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방법 논문

효 모 S. cerevisiae Hypoxic 응답 하는 동안 시간이 지남에 mRNA 수준 측정

7.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56226

⸱

2017년 8월 10일

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology, Rowan School of Osteopathic Medicine, 2Department of Biological Sciences, Rowan University

이 논문에서

요약

여기, 우리를 mRNA 수준 S. cerevisiae 세포의 hypoxic 응답 시간 모니터링 RNA-seq를 사용 하 여 프로토콜을 제시. 이 메서드는 어떤 세포 응답 중 유전자 발현 분석을 적용할 수 있습니다.

초록

유전자 발현에 복잡 한 변화는 일반적으로 상당 부분의 세포 응답 중재. 유전자는 많은 자극, 신호 경로 또는 보조 효과 중의 특정 타이밍에 의해 규제로 각 진 독특한 속도 식을 변경할 수 있습니다. 전체 유전자를 캡처하기 위해 식 응답 효 모 S. cerevisiae, RNA-seq 분석에서에서 hypoxia 저 산소 증에 노출 된 후 특정 시간에 모든 유전자의 mRNA 레벨을 모니터링 하는 데 사용 되었다. Hypoxia 성장 셀 ~ 100% N2 가스에 의해 설립 되었다. 중요 한 것은, 다른 hypoxic 연구와 달리 ergosterol 및 불포화 지방산 했다에 추가 되지 미디어 이러한 대사 유전자 발현에 영향을 때문에. 시간 포인트는 0-4 h 저 산소 증 후의 범위에서 그 기간 캡처 유전자 발현에 있는 중요 한 변화 때문에 선정 됐다. 각 시간 지점에서 중간 로그 hypoxic 세포 했다 신속 하 게 필터링 하 고 냉동, O2 와 수 반하는 변화 유전자 발현에 대 한 노출을 제한. 총 RNA 세포에서 추출 하 고 mRNA를 cDNA 다음 변환 되었습니다에 대 한 풍부 하 게 사용 했다. 이 cDNA에서 멀티플렉스 라이브러리 생성 하 고 8 개 이상의 샘플 다음-세대 시퀀서의 한 차선에 순서가 되었다. 품질 기본 트리밍, 매핑 및 결정 하는 유전자 당 읽기 수를 포함 하 후 시퀀싱 파이프라인은 기술 된다. R 통계 환경 내에서 DESeq2 hypoxic 시간 포인트 중 하나에 크게 변경 하는 유전자를 식별 하기 위해 사용 되었다. 3 생물 복제의 분석 공개 높은 재현성, 다른 활동의 유전자와 많은 수의 예상 O2-유전자 통제. 이러한 방법은 시간이 지남에 다양 한 생물의 세포 저 산소 증에 대처 하는 방법을 연구 하는 데 사용 하 고 다른 세포 응답 중 유전자 발현 연구에 맞게 수 있습니다.

서론

많은 유기 체는 유전자 식 1,2,3을 변경 하 여 저 산소 증, 또는 낮은 O2에 응답. 이 응답 세포 변화 산화 상태 4뿐만 아니라 호 기성 호흡에 대 한 몇 가지 생 합성 반응에 대 한 중요 기판의 부족을 극복할 수 있습니다. S. cerevisiae 에서 수행 하는 여러 microarray 연구 보여 수백 개의 유전자의 mRNA 수준 응답 hypoxia 5,6,7,,89 으로 변경 , 10 , 11 , 12. 최근, RNA-seq hypoxia 13중 시간이 지남에 따라 진 식 변화 하 사용 되었다. 여기, 실험 내용을 제시 하 고 논의.

다양 한 방법으로, 각각 생산 하는 O2의 다른 수준에 산소를 얻을 수 있습니다. 여기, hypoxia 지속적으로 흐르는 의해 설립 초 고 순도 N2 플라스 크로 낮추고 [O2] 해산 즉시 재현할 수 활동 10. 그것은 가능한 일부 O2 분자 현재 신진 대사 및 유전자 표현에 기여 하는 하지만이 환경은 혐 기성에 가까운 매우 간주 됩니다. O2의 부재, 효 모 세포 biosynthesize heme, ergosterol 및 불포화 지방산 4,,1214수 없습니다. 따라서, 이전 연구 산소 5,,1015없이 효 모 성장 하는 때이 대사 산물을 포함 했다. 그러나, 많은 hypoxic 응답이 대사이 산물의 고갈에 의해 중재 되 고 hypoxic 유전자 식 응답 12,16반전 따라서 그들을 보충. 자연 산소를 모방 하기 위해이 대사 되지 미디어에 추가 되었습니다. 셀이 필수적인 metabolites의 존재 없이 산소에 노출 됐다 짧은 시간에 세포 죽음 (데이터 표시 되지 않음)도 장기간된 스트레스 응답 13에 눈에 띄게 증가 했다.

