왼쪽된 심 실 비 대의 유도 대 한 생쥐에서 최소 침 습 가로 대동맥 수축의 기술

요약

이 프로토콜의 목표는 단계별로 설명 하는 최소 침 습 가로 대동맥 수축 (TAC) 생쥐에서의 기술. 삽 관 법 그리고 일반적으로 사용 되는 표준 절차 필수는 환기의 제거, 최소 침 습 전술 수술 절차를 간소화 하 고 동물에 긴장을 감소 시킨다.

초록

마우스에 가로 대동맥 수축 (TAC) 왼쪽 심 실 비 대 (LVH) 및 그것의 진행 성을 심장 마비에 압력 과부하 유발 실험 조사를 위한 가장 일반적으로 사용 된 수술 기법 중 하나입니다. 대부분의 보고 된 조사,이 절차는 삽 관 법 및 환기를 요구 하 고 시간이 걸리는 그것을 렌더링 하 고 동물을 수술 부담을 추가 동물의 수행 됩니다. 이 프로토콜의 목표는 삽 관 법 없이 침 습 전술의 단순화 된 기술과 쥐의 환기를 설명 하는. 기술의 중요 한 단계 낮은 사망률과 LVH 유도에 높은 효율을 달성 하기 위하여 강조 된다.

남성 C57BL/6 마우스 (10 주 오래 된, 25-30 g, n = 60) 마 취 제와 xylazine의 혼합물의 단일 복 주사로 마 취 되었다. 자발적 호흡에 다음 3-4 m m 상단 부분 sternotomy 동물 6/0 비단 봉합 결 찰 원조의 눈을 통해 스레드 세그먼트 대동맥 아치 아래에 전달 되었고 무딘된 27 게이지 주사 바늘에 연결. 운영 하는 가짜 동물 수술 같은 수술 준비 대동맥 수축 하지 않고. LVH 유도에 절차의 효능은 심장/몸 무게 비율에 있는 상당한 증가 의해 증명 된다. 이 비율은 3, 7, 14, 28 일 수술 후에 얻은 것입니다 (n = 6-10 각 그룹 및 각 시간 점). 우리의 기술을 사용 하 여, LVH 주 7 일 28 통해에서 가짜 동물에 비해 전술에서 관찰 됩니다. 요원 하 고 늦은 (이상 28 일) mortalities는 둘 다 매우 낮은 1.7%에.

결론적으로, 마우스에 최소한 침략 적 전술의 우리의 비용 효과적인 기술 매우 낮은 수술 및 수술 후 mortalities을 실시 하 고 LVH 유도에 매우 효율적입니다. 그것은 수술 절차를 간소화 하 고 동물에 긴장을 감소 시킨다. 그것은이 프로토콜에서 설명 하는 중요 한 단계를 수행 하 여 쉽게 수행할 수 있습니다.

서론

지난 년 동안 심장 마비의 연구에서 실시 되었습니다 가능한 동물 모델¹. 심장 마비의 대형 동물 모델에 비해, 작은 동물 모델 수많은 잠재적인 이점이 있다. 주택 및 유지 보수 비용 절감, 옆에 작은 동물 모델 때문에 덜 복잡 한 필요 시설²더 많은 연구를 액세스할 수 있습니다.

마우스 심장 마비 모델 쥐 모델과 동일한 이점의 많은 제공합니다. 또한에 감소 된 주택 비용³, 마우스 모델 혜택 관련 유전자 변형 및 녹아웃 (KO) 긴장의 가용성. 셀 형식 관련, 유도할 수 있는 코 또는 유전자 변형 전략의 가능성에서 심장 마비의 병 인을 공부 하 고 새로운 치료 regimens³을 식별 하려고 하는 귀중 한 도구가 마우스를 확인 합니다.

마우스 가운데 심장 마비의 모델에는 현재⁴사용, 가로 대동맥 수축 (TAC) Rockman⁵ 에 의해 처음으로 설명 하는 압력 과부하 유발 왼쪽된 심 실 비 대 (LVH)¹ 을 생성 하는 기본 모델 ^{, 3}.이 모델의 가장 큰 장점은 LVH²층 리를 수 있도록 하는 기능입니다, 비록 왼쪽 심 실 개장 하는 전술에 대 한 응답에는 다른 마우스 긴장 중 변수. 특히, C57BL/6 마우스 개발 다른 긴장^4,,67발생 하지 않을 수 있습니다 전술 후 빠른 LV 팽창 합니다.

