고 기다리는 측면에 튜브.. 정착 구슬
  6. 명확한 액체를 붓는 다.
  7. 자석 홀더에 튜브를 유지 하면서 추가 200 μ 갓 80 %EtOH.
  8. 품 30 s 및 삭제는 상쾌한 실내 온도에. 반복 한 번..
  9. 자석 홀더에 실 온에서 15 분 동안 튜브를 유지. 일단 펠 릿 건조, 마그네틱 홀더에서 튜브를 제거.
  10. 물의 resuspension 버퍼의 20 μ에 펠 릿을 resuspend. 부드럽게 10 번을 철저 하 게 혼합 플라스틱.
  11. 실 온에서 2 분 동안 품.
  12. 자석 홀더는 튜브를 삽입 하 고 튜브의 측면에 정착 구슬에 대 한 기다립니다. 새로운 튜브에는 상쾌한의 17.5 μ 전송.

11. 칩 seq 라이브러리 준비; Adenylate 3 ' 끝

  1. A 미행 혼합을 새의 추가 12.5 μ 튜브와 부드럽게 10 번 위아래로 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 열 cycler에 튜브를 놓고 다음과 같은 프로그램에 따라 품 어: 30 분, 5 분 및 4 ° C에서 홀드 70 ° C에 대 한 37 ° C

12. 칩 seq 라이브러리 준비; 어댑터 선

  1. 물의 resuspension의 추가 2.5 μ 버퍼, 결 찰 믹스의 2.5 μ와 적절 한 RNA 어댑터 인덱스의 2.5 μ. 부드럽게 10 번 위아래로 pipetting으로 철저 하 게 믹스.
  2. 30 °에서 10 분에 대 한 열 cycler에 품.
  3. 정지 결 찰 버퍼의 10 배를 pipetting으로 철저 하 게 혼합 추가 5 μ.
  4. 소용돌이 자석 구슬 42.5 μ 샘플에 추가. 10 번 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 실 온에서 15 분을 품 어.
  5. 자석 홀더에 튜브를 놓고 튜브 측에 정착 하 여 명확한 액체를 부 어 구슬에 대 한 대기
  6. 자석 홀더에 튜브를 유지 하면서 추가 200 μ 갓 80 %EtOH.
  7. 품 30 s 및 삭제는 상쾌한 실내 온도에. 한번 반복.
  8. 자석 홀더에 튜브를 유지 하 고, 15 분에 대 한 건조 하자 샘플.
  9. 자석 홀더에서 튜브를 제거 하 고 물의 resuspension 버퍼의 52.5 μ에 펠 릿을 resuspend. 10 번 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 2 분 동안 실내 온도에 incubate 하 고 자석 홀더는 튜브를 삽입 튜브 측에 정착 구슬에 대 한 기다립니다. 새로운 튜브에 분명 상쾌한의 50 μ 전송.
  10. 소용돌이 자석 구슬 50 μ 샘플에 추가. 10 번 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 실 온에서 15 분을 품 어.
  11. 자석 홀더에 튜브를 놓고 구슬 튜브 측에 정착 하 고 맑은 액체를 부 어 때까지 기다리는.
  12. 자석 홀더에 튜브를 유지 하면서 추가 200 μ 갓 80 %EtOH.
  13. 품 30 s 및 삭제는 상쾌한 실내 온도에. 한번 반복.
  14. 자석 홀더에 튜브를 유지 하 고, 샘플 공기 15 분 건조
  15. 자석 홀더에서 튜브를 제거 하 고 물의 resuspension 버퍼의 27.5 μ에 펠 릿을 resuspend. 10 번 pipetting으로 철저 하 게 믹스.
  16. 품 2 분 동안 실내 온도에 튜브 자석 홀더 놓고 튜브 측에 정착 구슬에 대 한 대기 합니다. 새로운 튜브에 분명 상쾌한의 25 μ 전송.