응답은 또한 긴장과 그 유전자 형에 의존 합니다. 특히 중요 한 hypoxic 응답 2의 알려진된 레 귤 레이 터의 대립 이다. S288C 변형 배경은 매우이 긴장으로 수행 다른 게놈 연구에 결과 비교 될 수 있다 그래야 원한다. 그러나, S288C 부분적인 손실의 기능 대립 유전자는 HAP1 유전자 17, hypoxic 응답에 대 한 중요 한 transcriptional 규칙을 포함합니다. 이 대립 유전자 S288C에 수리는 wildtype를 사용 하 여 복사는 Σ1278b에서 변형 배경 11.

유전자 발현은 세포 환경에 매우 의존 합니다. 따라서, 게놈 넓은 mRNA 분석을 수행할 때 시간, 자극, 유전자 형 등 다른 매개 변수를 변화 하는 동안 일정 한 환경을 유지 하는 것이 중요 하다. 높은 재현성 결과 얻기 위해 연구에 대 한이 세 가지 사례와 모든 생물 학적 또는 기술적인 복제를 고려 하십시오. 첫째, 동일한 experimenter(s) 기술 사례 경험에 걸쳐 다를 수 있습니다 이후 연구를 수행 한다. 둘째, 각 일괄 처리는 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 약간 다른 구성 성분의 동일한 배치 성장 매체에 사용 되어야 한다. 셋째, 세포 주기 효과 최소화 하기 위해 각 시간 포인트는 성장 (1-7 셀/10ml x 2)의 중간 로그 단계에서 비동기 셀로 이루어져야 합니다.

Hypoxia에 유전자 식 응답과 같은 복잡 한 응답을 특성화 때 시간 코스의 다양 한 이벤트 활동을 결정 하는 데 유리 하다. 그 응답의 큰 변화를 사로잡을 것입니다 특정 시간 포인트를 선택 합니다. 본이 연구에서는 과거 실험 공개 유전자 발현이 기간 13동안에 광범위 하 게 변화 하기 때문에 0와 4 h 사이 시간 포인트 관찰 되었다.

측정 하려면 글로벌 유전자 발현, RNA-seq 사용된 18,19이었다. 이 방법은 각 유전자의 사본의 관계 되는 풍부를 결정 하기 위해 차세대 시퀀싱을 사용 합니다. DNA microarray 분석에 비해, RNA-seq 높은 감도 (탐지 덜 풍부한 성적 증명서), 큰 동적 범위 (큰 배 변화를 측정) 및 (정확 하 게 유전자 발현 시간이 지남에 따라)에 우수한 재현성을 전시 한다. 일반적으로, 가장 세포질 RNA 리보솜 RNA 특정 RNA 종 20에 대 한 풍부 하 게 개발 되었습니다 너무 많은 방법 이다. 여기, 폴 리-T 구슬 정화 폴 리 A 포함 된 mRNA 사본, 하지만 다양 한 상업적으로 사용 되었다-사용 가능한 rRNA 고갈 키트 mRNA 풍부에도 효과적일 수 있습니다.

여기, S. cerevisiae 유전자 식 응답 저 산소 증으로 특징 이었다. 세포 저 산소 증에 노출 되었고 다음 8 시간 지점에서 샘플링 (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180, 240 분). 재현성을 확인 하 고 통계적으로 변경된 증명서를 확인 하 세 생물 복제 수행 했다. RNA는 기계적 장애 및 열 정화, 추출 하 고 RNA-seq 분석에 대 한 처리. -시퀀싱 파이프라인을 설명 하 고 프로그래밍 스크립트 수 있는 제공 됩니다 분석의 정확한 복제 수행. 특히, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, 24R 통계 환경 그리고 DESeq2 패키지 25 사용 되었다 RNA-seq 데이터를 처리 하 고 기간 동안 크게 변경 607 유전자를 식별 하 저 산소 증입니다. 주성분 분석 (PCA)와 복제의 유전자 발현 기술의 재현성을 표시. 클러스터링 및 heatmaps 유전자 존재론 (가십시오) 분석 많은 세포질 과정, 호 기성 호흡 처럼 풍성 하 게 산소 통제 유전자의 세트에서 보였다 동안 광범위 한 식 속도 론을, 계시 했다.

