물성 및 비보에 긴장 매개 변수 측정 도구의 부족 방지 개발 하는 동안 그들의 역할을 확인 합니다. 우리는 원자 힘 현미경 (AFM) 및 나노-추적 epiboly 동안 그대로 zebrafish 태아 노른자위 셀에 기계적 기능 척도를 고용. 이 메서드는 안정적이 고 광범위 하 게 적용 관입 개입을 피하.
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이 논문에서
요약
초록
Spatio 시간적 조직 조직 진화의 직접적인 요인 elucidating 연구 개발의 주요 목적 중 하나입니다. 다양 한 제안 다른 발달 및 전체적 프로세스에서 spatiotemporal 조직의 조직과 세포의 기계적 특성의 이해에 중요 한 기여 되었다고 주장 한다. 그러나, 소재 속성 및 비보에긴장 매개 변수 측정을 안정적이 고 접근 가능한 도구의 부족으로이 가설을 검증 어려운 되었습니다. 여기 우리는 원자 힘 현미경 (AFM) 및 입자 epiboly 동안 그대로 zebrafish 태아 노른자위 셀의 기계적 특성을 측정 하는 것을 목적으로 추적 하는 방법 제시. Epiboly는 그의 연구는 태아의 투명도 의해 촉진 된 초기 보존된 개발 프로세스입니다. 이 메서드는 구현 하기 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 널리 적용 이후 그들은 조직 역학에 영향을 미칠 수 있는 방해 개입을 극복. 간단한 전략 표본, AFM, 기록과 나노 주사의 장착 및 추적에 대 한 적용 했다. 이 접근에 게 이러한 방법을 쉽게 적응할 수 있는 다른 발달 시간 또는 유기 체.
서론
전체적 프로세스의 biomechanical 제어 기본 원리는 크게 정의 되지 않습니다. Biomechanical 연구 분자 및 세포 수준에서 상당한 기세, 수집 하는 동안 biomechanical 매개 변수는 조직/유기 체 수준에서의 탐사 초기 단계에 있다. 유체역학 회귀1 또는 비디오 강제로 현미경2 레이저 미세3, 또는 덜 침입적 인 원자 힘 현미경 (AFM) 천연된 셀4 의 능동 및 수동 세력을 구별 하는 연구를 허용 또는 vivo에서 5 또는 나노 microrheology6 조직의 기계적 특성 및 응답의 기대를 수 있습니다.
AFM는 표면 거칠기 및 시험된 표면7접촉 시 캔틸레버 팁의 편향에서 준수 해결 원자 고해상도 3 차원 지형 기술입니다. AFM을 사용 하는 다른 방법론 마찰, 접착 힘, 및 다양 한 재료의 점 탄성 특성 측정을 포함 하 여 표면 특성을 조사 하기 위해 개발 되었습니다. 최근, AFM은 생물 학적 샘플의....
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프로토콜
아래 설명 하는 모든 프로토콜 단계 우리 기관의 동물 관리 지침을 따르십시오.
1. 제 브라 문화
- 번 식 하 고 성인 zebrafish 표준 조건 하에서 유지 합니다.
참고: AB와 TL 야생 타입 배아가이 연구를 위해 사용 되었다. - 배아를 수집 하 고 E3 배아 중간2428.5 ° C에서 그들을 성장. 앞에서 설명한19로 형태에 따라 그들을 무대.
2. 원자 힘 현미경 검사 법
- 수동으로 dechorionate zebrafish 태아 (개별 관심에 따라 다른 연령대)의 무대. ( 재료의 표참조) 두 개의 얇고 날카로운 집게와 chorions를 제거 합니다.
- Chorion 한 집게를 사용 하 여 그립 고 눈물에 다른 집게와. 그런 다음, 눈물의 반대 지역에는 chorion를 들고, 개방을 통해 부드럽게 배아 밀어.
- 8 X 50 X 사이 확대의 조정 가능한 범위 해 stereomicroscope에서 dechorionation를 수행 합니다.
- ....
