양적 인간의 자연 킬러 세포의 세포 독성 활동을 결정 하는 흐름 cytometry 기반 방법은 여기에 표시 됩니다.
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이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
타고 난 면역 계통 내에서 이펙터 세포 자연 킬러 (NK) 세포로 알려진 탈 선 셀, 구체적으로 종양을 제거 하 고 virally 감염 된 세포에 대 한 호스트 방어에 필수적인 역할을 재생할. 다른 병 적인 상태의 호스트 함께 약 30 알려진된 monogenic 결함 발생 기능 또는 고전적인 NK 세포 결핍에서 만들어 낸 감소 또는 세포 독성 활동을 결 석. 역사적으로, 세포 독성은, 비싼 복잡 하 고 잠재적으로 위험한 방사성 방법 조사 하고있다. 이 문서는 NK 세포의 세포 독성 활동을 계량 유선형, 임상 적용 흐름 cytometry 기반 메서드를 설명 합니다. 이 분석 결과에 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 또는 순화 된 NK 세포 준비는 다른 비율에서 공동 incubated NK 세포 중재 된 세포 독성 (NKCC)에 민감한 것으로 알려져 대상 종양 세포 라인. 대상 세포는 효과 기 세포 (NK 세포)에서 그들의 차별 수 있도록 형광 염료와 사전 분류. 잠복기, 후 살해 대상 세포 특히 죽은 세포를 침투 하는 핵 산 얼룩에 의해 식별 됩니다. 이 방법은 의무가 모두 진단 및 연구 애플리케이션과, cytometry의 다중 매개 변수 기능에 감사 합니다는, 잠재적으로 NK 세포 표현 형 및 기능에 대 한 깊은 분석의 추가한 이점이 있다.
서론
자연적인 살인자 (NK) 세포는 virally 감염 된 세포, 변형 된 세포, 그리고 다른 병원 성 위협 1,2의 제거에서 비판적으로 관련 된 인간의 타고 난 세포의 정교한 부분 집합. NK 세포 용균성 립 집 perforin 등 granzymes 세포 독성 단백질. 활성화, NK 세포는 직접 대상 세포 세포의 용 해 및 apoptosis, cytokine 및 chemokine 릴리스 함께 결과로 이러한 cytolytic 분자 로컬로 출시 되 면 면역 시 냅 스로 알려진 그들의 목표와 복잡 한 상호 작용을 형성 하 고 궁극적으로 염증의 유도에서 상태 1,,34.
NK 세포 활성화 활성화의 복잡 한 문자열을 포함 하 고 억제 상호작용 NK 세포 수용 체와 ligands 단단히 규제 시스템을 형성 하는 대상 셀의 표면에 표현. NK 세포 활성화의 가장 공부 메커니즘 중 하나는 "누락 자가"입니다. 사실, 내가 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC), 또는 인간 백혈구 항 원 ....
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프로토콜
샘플은 UCLA 인간 연구 보호 프로그램(Human Research Protection Program)에서 수립한 윤리 지침에 따라 수집되었으며 IRB의 승인을 받았습니다.
1. 시약의 준비
참고: 달리 명시되지 않는 한 모든 시약은 사용하기 전에 실온에서 평형을 이루도록 해야 합니다. 모든 시약은 멸균 상태를 유지해야 합니다.
- p20 피펫으로 칼슘과 마그네슘이 없는 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 10μL의 Tween-20 용액을 첨가하여 Tween-20의 2x 작업 용액(즉, 0.2%)을 준비합니다.
- Tween-20의 점도가 높기 때문에 정확성을 보장하기 위해 다음 단계를 따르십시오. 기포 형성을 방지하기 위해 천천히 수집하고, 캐리오버를 방지하기 위해 전체 팁을 물에 담그지 않으며, PBS에서 여러 번 위아래로 피펫팅하여 팁에서 Tween-20을 모두 씻어냅니다.
- 2μL의 IL-2 원액(2.1E6 IU/mL)을 198μL의 완전 배지(즉, 1:100 희석)에 첨가하고, 198μL의 완전 배지(10% 페니실린-스트렙토마이신과 10% 소 태아 혈청(FBS)가 포함된 RPMI인 경우, 198μL의 완전....