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프로토콜

1. 저 산소 증 유도

  1. 1 일 이상 hypoxia 시간 코스 하기 전에: 인큐베이터를 준비, 필터링 시스템, 진공, 가스 탱크, 플라스 크, stoppers, 유리 튜브와 튜브, 자료 테이블에서.
  2. 셀의 빠른 처리에 가까운 근접에서 N2 탱크, 인큐베이터, 진공 및 필터링 시스템을 놓습니다.
  3. 유리 병에 압력가 마로 소독 구성 요소를 혼합 하 여 살 균 액체 YPD 미디어 (1% 효 모 추출, 2% 펩, 2% 포도 당)을 준비 합니다.
  4. 인큐베이터에서 플라스 크의 레이아웃을 계획 합니다.
    참고: N2 탱크에서 처음 플라스 크는 물 트랩, 두 번째 플라스 크 마지막 시간 포인트가 될 것입니다, 그리고 세 번째 플라스 크 됩니다 두 번째 마지막 시간 포인트 등 최종 물 트랩은 마지막 술병까지. 그림 1 는 플라스 크 사이 순서 및 연결을 보여 줍니다.
  5. 하루 시간 과정 전에 5 mL 액체 YPD 멸 균 시험관 내에서 문화에 효 모 식민지를 예방. 특히, 메 마른 주걱 스틱을 사용 하 여 접시에서 전체 식민지를 선택 합니다. 액체 YPD에 막대기를 배치 하 고 셀의 대부분에에서는 때까지 지팡이 흔들어.
  6. 30 ° C에서 하룻밤 (~ 16 h) 튜브를 회전 합니다.
    참고: 후 16 h wildtype 셀 채도 (~ 108 셀/mL x 2), 매우 흐린 문화 표시를 달성할 것입니다. 다른 긴장 포화를 도달 하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있습니다 그리고 단계 1.9.4 같이 분 광 광도 계로 셀 농도 측정 하 여 시험 한다.
  7. 시간 코스의 날, 부 화의 16 h 포화 문화를 희석 후 5 mL를 피펫으로 4 mL를 사용 하 여 1시 50분 하룻밤 문화 메 마른 500 mL 플라스 크 내의 액체 YPD 196 mL로. 30 ° c.에서 4 h ~ 200 rpm에서 떨고와 성장
    참고: 4 h 후 wildtype 문화 ~ 1-2 x 107 셀/mL의 중간 로그 농도 도달 한다.
  8. 4 h 인큐베이션 기간 동안 라벨 (대 한 산소와 물 트랩) 플라스 크 및 50 mL 수집 튜브. 위의 단계 1.7에서에서 인큐베이터 hypoxia 시간 과정에 대 한 사용 하지 않으면, 다른 인큐베이터 켜고 설정 30 ° c
  9. 바로 전에 세포 저 산소 증에 쓰는:
    1. 2 물 트랩 될 것입니다 살 균 250 mL 플라스 크에 물 50 mL를 추가 합니다.
    2. 1입력 /3 얼음의 액체 질소와 양동이 50 mL 원심 분리기 튜브를 폴리스 티 렌 거품 랙 잠수함.
    3. 세포를 수집 하기 위한 필터 시스템을 설정 합니다. 필터 디스크의 가장자리를 터치만 주의 하면서 멸 균 핀셋을 사용 하 여 여과 시스템의 아래쪽 단위에 살 균 필터 디스크를 추가 합니다. 필터 상위 단위 필터 아래쪽 단위에 놓고는 클램프와 함께 보안 시스템으로 제공 합니다. 단단한 물개 및 누설을 아래와 위쪽 단위 정렬 됩니다 있는지 확인 합니다.
    4. 분 광 광도와 세포 농도 측정 합니다. 분 광 광도 계-~0.2-는 분 광 광도 계에 따라 0.6 사이 세600 의 선형 범위에서 측정 될 수 있도록 세포를 희석.
      참고: 하나의 OD600 단위 세포 형태학 및 분 광 광도 계에 따라 107 셀/mL, x 3는. 해당 ~0.33-0.66의 OD600 하 ~ 1-2 x 107 셀/mL의 농도 예정 이다.