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결과
대뇌 피 질의 긴장 측정
각 측정 지점에 대 한 5 (F-z) 힘-변위 곡선 5 µ m의 피크-피크 진폭 1 Hz에서 캔틸레버 램프에 의해 AFM에 의해 취득 되었다 (속도 = 10 µ m/s)까지 ~ 2 µ m의 최대 들여쓰기. 이 이렇게 20 분 미만 복용 했다 고 했다 epiboly 진행에 의해 영향을 받지 않습니다. 각 실험 조건 적어도 5 배아에서 시험 되었다.
배아 노른자위 셀에 기록 하는 힘-변위 곡선 반대로 그에 해당 하는 소프트 주변 agarose, 전시 비례 선형 관계 (R2 > 0.999) (그림 2A). 우리는 F z 3 µ m/s와 30 µ m/s 커브와 캔틸레버의 속도에 대뇌 피 질의 긴장 Tc 의 잠재적인 의존.......
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토론
여기 우리가 소재 속성 및 epiboly 동안 zebrafish 노른자위 셀의 일부 biomechanical 매개 변수 수 AFM 및 나노 입자 microrheology에 의해 쉽게 예상할 수 보여줍니다.
AFM 세포와 조직 생리 조건4,5,,2528의 유 변 학적 기능 검색 고용 되었다, 그러나 여기 우리는 AFM 그대로 개발에 적용 하기 위한 프로토콜 개발 우리 epiboly 동안 zebrafish 태아의 노 른 자 세포 표면을 테스트 하려면 고용 배아
우리의 AFM 측정에 대 한 배아의 방향은 낮은 녹는 agarose에서 그들을 포함 하는 절반에 의해 확보 되었다. 그러나, agarose 포함 미치.......
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공개 사항
저자 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌을 선언합니다.
감사의 글
우리가 이러한 프로토콜에 대 한 기준 설정에 대 한 Amayra 에르난데스-베가 필립 알렉산더 Pouille 감사 합니다. 우리는 또한 IBMB-PCB, 자비에 르 스 및 지속적인 지원에 대 한 실험실의 구성원에서 분자 이미징 플랫폼을 감사합니다. 통합 그룹 프로그램 Generalitat 드 Catalunya와 DGI EMB 및 DN에 경제와 스페인의 Competitivity Consolider 보조금의 지원이 작품.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 도립 광학 현미경 | Nikon | TE2000 | 샘플 및 AFM 캔틸레버 |
| 시각화 원자력 현미경(AFM) | 맞춤형 | - | 모든 상용화된 AFM을 사용할 수 있음 |
| 도립 컨포칼 현미경 | Zeiss | LSM780 | 나노 유변학 데이터 수집 |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | 주조 배아 |
| 초순수 LMP 아가로스(저융) | Invitrogen | 16520-100 | 배아 확보 |
| , 제브라피시 미세 사출 및 이식 금형, | 세계 정밀 기기 | Z-MOLDS | , 주조 배아. 원래 치수로 맞춤 제작한 |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5mm 직경 |
| Si3N4 캔틸레버 | Novascan | . GS | AFM에 의한 배아 측정. 구형 팁: 4.5 &마이크로; m 직경 및 k = 0.01 N / m |
| 형광 나노 입자 | Life | Technologies FluoSpheres F8811, | 나노 유변학 |
| 추적 용 마이크로 피펫 풀러 | Sutter Instruments | P-2000 | 맞춤형 마이크로 니들 |
| 붕규산 모세관 유리 | 제작 Warner Instruments | G100TF-4 | 맞춤형 마이크로 니 |
| 들 미세 조작기 | Narishige | MN-153 | 마이크로피펫 조작 |
| 마이크로인젝터 | Eppendorf | FemtoJet Express | 주입 시간 및 압력 제어 |
| 실체현미경 | Leica | DFC365FX | 주입 중 배아 시각화 |
| 분석 소프트웨어 | MathWorks | Matlab | AFM 및 입자 추적 데이터 분석 |
| Zebrafish | AB 및 TL 와일드 타입 | - | 배아 채취에 사용되는 균주 |
| 유리 바닥 플레이트 | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | 나노 유변학 데이터 수집을 위한 배아 장착 |
| 스테이지 마이크로미터 | FST | 29025-02 | 주입량 측정 |
참고문헌
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc....
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재인쇄 및 허가