전술 원인으로 달성 하는 고혈압의 갑작스런 발병은 약 50% 증가 LV 질량에 2 주 이내 빠르게 변조 LVH⁴의 개발을 목표로 하는 약리학 또는 분자 개입의 활동을 검사 허용. 전술에 의해 심한 고혈압의 급성 유도 않습니다 정확 하 게 진보적인 왼쪽된 심 실 비 대를 재현 하 고 대동맥 협 착 증 또는 동맥 고혈압의 임상 설정에서 관찰 개장. 그럼에도 불구 하 고,이 모델 많은 조사자에 의해 식별 하 고 심장 마비⁴소설 치료 목표를 수정 하는 데 사용 됩니다.

마우스에 전술 수행 LVH 및 후속 심장 마비²를 유도 하는 데 사용 하는 다른 기술에 대 한 필요한 것 보다 더 큰 외과 전문을 필요 합니다. 대부분 작성자 intubating 및 환기는 동물^2,8, 더 요구 하 고 시간이 걸리는이 절차를이 수행 하 게 하 고 동물에 대 한 수술 부담을 추가 하 여이 절차를 수행 합니다. 몇 가지 조사 수술^9,,1011에 대 한 간략 한 참조와 함께 그들의 연구에서 최소한 침략 적 전술을 사용 했습니다.

이 프로토콜의 목표는 단계별로 설명 하는 절차의 중요 한 단계를 강조 하는 쥐의 최소 침 습 가로 대동맥 수축의 단순 하 고 사용 하기 쉬운 기술. 이러한 주요 단계에 따라, 하나 쉽게이 기술을 수행할 수 있습니다.

프로토콜

남성 C57BL/6J 마우스 (10 주, 25-30 g, n = 60)이이 프로토콜에 사용 됩니다. 동물 받을 인도적인 치료 농업의 고 등 교육 및 연구, 프랑스 내각에 의해 공식화 하는 지침을 준수 하 고 모든 절차는 1986 년 11 월 24 일의 유럽 공동체 위원회 지침에 따라 수행 됩니다 ( 86/609/EEC) 및 프랑스 법률. 프로토콜에 의해 승인 되었다는 " 지역 윤리 위원회 동물 실험 CREMEAS " (#2016092816207606).

1. 수술을 위한 준비

1. 표준 감 금 소, 음식 (자세한 내용은 참조 자료의 테이블)에 12 h/12 h 명암 주기, 동물 시설에 도착 후 1 주일 동안 생쥐를 유지 하 고 사용할 수 있는 광고를 물 libitum.
2. 작업 일에 장소 쥐 개별 연습장에 몇 분의 마 취 유도 전 동물에 어떤 추가적인 스트레스를 피하기 위하여. 수술 전날 모든 수술 기구를 소독.
3. 주사 intra-peritoneally 케 타 민 (51.4 mg/kg) 및 xylazine (3.3 mg/kg) 생리 식 염 수에 희석의 혼합물의 단 하나의 복용량 (0.9 %NaCl).
4. 발가락 후퇴 반사의 부재에 의해 마 취의 깊이의 있는지 확인 하십시오.
5. 상용 면도칼으로 목과 동물의 가슴을 면도 하 고 면도 지역 70% 알코올로 소독.
6. 동물 부정사 깨끗 한 코르크 작업 패드에 놓고 접착 테이프로 발 수정.