    5. 시간 0 예제를 신속 하 게 얻을.
      1. 진공 튜브와 1000 mL 플라스 크 트랩을 통해 강한 (~ 10 mbar) 진공 필터 시스템을 연결 합니다. 진공을 켭니다. 가기에 문화 (보통 ~ 20 mL)을 부 어 하 고 필터를 통해 끌어올 액체에 대 한 기다릴 (~ 10 s, 진공의 강도 따라).
      2. 조심 스럽게 깨끗 한 핀셋으로 필터 디스크를 제거 하 고 50ml 원심 분리기 관으로 장소. 즉시에 액체 질소에 빠져들 랙에 원심 분리기 튜브를 놓습니다. 중요 한 것은, 수행 하지 미리 진정 튜브 튜브 폭발로 필터를 삽입 하기 전에.
      3. 후 > 30 s, 장소 나중 RNA 추출-80 ° C 냉동 고에 관. 각 여과 후 청소 하 고 필터 시스템을 재조립 하십시오. 10 물을 당겨서 시스템 린스 필터 디스크 없이 s. 마지막으로, 닦 고 마른 종이 타월로 시스템.
    6. 각 플라스 크에 hypoxia의 표시 시간 시점에서 중간 로그 농도 (~ 1-2 x 107 셀/mL)를 도달 하는 다양 한 시간 포인트에 대 한 다른 플라스 크에 4 h 문화를 희석.
      주: 표 1 야생-타입 S288C HAP1+ 단일 스트레인에 대 한 사용 된 희석을 보여준다. 각 스트레인이 문화 hypoxic 조건 테스트는 희석을 적절 하 게 조정 하는 것이 좋습니다.
    7. 세포와 미디어는 플라스 크에 추가 됩니다, 일단 취재 술병 마 개 삽입 하는 두 개의 유리 튜브를 포함 하 여 알루미늄 호 일을 교체 합니다.
    8. 이전 결정 하는 레이아웃에 인큐베이터에는 플라스 크를 놓습니다.
    9. 그림 1에서 보듯이 안전 하 게 튜브를 연결 합니다.
    10. 모든 stoppers 플라스 크 구멍으로 단단히 밀어는 확인 하십시오.
  10. 0 번에 레 귤 레이 터 밸브를 엽니다. 다음 3 L/min 흐름 미터 설정.
    참고: 버블링 관찰 됩니다 두 물 플라스 크에 적절 한 가스 흐름을 나타내는. 만약이 모든 마 개는 빡 빡 하 고 튜브가 제대로 연결 된 경우, 확인 하지 않습니다.
  11. 인큐베이터 닫고 ~ 200 rpm 진동 속도 설정 합니다. 타이머를 시작 합니다.
  12. 각 시간 지점 앞 단계 1.9.3에서에서 위의 설명 대로 필터 시스템을 설정 합니다.
  13. (예를 들어, 5 분, 10 분, 등) 각 시간 지점에서 신속 하 게 다음과 같이 셀을 처리 하는 두 사람이 있다:
    1. 첫 번째 사람: 소유자에서 적절 한 플라스 크를 제거 하 고 (와 함께 유리 튜브 연결) 마 개를 꺼내.
      참고:이 나머지 문화 플라스 크의 N2 의 흐름을 깨뜨리지 않을 것 이다 하지만 일시적으로 마지막 물 트랩을 흐름을 끊을 것 이다.
    2. 두 번째 사람: 피펫으로 문화의 1 mL는 베트에 분배 하 고. 이제는 라인의 끝에 마지막 물 트랩 (1 개의 관 및 한 마 개는 과정에서 제거) 문화 플라스 크에서 튜브를 다시 연결 합니다. 1.9.4 단계에서 위에서 설명한 다음, 베트에서 세포 농도 측정 합니다.
    3. 첫 번째 사람: 진공 여과 시스템으로 문화의 나머지 부분을 부 어 하 고 필터링 및 동결 단계 1.9.5에서에서 위에서 설명한 대로 수행.
  14. 모든 시간 포인트 완료 되 면, N2 가스를 해제 합니다. 먼저는 레 귤 레이 터 및 출시, 압력에 대 한 대기 닫고 흐름 미터를 해제 합니다. 마지막으로 시스템을 분해 하 고 깨끗 한 물 그리고 70% 에탄올으로 모든 재료.

