이 프로토콜의 목표 zebrafish에 치명적인 골격 돌연변이 고기 penetrance 선택적인 breeding에 의해 변경 하는 것입니다. 치명적인 돌연변이 성인 기에 성장 될 수 없는 자신을 사육, 따라서이 프로토콜 추적 하 고 여러 세대에 걸쳐 penetrance 테스트 자손에 의해 선택 하는 방법에 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Zebrafish 돌연변이 고기는 수시로 불완전 하 게 침투 하 고, 일부 돌연변이 명시. 일관성 없이 나타나는 재미 있는 고기 공부 하 고, 어려울 수 있으며 결과 혼동으로 이어질 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 증가 하 고 감소에 치명적인 zebrafish 골격 돌연변이 penetrance 간단 번 식 패러다임 이다. 치명적인 돌연변이 수 없습니다 선택적으로 사육 될 직접, 때문에 자손 테스트의 고전적인 선택적 번 식 전략 채택 된다. 이 메서드는 또한 Kompetitive 대립 유전자 특정 PCR (KASP) 유전형 zebrafish 및 얼룩 애벌레 zebrafish 연골과 뼈에 대 한 프로토콜을 포함합니다. 여기에 설명 된 농업 전략 적용 다운스트림 응용 프로그램에 더 많은 결과 재현할 수 있도록 재미 있는 골격 표현 형의 penetrance를 증가할 수 있다. 또한,이 선택적 번 식 전략을 통해 돌연변이 penetrance 감소 가장 결정적인 돌연변이 유전자의 기능을 해야 하는 개발 프로세스를 밝힐 수 있다. 골격은 구체적으로 간주 하지만 여기, 우리는이 방법론은 모든 zebrafish 돌연변이 라인에 대 한 도움이 될 것입니다 제안 합니다.
서론
Zebrafish는 골격 발달을 이해 하기 위한 강력한 모델 시스템입니다. 돌연변이 제 브라 긴장와 생물학 skeletogenesis 동안 유전자 기능을 해독할 수 있습니다. 그러나, zebrafish 골격 돌연변이 고기 가변 penetrance1,2,,34 개발 및 유전자 분석을 방해할 수 있는 제시할 수 있습니다. 이 방법의 목적은 3 겹 이다. 첫째, 지속적으로 심각한 고기 생산 zebrafish 돌연변이 라인 생성 시간 경과 기록5 와 이식6같은 다운스트림 발달 연구 수 있습니다. 연구의 이러한 종류 고기 일관성 명단만 공부 하 여 무력화 될 수 있습니다. 둘째, zebrafish 긴장 inbreeding 유전 배경 변화, 따라서 실험 일관성과 재현성을 홍보를 줄일 수 있습니다. 예를 들어 모든 현장에서 수행 교 잡 분석 한 선택적으로 타고 난된 긴장에 수 혼란 가변성을 감소 하며 결론을 강화. 셋째, 심각 하 고 가벼운 긴장을 생성 하는 것은 특정 돌연변이....
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프로토콜
이 프로토콜에서 설명 하는 모든 실험 따라 그리고 콜로라도의 대학 및 대학 오 레 곤 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 완성 되었습니다.
1. 선택 되지 않은 시작 재고 준비
- 식별 heterozygous 항공사의 지 느 러 미에 의해 돌연변이 체 대립 유전자의 클립 11 및 유전형 전체 형제 동물의 주식 선택의 방법으로와 같은 KASP 12 , , 13 14. 이 프로토콜 zebrafish mef2ca b1086 긴장 수행 되었다.
- KASP 유전형
참고: KASP 위한 대립 유전자 특정 뇌관 (재료의 표 참조) 시 약을 제공 하는 회사에 의해 설계 되었습니다. 특정 실시간 PCR 기계에 대 한 적절 한 6-carboxyl-X-rhodamine (ROX) 염료 농도 회사 웹사이트를 방문. 세포의 용 해 버퍼 (10 mM tris (pH 8.3), 50 m KCl m, 1....
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결과
이 프로토콜은 장기 축산 기술 이해 zebrafish 골격 돌연변이 (그림 1)에 대 한 유용. 선택적인 breeding 자손을 테스트 하 여 전반적인 penetrance 하향 및 상향 몇 세대 (그림 2)에 있는 변화를 항복 한다. 우리의 이전 작품에서는, 선택적인 breeding의 2 라운드 3117%에서 평균 penetrance 아래로 몰고. 마찬가지로, 우리의 위쪽 라인에서 우리 이동 평균 penetrance 위쪽으로 63%에서 93%로 3 세대. 선택적인 breeding의 4 라운드 후 아래쪽 또는 위쪽으로 penetrance 응답 하지 않으면, 득점 되는 표현 형 자손 테스트 하 여 선택적인 breeding에 과민 하지 않다 가능 하다.
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토론
선택적인 Breeding 유전자 기능의 예민을 발표
더 또는 덜 심각한 선택적인 breeding에 의해 돌연변이 고기 이동 유전자 기능에 새로운 통찰력을 얻을 하는 간단한 방법입니다. 선택 되지 않은 번 식의 표준 방법으로 비교, 여기에 제시 된 프로토콜 돌연변이 고기의 훨씬 더 완전 한 이해를 얻을 수 있습니다. 특히, 심한 긴장을 생성 하 여 돌연변이 고기의 전체 폭 수 계시 될, 선택 되지 않은 주식으로 관찰 되지 않은 것을 포함 하 여. 따라서, 유전자 연구에 대 한 새로운 발달 역할 검색 될 수 있습니다. 반대로, 가벼운 긴장을 생성 하는 것은 관심사의 유전자에 대 한 가장 중요 한 역할 밝힐 수 있다. 받아, 예를 들어 단일 표현 형 가벼운 돌연변이에 지속. 여기 가장 비판적으로 가벼운 긴장에서 방해 남아 발달 과정에서 유전자의 기능 필요 가능성이 높습니다. 따라서, 주어진된 돌연변이의 전체 phenotypic 시리즈 선택적인 breedi.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리 지도 대 한 척 Kimmel, 존 다우드가 번 식 전략 개발에 대 한 도움, 골격 얼룩, 완성에 그녀의 작품에 대 한 Macie 워커 및 Charline 워커와 보 니 울만 도움이 zebrafish 조언을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품에 JTN K99/R00 DE024190에 의해 지원 되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 파라포름알데히드, 펠릿화, 고체 | Ted Pella Co. | 18501 | 펠렛 PFA는 분말 PFA |
| 염화마그네슘, 고체 | Acros 유기물 | 223210010 | |
| 10x PBS, 수성 | Fisher | BP3994 | |
| 190 증거 에탄올 | |||
| Alcian Blue, 고체 | Anatech Ltd. | 867 | Anatech |
| Alizarin Red, 고체 | Sigma | A5533-25G | |
| 글리세롤, 액체 | Fisher | BP229 1 | |
| 과산화수소, 액체 | Fisher | BP263500 | |
| 수산화칼륨, 고체 | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | 에서 가져와야 합니다. | |
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC KBS-2100-100 | ||
| 트리스 HCl, 고체 | Fisher | BP153 500 | |
| 염화칼륨, 고체 | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, 액체 | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| 트리카인-S | 서부 화학 | ||
| 단백질 분해 효소 K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| 제어 드롭 파스퇴르 피펫 | Fisher | 13-678-30 | |
| DNA 정량화를 위한 | Nanodrop | ThermoFisher |
참고문헌
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K.
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