2. 수술

1. 불 임 수술 기법 절차 전체에서 사용 됩니다. 자발적 호흡에서 동물, 중간 가슴 위에 sternal 노치에서 11-블레이드 나이프를 흉 골 ( 그림 1)을 노출 하려면 경도 중간 자 궁 경부 절 개를 10 밀리미터 이상 수행.
2. Crile 나무 4/0 monofilament 폴 리 프로필 렌 숙박 봉합 바늘 홀더를 전달 하 여 갑 상선 철회와 작업 패드 테이프.
3. 기도 밝히기 위해 마이크로 수술 겸 미리 tracheal 근육 퉁 명 스럽게 구분.
4. 슬라이드 부드럽게는 부드럽게 밀고 기관지와 흉 골 뒤에 닫힌된 문 턱으로 마이크로 수술 겸 곡선.
5. 에 의해 신중 하 게 부드럽게 밀고 곡선된 microsurgical 집게의 문 턱을 개폐 수행 미리 tracheal 근육 아래와 이동 늑 흉 골 뒤에 무딘 해 부.
6. 부드럽게 밀고 바로 마이크로 수술 집게로 바로 위에-clavicular 근육을 파악 하 고 동물의 가슴을 부드럽게 올려.
7. 흉 골 아래 뼈 집게의 열 등 한 턱 고 3-4 m m 상단 부분 sternotomy ( 그림 2)를 수행 하십시오. 직접 미니 sternotomy 왼쪽으로 약간의 아래 부분.
8. 는 마이크로 수술 바늘 홀더를 사용 하 여 미니 sternotomy의 각 측면에 두 번째 있는 공간을 통해는 7/0 monofilament 폴 리 프로필 렌 숙박 봉합에서 안쪽에 밖으로 전달 합니다. 가까워 있는 및 내부 흉부 혈관 이나 늑 막에 부상을 피하기 위해 비용 sternal 각도.
9. 7/0 monofilament 폴 리 프로필 렌 숙박 봉합을 사용 하 여 각 측면에 sternal 가장자리를 확산 하 고 접착 테이프로 작업 패드 수정.
10. 부드럽게 옆으로 이동 중 tracheal 근육, mediastinal 지방 및 낮은 전원 확대 (2-3 배)에서 대동맥 아치를 시각화 하기 위해 microsurgical 집게 곡선 thymus 부드럽게 밀고 사용 하 여 ( 그림 3). 터치 또는 매 개발을 방지 하기 위해 정수 리 늑 막 손상 특정 주의.
11. 집게 ( 그림 4) 매 서 대동맥 아치 아래 부드러운 조직을 노출 하 고 그것의 턱을 부드럽게 확산. 부드럽게 열고 닫는 부드러운 조직에서 턱으로 두 번째 연결 집게와 대동맥 아치 아래 부드러운 조직에 터널을 준비.
12. 왼손 대동맥 아치 아래에 개최 결 찰 원조 ( 그림 4 B)의 눈을 통해 스레드 6/0 실크 합자의 세그먼트를 통과 하 고 오른손의 사이 집게를 매 서 검색 innominate 오른쪽과 왼쪽 일반적인 경 동맥 ( 그림 5).
13. 27 게이지 바늘 5mm의 길이로 잘라 고 Crile 바늘 홀더를 가진 그들을 눌러 양쪽 끝을 둔. 부드럽게 밀고 바로 마이크로 수술 집게와 대동맥 아치 ( 그림 6) 옆에 있는 무딘된 27 게이지 바늘을 놓고 바늘 innominate 오른쪽과 왼쪽 일반적인 경 동맥 사이 대동맥 주위 snugly 봉합 넥타이 두 연결 집게 ( 그림 7)를 사용 하 여 동맥. 석판에 봉합 넥타이, 뒤에 4 개의 추가 노트 초기 이중 매듭을 수행 합니다. 모든 매듭 플랫 있는지 확인 하십시오.
14. 결 찰, 후 신속 하 게 하지만 부드럽게 0.4 m m 직경 축소 달성 하기 바늘 및 제거 재현할 수 가로 65-70% 대동맥 수축.
15. 는 Hemostasis의 sternal 가장자리와 미리 tracheal 근육의 대동맥 아치, 주위 연 조직에 대 한 확인합니다. 관찰은 혈액의 돌아다니며 어디 resorbable hemostatic 거 즈를 넣어. 7/0 monofilament 폴 리 프로필 렌 sternal 가장자리 확산에 사용 되는 봉합 유지 제거.
16. 왼쪽된 두 번째 있는 공간 내부에 외부에서 마이크로 수술 바늘 홀더를 가진 간단한 6/0 monofilament 폴 리 프로필 렌 봉합 통과 그리고에서 내부에 바로 두 번째 있는 공간 외부. 가까워 있는 및 내부 흉부 혈관 이나 늑 막에 부상을 피하기 위해 비용 sternal 각도.
17. 함께 sternal 가장자리 여가지고 Crile-나무 매는 6/0 monofilament 폴 리 프로필 렌 봉합 바늘 홀더.
18. 피부 봉합에서에서 실행 한 레이어 Crile 나무 바늘 홀더 5/0 monofilament 폴 리 프로필 렌 닫습니다.
19. 가짜 절차 동일 수축 작업을 하지 않고 대동맥 주위 봉합 매.

3. 수술 복구

1. 동물을 매우 밀접 하 게 모니터. 마우스는 개별 케이지 전송과 경향이 위치에 놓습니다.
2. 허용 마우스까지 완전히 지구 온난화 빛에서 복구를 깨어 (마 취 유도 후 1 시간 미만).
3. 수술 무 통 주사 buprenorphine의 0.1 mg/kg intraperitoneally. 표시 된 대로 첫 3 일에 대 한 buprenorphine 모든 8 h의 0.1 mg/kg의 피하 주사를 반복.
4. 표준 케이지 (cage 당 최대 3 마우스) 및 케이지 당 최소 2 마우스 운영된 쥐 에서도.