2. RNA 추출

  1. 자료 테이블에 설명 된 대로 RNA 열 정화에 대 한 실내 버퍼를 준비 합니다.
  2. 샘플 당 버퍼 RDD의 70 µ L을 DNase 재고 솔루션의 10 µ L을 추가 하 여 작업 솔루션 DNase의 준비 ( 자료 표참조).
  3. 필터 및 셀-80 ° C 냉동 고에서 포함 된 50 mL 튜브를 제거 하 고 얼음이 해빙 (~ 15 분)에. 얼음에 튜브와 함께 다음 단계를 수행 합니다.
  4. 라벨 2 mL 스크류 캡 튜브 고 얼음, 각 샘플에 대 한 하나의 튜브에 그들을 놓습니다. 푸 고 구슬 측정을 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 사용 하 여 각 튜브를 산 세척 구슬의 ~0.6 mL를 추가 합니다.
  5. 50 mL 튜브에 차가운 실내 버퍼의 0.6 mL를 추가 합니다.
  6. 피펫으로 필터에서 셀을 제거 하 고 솔루션에 일시 중지를 아래로. 시키는 필터 필터 솔루션을 담가 합니다 솔루션에 남아 하지 마십시오. 모든 솔루션 제거는 튜브의 벽에 대 한 필터를 집어넣은 피펫으로 팁을 사용 하 여 필터에 흡수.
  7. 구슬 포함 된 스크류 캡 튜브 50 mL 튜브에서 액체의 모든 전송.
  8. 비드 밀 균질 화기에 스크류 캡 튜브를 놓고 1 분 동안 실행 합니다.
    바로 3 분 동안 얼음에 튜브를 놓습니다. 다시, 튜브는 균질 화기에 놓고 1 분 동안 실행 합니다.
  9. 균질 화기와 5 분 동안 얼음에 장소에서 튜브를 제거 합니다. 구슬 튜브의 하단에 정착 됩니다.
  10. 실 온에서 단계의 나머지 부분을 수행 합니다.
  11. 피펫으로, 전송만 lysate (~ 350 µ L), 구슬, 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 피하.
  12. 최대 속도와 다음 전송은 상쾌한 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 2 분 동안 Microcentrifuge.
  13. 70% 에탄올 (200 증거 분자 생물학-학년 에탄올에서 만든)의 1 볼륨을 추가 합니다. Pipetting으로 잘 섞는다.
  14. 솔루션 및 전송 2 mL 컬렉션 튜브 내부 배치는 RNA 열을 촉진.
  15. (튜브에 액체) 15 ≥12에서 s, 000 x g 및 흐름을 통해 삭제 분리기
  16. 열에 버퍼 RW1의 350 µ L를 추가 합니다. 15 ≥12에서 s, 000 x g와 흐름을 통해 삭제에 대 한 원심 분리기.
  17. 80 µ L을 추가 DNase 나 열 막에 인큐베이션 믹스 (하지 마세요 튜브의 양쪽) 15 분 동안 앉아 있게 하 고.
  18. 열 버퍼 RW1의 350 µ L를 추가 합니다. 15 ≥12에서 s, 000 x g 와 흐름을 통해 삭제에 대 한 Microcentrifuge.
  19. 열에 버퍼 RPE의 500 µ L를 추가 합니다. Microcentrifuge 15 ≥12에서 s, 000 x g 및 삭제에 대 한 흐름-통해.
  20. 열에 버퍼 RPE의 500 µ L를 추가 합니다. ≥12, 000 x g2 분에 대 한 Microcentrifuge.
  21. 조심 스럽게 열을 제거 하 고 새로운 2 mL 수집 관으로 장소. (완전히 건조 막)에 1 분에 대 한 최고 속도로 Microcentrifuge.
  22. 컬렉션 튜브를 버리고 고 열 1.5 mL microcentrifuge 관 합니다. 열 막에 RNase 무료 물 30 µ L를 추가 합니다.
  23. ≥12, 000 x g에서 1 분 동안 microcentrifuging에 의해 열 로부터 RNA을 elute. microcentrifuge에 열을 로드할 때 컬렉션 튜브의 뚜껑 떨어져 뚜껑을 방지 하기 위해 원심 분리기는 회전 방향에 직면 하 고 있는지 확인 합니다.
  24. 동일한 microcentrifuge 튜브는 열을 유지 하면서 열 막에 RNase 무료 물의 또 다른 30 µ L를 추가 합니다.
  25. Microcentrifuge ≥12, 000 x g, 1 분에 대 한 최종 eluate 볼륨은 60 µ L.
  26. -80 ° C 냉동 고에 있는 RNA의 60 µ L을 포함 하는 각 1.5 mL 튜브를 저장 합니다.