13. 칩 seq 라이브러리 준비; DNA 파편 증폭

  1. 0.2 mL PCR에에서 서식 파일의 장소 12.5 µ L 튜브. 10 번 위아래로 pipetting으로 PCR 뇌관 칵테일의 2.5 μ, 향상 된 PCR 혼합. 믹스 10 μ 철저 하 게 추가 합니다. 열 cycler에 튜브를 놓고 사용 하는 표 4에 설명 된 조건.
  2. 소용돌이 자석 구슬 25 μ 샘플에 추가. 10 번 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 실 온에서 15 분을 품 어.
  3. 튜브 자석 홀더 장소, 구슬 튜브 측에 정착 하 고 맑은 액체를 부 어 때까지 기다리는.
  4. 자석 홀더에 튜브를 유지 하면서 추가 200 μ 갓 80 %EtOH. 30 s 및 삭제는 상쾌한 실내 온도에서 품 어. 한번 반복.
  5. 에 자석 홀더, 하자 샘플 공기 튜브 15 분 건조 유지 자석 홀더에서 튜브를 제거 하 고 물의 resuspension 버퍼의 32.5 μ에 펠 릿을 resuspend. 10 번 pipetting으로 철저 하 게 믹스.
  6. 품 어 PCR 튜브/플레이트 실 온에서 2 분. 실 온에서 마그네틱 스탠드에 PCR 튜브/접시를 놓고, 튜브의 측면에 정착 하 여 새로운 튜브에는 상쾌한의 30 μ를 전송 구슬에 대 한 대기.

14. 칩 seq 라이브러리 준비; 유효성 검사 라이브러리

참고: 라이브러리의 유효성 검사는 DNA와 RNA 품질 관리 시스템을 사용 하 여 수행 됩니다. 사다리의 준비: 처음으로 게놈 DNA 사다리의 aliquot 1 µ L 튜브/잘 고 추가 샘플 버퍼의 3 µ L.

  1. 샘플의 준비: 3 µ L의 샘플 버퍼 튜브에 1 µ L 라이브러리 샘플 (10-100 ng / µ L)의 혼합. 회전 감소 그리고 샘플 튜브의 맨 아래에 위치 5 s. 스핀에 대 한 최대 속도에 소용돌이.
  2. 품질 관리 시스템에는 샘플을 로드.
  3. 실행 완료 되 면 아무 뇌관 이합체는 샘플 ( 그림 5)에; 뇌관 이합체 밴드 약 135에 해당 되도록 최대 값에 대비를 설정 하 여 결과 분석 혈압. 도 약한 밴드 있으면 차입 버퍼를 추가 하 여 한 두 번째 정리를 진행 (자료 테이블 참조) 50 µ L 볼륨 하 고 혼합된 자석 구슬의 47.5 µ L을 추가. 샘플의 농도 너무 낮은 경우 (< 2 nM), PCR (13.1 단계) 실행을 진행, 15, 샘플의 12.5 µ L 볼륨 대신 18 주기를 사용 하 여 단계의 12.16.
  4. 라이브러리 정량 상용 키트를 사용 하 여 개별적으로 계량.
    참고: 라이브러리의 풀 수 있는 시퀀싱 할 목표로 30 M 읽기/샘플 1 x 50 nt 프로토콜의 단일 읽기와 시퀀서를 사용 하 여.

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결과

우리의 칩 프로토콜의 성능을 설명 하기 위해 수행 하는 칩 seq 실험 HH19 닭 배아에서 풀링된 SNT 섹션을 사용 하 여, HH22의 상 악 굴지 닭 배아, 그리고 무대 HH3 닭 배아의 바인딩 프로필을 조사 하 다양 한 히스톤 수정 (즉, H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3, 및 H3K27me3). 일단 칩 DNAs 가져온 쥡니다 효율 해당 입력된 DNAs (그림 3)의 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 평가 되었습니다. 다음, 칩 및 입력된 DNAs 사용 되었다 칩 정량 분석을 위해 측정 수 바운드 또는 언바운드 조사 히스톤 수정 (그림 4A)에 의해 예상 loci에서 풍부 하. 그림 4A, H3K27me3 및 H3K4me3 농축에 나와 있는 예제에서 HH19 SNT 섹션...

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토론

다른 세포질 문맥4,,518에 척 추가 있는 게놈의 기능적인 주석을 개선 하기 위해 Epigenomic의 히스톤 수정 칩 seq를 사용 하 여 프로 파일링을 사용할 수 있습니다. 이러한 epigenomic 프로필 사용할 수 있습니다, 다른 것 들 중, 증강 요소, (즉, 활성, 준비, 또는 태세), 강화의 규제 상태를 정의 하 고 다른 생물에 주요 셀 정체성 레 귤 레이 터를 정의 식별 하 또는 병 적인 컨텍스트 (예: 광범위 한 H3K4me3 발기인 도메인 및 슈퍼 강화)6,7,,910,

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공개 사항

저자는 공개 해야 경쟁 금융 관심사를 있지 않습니다.

