2'- 포스 핀 올리고 뉴클레오타이드를 함유하는 올리고머의 고상 합성을위한 프로토콜 O 원형 이색 성을 통한 - 티오 페닐 메틸 변형 및 특성 분석

Summary

이 기사는 C2'- O 위치에서 변형 된 RNA의 dodecamer의 고체상 합성, 정제 및 특성화에 대한 자세한 절차를 제공합니다. UV-vis 및 원 편광 이색 광도 분석을 사용하여 구조적 측면, 즉 단일 가닥 또는 이중 가닥을 정량화하고 특성을 분석합니다.

Abstract

고상 합성은 핵산, 특히 DNA 또는 RNA의 정식 및 변형 중합체를 수득하는데 사용되어 다양한 분야의 응용 및 상이한 연구 목적을 위해 널리 사용되는 방법론이되었다. 본원에 기술 된 절차는 C2'- O- 위치에 위치한 0 개, 1 개 또는 2 개의 변형을 함유하는 RNA 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3'의 도데 카머의 합성, 정제 및 특성 규명에 초점을 둔다. 프로브는 2- 티오 페닐 메틸기를 기본으로하며, 표준 유기 합성법을 통해 RNA 뉴클레오타이드에 통합되고 각각의 포스 포르 아미 다이 트를 통해 상응하는 올리고 뉴클레오타이드로 도입된다. 이 보고서는 2'- O- 아미노 말단에서 변형 된 2- 티오 페닐 메틸 작용 화 된 뉴클레오타이드뿐만 아니라 4 개의 정준 핵산 염기 (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A))를 통한 포스 포르 아미 다이 트 화학 반응을 이용한다. 위치; 그러나이 방법론은 큰 var수년에 걸쳐 개발 된 수정 사항들. 올리고 뉴클레오타이드는 표준 조건, 즉 암모니아와 메틸 아민 (AMA)과 불화 수소 / 트리 에틸 아민 / N- 메틸 피 롤리 디논의 혼합물 하에서 수지로부터 분리하고 탈 보호 한 제어 된 구멍 유리 (CPG) 지지체상에서 합성 하였다. 상응하는 올리고 뉴클레오티드는 역상 크로마토 그래피 (9 월 박, C ₍₁₈₎ 칼 럼)을 통해 용출 탈염하고, 분리 한 다음 폴리 아크릴 아미드 전기 영동 (20 % 변성)를 통해 정제 하였다. 정량 및 구조 파라미터는 자외선 - 가시 광선 (UV-vis) 및 원 편광 이색 성 (CD) 광도 분석을 통해 각각 평가되었습니다. 이 보고서는이 분야에 착수하는 데 관심이있는 초보자 및 전문가를위한 자료 및 가이드 역할을하는 것을 목표로합니다. 새로운 기술과 방법론이 개발되면서 진행중인 작업으로 기대됩니다. 방법론과 기술에 대한 설명(phosphoramidite) 화학을 사용하는 DNA / RNA 신디사이저 (2013 년에 리퍼브되고 구매 됨)에 해당합니다.

Introduction

DNA / RNA의 올리고 뉴클레오타이드를 얻기위한 고상 합성은 포스 포르 아미 다이 빌딩 블록 ^4를 사용하는 1970 년대 ^{1 , 2 , 3} 이후 여러 분야에서 여러 분야에서 응용되고있다. 그 광범위한 영향의 예는 다음과 같습니다 : 클릭 화학 반응을 통한 라벨링에 미치는 영향 ⁵ , 구조적 탐침 ⁶ 및 안티센스 기술 ⁷ , 생물학적 메커니즘 ^{8 , 9} , 유전 물질 ^10의 출처 및 다양한 천연 및 / 또는 화학적 변형 ^{11 , 12를 포함} 한다. 우리가 여기에서 사용하는 변형은 포함하는 RNA 올리고 뉴클레오타이드를 얻기위한 우리의 노력의 첫 번째 단계를 나타낸다.이 중요한 생체 고분자의....

Protocol

1. RNA Oligonucleotides의 고상 합성

1. 각 포스 포르 아미 다이 트를 함유 한 용액의 제조 (표 1).
   1. 뉴클레오타이드의 수를 세고 각 염기에 해당하는 n + 1 방정식 (n = 뉴클레오타이드의 수)에 맞추고 표에 누락 된 값을 기입하십시오. 용적 = 0.1 M 농도의 뉴클레오타이드 당 0.15 mL, 무수 아세토 니트릴에 용해.
   2. 오븐 건조한 10 mL 앰버 병 (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Top)에 각 phosphoramidite를 칭량하고 건조제가 들어있는 데시 케이 터를 사용하여 진공 상태로 즉시 놓습니다.
   3. 건조한 아르곤으로 데시 케이 터를 채우고, 병을 꺼낸 다음, 해당 아세토 니트릴 (무수)의 양으로 즉시 희석하여 기기에 고정시킵니다.
      참고 : 항상 기밀 식 주사기를 사용하고 무수 대기를 유지하십시오.
   4. 병에서 셉터를 제거하고 m 위에 놓습니다.achine, 병 변경 기능을 통해.
      참고 :이 과정은 합성하기 전에 라인을 프라임하기 위해 각 솔루션의 추가 0.15 mL (따라서 위의 n + 1 공식에서 초과 부피)가 필요합니다.