3. RNA 농도 품질을 결정

  1. 자료 테이블에 나열 된 대로 (가) fluorometer, (b) DNA 및 RNA 관련 형광 염료 및 (c) 분석 결과 튜브를 사용 하 여 각 RNA 샘플에서 RNA와 DNA의 농도 측정 합니다. fluorometer와 염료의 지시를 따릅니다.
  2. 또는, 260에서 UV 분 광 광도 계와 핵 산 농도 측정 nm.
    참고: 1.0 A260 읽기는 ~ 40 µ g/mL 단일 가닥 RNA.
  3. 상업적인 핵 산 분석기에 RNA를 실행 하 여 RNA 품질 테스트 ( 자료 표참조)에 표준 포름알데히드/agarose 젤 26또는.

4. RNA-seq 분석

  1. 총 RNA 주식에서 100 ng / µ L RNase 무료 물에서 RNA의 21 µ L을 확인 합니다. 이 21 µ L의 1 µ L를 사용 하 여 위와 같이 RNA 농도 테스트. 나머지 20 µ L (2 µ g) 총 RNA mRNA 농축에 대 한 외부 시퀀싱 센터, (와 함께 8 개 이상의 바코드 다중화) 가닥 특정 라이브러리 준비 제출 및 시퀀싱 ( 자료 표참조). 또는 로컬 mRNA 농축 및 라이브러리 준비를 수행 하 고 시퀀싱에 대 한 라이브러리를 제출.
  2. 풀 8 개 이상의 멀티플렉스 샘플 및 다음-세대 시퀀서의 한 차선에 시퀀스.
  3. 시퀀스 읽기의 모든 포함 된 FASTQ 파일을 다운로드 하 고 해당 인덱스를 읽습니다. 또한, 다중 바코드를 포함 하는 텍스트 파일을 다운로드.
    참고: 인덱스 읽기 별도 FASTQ 파일에 존재할 수 있습니다. 하나의 디렉토리에 모든이 파일을 놓습니다.
  4. 여기, "fastq_pipeline.sh", 같은 디렉터리에 제공 하는 셸 스크립트를 놓습니다. 실험 및 컴퓨터 디렉터리에 대 한 적절이 스크립트를 편집 합니다.
    참고:이 스크립트는 광범위 한 주석 설명 하는 단계를 포함 합니다. 간단히, 스크립트 품질 읽기 트림, 게놈, 읽기 지도 고 각 샘플에 대 한 유전자 당 읽기 수를 포함 하는 탭 구분 파일을 생성 합니다.
  5. FASTQ 파일 및 원시 읽기 수 데이터 게시 27전에 NCBI의 유전자 식 옴니 버스에 입금. "GEO 제출 높은 처리량 시퀀스 데이터"에 대 한 지침을 따르십시오: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
  6. R 통계 환경으로 읽기 수 데이터를 가져오고 "time_course_script 여기, 제공 하는 R 스크립트를 사용 하 여 통계 분석을 수행. R "입니다. 실험 및 컴퓨터 디렉터리에 대 한 적절이 스크립트를 편집 합니다.
    참고:이 스크립트는 광범위 한 주석 설명 하는 단계를 포함 합니다. 간단히,이 스크립트 읽기 데이터를 가져옵니다, 그리고 읽기도 시간 과정 동안 크게 변경, PCA 분석을 수행 하 고 그래프 선택 된 유전자의 표정을 유전자를 식별 합니다.