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결과
분석 결과 설정 하기 전에 NK 셀 내용 선택의 이펙터 인구에 평가 될 것이 좋습니다. 그림 1 에 일반적인 CD56 얼룩 (밝은 파란색) 전에 나와 (빨간색) NK 세포 농축 후. NK 세포 PBMCs의 최대 15% 고 농축 후 순수 80% 이상 이어야 한다.
흐름 cytometric 분석이 분석이 결과에 두 개의 매개 변수 검색 포함: CFSE, FITC;로 같은 채널에서 감지 그리고 죽은 세포 얼룩, APC (그림 2AB)로 같은 채널에서 감지. 데이터 수집 후 그림 2에서 제어 전략은 데이터를 분석 하는 데 사용 됩니다. CFSE + 인구, 타깃 집단 내의 사망된 세포.......
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토론
여기 설명 하는 방법을 NK 세포의 세포 독성 활동을 평가 하기 위해 전통적인 51Cr 자료 분석 결과에 대 한 간단 하 고 비용 효율적인 대안을 제공 합니다. 이 방법은, 재현성, 민감하고 CRA, 같은 이전 표준 방법 보다 적게 시간이 걸리는 임상 모두에 사용할 수 있습니다 이며 응용 연구.
동안 분석 결과 총 PBMCs와 풍부한 NK 세포, 세포 인구를 정화 필요 없이 PBMCs을 사용 하 여 환자의 샘플에서 수집 된 혈액 또는 몇 또는 가난한 품질 셀의 작은 볼륨을 다룰 때 큰 혜택입니다. 이 분석 결과 CFSE와 죽은 셀 제외 생존 얼룩만 활용합니다. 혼자 이러한 두 개의 매개 변수를 보고 진단 목적, 흐름 cytometric 분석에서 보상을 더 요구 하지 않기의 추가 혜택에 대 한 간결 하 고 충분 한 정보를 제공 합니다.
이 방법은 또한 기본 NK 세포 생물학을 연구 하 고 소설 NK 세포 타겟 치.......
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공개 사항
저자는 금융 관심의 없습니다 충돌을 선언합니다.
감사의 글
우리는 나 르 시 소 질, ucla의 Immunogenetics 센터, 원고 준비와 그녀의 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 인산염 완충 식염수(1x, Ca2+ 및 Mg2+ 제외) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| 열 비활성화 소 태아 혈청 | Omega Scientific | FB-02 | |
| 페니실린 스트렙토마이신 | 생명 기술 | 15140-163 | 10,000 U/mL |
| IL-2 | R&의 원액 D Systems | 202-IL-050 | 0.2 &mu에서 동결 건조; BSA를 운반체 단백질로 사용하는 Acetonitrile 및 TFA의 m 여과 용액. 100 &mu에서 500 ul로 재구성하십시오. 최소 0.1%의 소 혈청 알부민 (2.1x10E6 IU/ml)K562 세포를 포함하는 멸균 100 mM 아세트산의 g/mL |
| ATCC | CCL-243 | 암 세포주 | |
| T-75 세포 배양 플라스크 | Corning | 431464 | |
| CFSE 세포 증식 키트 | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | I 바이알을 18ul DMSO로 재구성하여 5mM 스톡 용액을 준비합니다. 동결/해동하지 마십시오. |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | 재고 솔루션은 5 &mu에서 제공됩니다. 1mL DMSO의 M. DMSO 용액은 시약 분해 없이 여러 번의 동결-해동 주기를 거칠 수 있습니다. |
| 나트륨/리튬 헤파린 채혈 튜브 | BD | 02-687-95 | |
| U-bottom 96-well plate | Corning | CLS3897 | |
| Serological pipettes | BD Falcon | ||
| 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브(5mL) | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 mL 폴리프로필렌 원추형 튜브 | BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL 폴리프로필렌 원뿔형 튜브 | BD Falcon | 352097 | |
| 시약 저장소 | USA Scientific | 2321-2230 | |
| Human NK cell enrichment cocktail | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
참고문헌
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells.
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 9/10/2017. Citeable Link.
An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was updated from:
to:
태그