감사의 글

저자는이 프로토콜의 설립 동안에 그의 우수한 기술 지원에 대 한 1 월 Appel 감사합니다. Rada Iglesias 실험실에서 작업 CMMC 교내에서 지원 자금, DFG 연구 보조금 (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1, 그리고 테 1007/3-1), UoC 고급 연구원 그룹 그랜트, 그리고 CECAD 그랜트.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약
BSA 분말Carl Roth3737.3
인산염 식염수 완충액(PBS)Sigma AldrichD8537
Tris-HCL pH 8.0Sigma AldrichT1503
NaClCarl Roth3957.2
EDTACarl Roth8043.2
EGTA칼 로스3054.2
Na-데옥시콜레이트시그마 알드리치D6750-24
N-라우로일사르코신시그마 알드리치61743-25G
헤페스애플리켐A3724,0250
LiCl칼 로스3739.2
NP-40시그마 알드리치I3021-100ml
SDSCarl Roth1833
단백질 G/마그네틱 비드Invitrogen1004D
37% 포름알데히드시그마 알드리치252549-1L
글리신
RNasePeqlab12-RA-03
단백질 분해 효소 K시그마 알드리치46.35 E
Na-부티레이트시그마 알드리치
단백질분해효소 억제제Roche5892791001
SYBRgreen Mix바이오짐617004
dH2O시그마 AldrichW4502
1 Kb ladderThermofisherSM1333
오렌지 G시그마 Alrich03756-25
아가로스인바이트로겐16500-500
0.25% 트립신-EDTA (1x)Gibco25200-072
옥틸페놀 에톡실레이트(트리톤 X 100)Roth3051.4
DMEM(Dulbecco´ s Modified Eagle Medium)Gibco31331-028
젤 로딩 팁 MultiflexA.HartensteinGS21
qPCR 플레이트Sarstedt721,985,202
384 웰Sarstedt721,985,202
1.5 mL 튜브Sarstedt72,706
100 - 1,000 µ L 필터 팁Sarstedt70,762,211
2 - 20 µ L 필터 팁Sarstedt70,760,213
2 - 200 µ L 필터 팁Sarstedt70,760,211
0.5 - 10 &마이크로; L 필터 팁Sarstedt701,116,210
H3K27me3 항체Active Motif39155
H3K27ac 항체Active Motif39133
H3K4me3 항체Active Motif39159
H3K4me2 항체Active Motif39141
End Repair MixIlluminaFC-121-4001
상자성 비드Beckman CoulterA63881
부유 완충액IlluminaFC-121-4001
A-테일링 믹스IlluminaFC-121-4001
라이게이션 믹스IlluminaFC-121-4001
RNA 어댑터 인덱스IlluminaRS-122-2101
정지 결찰 버퍼IlluminaFC-121-4001
PCR 프라이머 칵테일IlluminaFC-121-4001
Enhanced PCR MixIlluminaFC-121-4001
게놈 DNA 래더Agilent5067-5582
용리 완충액Agilent19086
Sample BufferAgilent5067-5582
라이브러리 정량화 키트Kapa BiosystemsKK4835 – 07960204001
비옥한 닭 흰자 달걀LSL Rhein MainKN: 15968
바늘 (Neoject)A.Hartenstein10001
주사기 (Ecoject 10 mL)Dispomed witt oHG21010
NameCompany<strong>카탈로그 번호코멘트
Equipment
CentrifugeHermleZ 216 MK
ThermoshakerITABISMKR13
SonicatorActive MotiveEpiShear probe sonicator Sonicator
DiagenodeBioruptor Plus
로테이터스튜어트SB3
가변 볼륨(5 – 1,000 &뮤; L) 피펫EppendorfN/A
TimerSigmaN/A
마그네틱 홀더Thermo FisherDynaMag-2 12321D
테이블 스피너Heathrow Scientific새싹
믹서LMSVTX 3000L
Real-Time PCR CyclerRocheLight Cycler; 시리얼 Nr.5662
PCR Cycler응용 바이오시스템유전자 앰프 PCR 시스템 9700
DNA 및 RNA 품질 관리 시스템애질런트애질런트 4200 TapeStation 시스템
겸자Dumont5-Inox-H
천공 스푼세계 정밀 기기501997
SLB2659V

참고문헌

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  4. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  5. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  6. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
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