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결과

Hypoxia 시간 과정 및 RNA-seq 분석 세 번 독립적으로 수행 했다. 3 복제의 재현성 검사, 유전자 표현 데이터 모든 유전자에 대 한 주요 구성 요소 분석 (PCA)를 사용 하 여 분석 했다. 그림 2 는 샘플 함께의 58.9%를 대표 하는 첫 번째 두 개의 주요 구성 요소를 통해 변경 하는 방법을 보여 줍니다. 이 분석 표시 각 시간 과정 (와 같이 각 곡선의 비슷한 모양) 이와 유사한 변화를 전시. 또한, 마지막 두 복제 첫 번째 복제 하기 보다 서로 게 더 유사 했다. 이것은 마지막 2 개의 복제 첫 번째 복제는 다른 사람 및 일괄 처리에 의해 수행 하는 동안 미디어 구성 요소, 동일한 일괄 처리를 사용 하 여 동일한 사람에 의해 수행 된 사실과 일치. 이 사실 기술과 화학 제품의 높은 재현성을 얻기에 있는 중요 한 요소를 강조 표시 합니다. 마지막으로, PCA 분석 평가 선택한 시간 포인트 캡처 시간...

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토론

이 연구에서는 모든 유전자에 대 한 mRNA 수준 효 모 S. cerevisiae에서 hypoxia 동안 측정 되었다. 목표 근처 무산 소 환경에서 증가로 어떻게 세계적인 유전자 표현 변화를 분석 했다. 몇 가지 단계는 여기서 설명 하는 방법을 신중 하 게 제어 하 고 재현할 수 있었다는 촬영 했다. 첫째, 세포는 정확 하 게 정의 된 hypoxic 환경에 노출 되었다: 리치 미디어 (YPD)에서 99.999% N2 . 저 산소 증의 다른 연구 플라스 크 또는 32공기 관 폐쇄, hypoxia 모방 코발트 염화 33, 사용 또는 hypoxia 유도 혐 기성 챔버 또는 가방 34고용. 이러한 각 메서드는 hypoxia 또는 다른 의도 하지 않은 환경 변화에 대 한 다양 한 수준의 발생할 수 있습니다. 그것은 야생 효 모는 덜 가혹한 hypoxic 조건 경험을 가능성이 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 감사 하는 루이스 Sigler 연구소 기술 자문 및 RNA 라이브러리 준비 및 시퀀싱에 프린스턴 대학에서 통합 게놈 시퀀싱 핵심 시설에 대 한. 이 작품은 M.J.H.에 NIH NIGMS R15GM113187로 웬 대학에서 교부 금에 의해 지원 되었다