Results

C2'- O- 위치에서 0, 1 또는 2 개의 2- 티오 페닐 메틸 변형을 함유하는 RNA 도데 카머의 합성은 상응하는 정제 및 특성화와 함께 기술된다. 또한 CD를 통해 수행 된 구조 분석에 대한 자세한 설명이 포함되어 있습니다.

RNA의 4 가닥 (상보적인 서열을 갖는 가닥 포함)은 고상 합성을 통해 얻어졌으며,이어서 각 올리고 뉴클레오타이드의 정제율이 300 - 700 nmol이었다. 질량 분광법은 ~ 150 pmol의 각 시료를 탈염시킨 다음 MALDI-TOF 분석을 위해 플레이트에 침착시킴으로써 수행되었다 ( 그림 5 ). CD는 이중 구조의 형성을 확인하고 그에 상응하는 T의 _m을 기록하는 동안 정량화 각 용액의 분석을 통해 자외선 photometrical 행했.......

Discussion

이 원고의 취지는 DNA 또는 RNA의 올리고 뉴클레오타이드의 합성을 성공적으로 달성하거나 향상시키기위한 분야의 연구자, 초보자 또는 전문가에게 가이드 역할을하는 것입니다. 설명 된 방법론은 표준 phosphoramidite 화학을 통해 자동화 된 DNA / RNA 합성기를 사용하는 고상 합성의 사용에 중점을 둡니다. 보고서는 RNA dodecamer의 합성, 정제 및 특성 분석을 단계별로 설명합니다. 또한, CD의 사용은 2 차 구조 모티프 및 열 변성 전이를 확인하는데 사용된다.

이 작업은 다른 상황, 즉 고상 합성에서 다양한 브랜드의 장비, 개조, 보호 그룹 및 / 또는 시약에 적용 할 수 있다는 점에 유의해야합니다. 따라서,이 과정에 관여하는 많은 매개 변수 중 하나 이상을 변경하거나 반응 조건을 조정하여 개선 할 수 있습니다. 나는또한 여기에 제공된 상세한 구조 분석 (CD를 통해)은 일반적으로 UV-vis 를 통해 유사한 분석

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AbsolveTM	PerkinElmer	6NE9711
아세토니트릴 99.9%, HPLC 등급	Fisher Scientific	75-05-8
아세토니트릴 99.9%, DNA 염기서열분석용 무수	Fisher BioReagents	75-05-8
아크릴아미드, 99+%	ACROS 유기물	164850025
염화암모늄 98+%	Alfa Aesar	12125-02-9
암모늄 시트레이트, 이염기성 98%	Sigma Aldrich	3012-65-5
암모늄 플루오라이드  98.0%, ACS 등급	Alfa Aesar	12125-01-8
수산화암모늄 28 - 30% 물, ACS Plus	Fisher Chemical	1336-21-6
암모늄 퍼설페이	ACROS Organics	1444
아르곤-초고순도	Airgas	7440-37-1
비스-아크릴아미드 초순수	VWR-Amresco	172
붕산	Fisher Scientific	A73-1
디에틸 피로카보네이트, 97%	ACROS 유기물	A0368487
에탄올, 무수, 조직학 등급	Fisher Chemical	64-17-5
에틸렌디아민 테트라아세트산, 디소듐 염 탈수 100.2%	Fisher Chemical	6381-92-6
포름아미드	Thermo Scientific	75-12-7
염산, 36.5 - 38.0%, 인증된 ACS Plus	Fisher Chemical	7647-01-0
마그네슘 클로라이드 헥사하이드레이트, 99%	Fisher Scientific	7786-30-3
메탄올, 99.9%,  HPLC 등급	피셔 화학	물질 67-56-1
메틸아민 40% 물 중	시그마 알드리치	74-89-5
1-메틸-2-피롤리디논, 및 무수, 99.5%	알드리치	872-50-4
Opti-TOFTM 96 웰 인서트 (123 x 81 mm)	MDS SCIEX	1020157
RNase Away Molecular	BioProducts	7005-11
아세트산 나트륨, 무수 99.2 %, ACS	Fisher Chemical	인증 127-09-3
염화나트륨, 100.5 %, ACS	Fisher Chemical	인증 7647-14-5
인산나트륨 일 염기성 이수화물 99.0 %	Sigma	13472-35-0
2',4' 트리에틸아민, 99+%	Alfa Aesar	121-44-8
TEMED	Amresco	761
트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드, 98%	Aldrich	73602-61-6
트리플루오로아세트산, 99%	Alfa Aesar	76-05-1
6'-트리하이드록시아세토페논 일수화물 98%	Sigma Aldrich	480-66-0
트리스 베이스	Fisher Scientific	BP154-3
요소	Fisher Scientific	U15-3
RNA 합성을 위한 시약:
Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane	Glen Research	40-4140-57
캡 믹스 A, THF/피리딘/아세트산 무수물	Glen Research	40-4110-52
Glen Research	40-4120-52		10% 1-메틸이미다졸
0.25 M 무수 아세토니트릴 내 5-에틸티오-1H-테트라졸	Glen Research	30-3140-52
산화 용액, THF/피리딘/물에 0.02 M 요오드 Glen	Research	40-4330-52
U-RNA-CPG	글렌 연구	20-3330-xx
Ac-G-RNA-CPG	글렌 리서치	20-3324-xx
Ac-G-CE 포스포라미다이트	Glen Research	10-3025-xx
U-CE 인산	Glen Research	10-3030-xx
Ac-C-CE 인산	Glen Research	10-3015-xx
Bz-A-CE 인산	글렌 리서치	10-3003-xx