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
밀폐형 건식 인큐베이터Thermo ScientificMaxQ 4000Set at 30 °C. 하나의 Tygon 튜브가 들어갈 수 있도록 도어를 수정합니다. 또는 튜브 포트가 있는 New Brunswick G25 인큐베이터를 사용하십시오. 플라스크 사이의 튜브에 응결이 모여 배양물을 교차 오염시킬 수 있으므로 야외 물 셰이커를 사용하지 마십시오.
마이크로 분석 필터 홀더MilliporeXX1002530직경 25mm, 스테인리스 스틸 지지대, 표준 125mL 여과 플라스크에 5번 천공 실리콘 스토퍼 장착
강력한 진공EdwardsE-LAB 2" 집" 진공이 너무 약할 수 있습니다. 또는 여기에 나열된 것과 같은 전기 동력 휴대용 진공 펌프를 사용하십시오.
1,000 mL 플라스크진공 트랩 역할.
헤비 월 진공 튜브의 ~ 2 피트 길이, 내경 3/8 인치, 외경 7/8 인치Tygon38TT두 조각 : 첫 번째는 진공을 트랩에 연결하고 두 번째는 트랩을 필터 시스템에 연결합니다.
고압 N2 가스 탱크순도 99.999%, >1,000psi, 레귤레이터 및 가스 유량 컨트롤러 포함
인 오토클레이브 500mL 플라스크개구부. 각 효모 균주에 대해 하나씩.
오토클레이브 250mL 플라스크알루미늄 호일로 덮인 개구부. 각 시점에 1개, 워터 트랩에 2개.
플라스크 스토퍼(크기 6, 직경 5mm의 구멍 2개)70% 에탄올로 살균. 각 플라스크에 하나씩.
유리관, 길이 9cm 또는 17cm, 내경 2mm, 외경 5mm70% 에탄올로 멸균. 각 플라스크에 대해 두 개의 튜브. 각 마개의 구멍에 넣습니다. 9cm 튜브와 17cm 튜브의 배치는 그림 1을 참조하십시오.
플라스틱 튜브의 ~ 25cm 길이, 내경 5mmTygonE-3603플라스크 당 한 개. 70% 에탄올로 살균되었습니다.
멸균 필터 디스크MilliporeHAWP02500직경 25mm, 0.45 &마이크로; m 기공 크기, 시점마다 하나씩
멸균 dH2O (~100 mL)
1 mL 큐벳OD600(즉, 세포 농도) 측정용50
mL 멸균 원심분리기 튜브각 시점마다 1개
세척 및 멸균 핀셋
액체 질소세포 동결용
산성 세척 비드SigmaG8772유지 & 세포 용해를 위한 C
Qiagen RNeasy 미니 키트Qiagen74104RNA 컬럼 정제
Qiagen RLT 완충액10 µ를 추가하여 준비합니다. RLT 완충액 1mL당 β-메르캅토에탄올 L, 4°C로 유지합니다.
2 mL 수집 튜브: Qiagen Rneasy Mini Kit Buffer에 포함된Qiagen
, QiagenQiagen, Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer, RW1Qiagen에 포함된 QiagenQiagen Rneasy Mini Kit,
DNase I 재고 및 작업 솔루션Qiagen79254DNase I 효소는 유리 바이알에 동결건조된 분말 형태로 들어 있습니다. 멸균 바늘과 주사기를 사용하여 550 µ를 주입하십시오. RNase가 없는 물(Qiagen 키트에 제공됨)을 바이알에 넣습니다. 병을 부드럽게 뒤집어 섞습니다. 효소의 변성을 피하려면 와류를 일으키지 마십시오. 피펫을 사용하여 바이알에서 이 원액을 제거하고 냉동실에 보관합니다(-20 ° C) 일회용 부분 표본(80 µ L 각). 원액은 해동 및 재동결해서는 안 됩니다.
Qiagen DNase 키트에 포함완충액 RDDQiagen
RNA 추출 중 세포 용해 용2 mL 스크류 캡 튜브
비드 밀 균질화 기Biospec Mini-Beadbeater-24112011냉장실에 보관
액체 YPD 매체Bacto PeptoneBDDF0118
Bacto Yeast ExtractBDDF0886 YPD 매체
포도FisherD16액체용 YPD 매체
Qubit 분석 튜브Thermo FisherQ32856핵산 농도 측정용
Quant-iTTM dsDNA BR 분석 키트Thermo FisherQ32853핵산 농도 측정용
Quant-iTTM RNA 분석 키트Thermo FisherQ32855산 농도 측정
Qubit 형광측정기Thermo FisherQ33216핵산 농도 측정
상업용 전기영동 시스템핵산 품질 측정을 위한AgilentBioanalyzer 2100
염기서IlluminaHiSeq 2500
염기서열분석 라이브러리
PrepX PolyA mRNA 분리 키트,전체 RNA에서 mRNA를 분리하기 위한Wafergen400047
Illumina 라이브러리 키트용 PrepX RNA SEQ 라이브러리 키트
에서 가닥 특이적 염기서열분석 라이브러리를 생성하기 위한 Wafergen 400039https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, gzip 명령http://www.htslib.org/download/
Trimmomatichttp://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (TopHat 전에 설치됨)가http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHathttps://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeqhttp://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (R Studio 이전에 설치됨)https://cran.rstudio.com
R Studio (무료 버전)https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
알루미늄 호일로 덮 4°C 에 포함된 , , , 된 차가운용당 핵, , , , , 염기서열분석 라이브러리, 자동 액체 처리 시스템, Wafergen Apollo 324, 생성을 위한 차세대열분석기 , , 전체 RNA 바코드 스플리터 포함되어 있습니다.

참고문헌

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