4. 수확을 심장

1. 분석의 날, 케 타 민 솔루션 마우스를 안락사 300 mg/kg 및 xylazine 20 mg/kg 복 주입 하 여 염 분.
2. 먼저 열 등 한 베 나 정 맥에서 혈액을 수확 하 고 동일한 라인을 통해 염 분에 2.6 m m EDTA의 솔루션의 5 mL 주입.
3. 마음을 수확는 심 방을 제거 하 고 심장 (심 방 하지 않고 왼쪽 및 오른쪽 심)를 무게.
4. 분리 왼쪽 오른쪽 ventr에서icle 심장은 좌 심 실 부분에 나머지와 함께. 두 조직 샘플 무게 및 액체 질소에 그들을 동결.

결과

요원 및 늦은 생존
요원 생존은 매우 높은 전체 시리즈 (전술과 운영 하는 가짜 동물) 98.3% (60 명 중 59). 만 요원 죽음 가짜 작업 이었습니다 마우스에 출혈 합병증 때문 이었다. 28 일의 관찰 기간 동안 수술 생존 또한 98.3% (58 명 중 59) 우수 했다. 단지 늦게 수술 죽음 심장 근원의 아마 날 (D) 16, 전술 마우스에서 발생 했습니다.

기술의 유효성 검사
제시 방법은 매우 안정적이 고 재현입니다. Innominate 오른쪽과 왼쪽 일반적인 경 동맥 사이 봉합의 정확한 위치는 전술 진행 하는 모든 동물의 조직 수확 하는 동안 확인 되었다.

왼쪽된 심 실 비...

토론

이 프로토콜의 목표 생쥐에서 최소 침 습 가로 대동맥 수축에 대 한 수술 방법의 단계별 그림을 제시 하는입니다. 마우스에 가로 대동맥 수축의 자세한 기술 설명 다른 저자^2,8에 의해 보고 되었습니다. 그러나이 수술을 수행 하는, 삽 관 법 및 동물의 환기. 삽 관 법-환기의 추가 단계를 사용 하 여 복잡성과 전체 절차의 기간은 증가 하 고 글로벌 스트레스 동물에 노출 됩니다. 이러한 이유로, 최소 침 습 가로 대동맥 수축의 개념 몇 가지 관심을 받고 있다. 마우스에 최소한 침략 적 가로 대동맥 수축 왼쪽된 심 실 비 대와 심장 마비^9,,1011의 진행을 유도 하는 데 사용 됩니다. 이러한 연구의 왼쪽된 심 실 비 대, 심장 마비, 창세기에 관련 된 경로에 수술...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
수술용 현미경	Olympus	SZX2-TR30
면도기	Rowenta	Nomad
Sutures:
Polypropylene 7/0	Ethicon	BV-1X
Polypropylene 6/0	Bbraun	C0862061
Silk 6/0 ligature	FST	18020-60
폴리프로필렌 4/0	Ethicon	8683
폴리프로필렌 5/0	Ethicon	Z303
Drugs:
Ketamin	Merial	Imalgè ne 1000, LBM154AD
Xylazine	Bayer	Rompun 2%, KP09PPC
Buprenorphine	Ceva	Vetergesic, 072013
Instruments:
Bone 니퍼	미세 수술 도구	16101-10
결찰 보조	정밀 수술 도구	18062-12
묶는 집게	미세 수술 도구	18026-10
바늘 홀더 Crile-Wood	미세 수술 도구	12003-15
미세 수술 집게	세밀한 수술 도구	11003-12
미세수술용 집게	정밀 수술 도구	11002-12
조직 겸자	정밀 수술 도구	11021-12
미세 수술 바늘 홀더	정밀 수술 도구	12076-12
미세 수술 가위	정밀 수술 도구	91501-09
Mayo 가위	정밀 수술 도구	14511-15
11날 나이프	정밀 수술 도구	10011-00
RNA 추출 및 qPCR:
TriReagent	Euromedex	TR-118-200
Rneasy Mini kit	Qiagen	74704
Qubit 형광 측정 RNA 분석	Fisher Scientific	10034622
RNA 6000 나노 키트	Agilent	5067-1511
고용량 cDNA 키트	Fisher Scientific	10400745
Taqman 마스터 믹스	Fisher Scientific	10157154
Taqman BNP 프라이머	Fisher Scientific	Mm01255770_g1
Taqman ANP 프라이머	Fisher Scientific	Mm01255747_g1
Taqman ACE 프라이머	Fisher Scientific	Mm00802048_m1
Taqman Col1a1 프라이머	Fisher Scientific	Mm00801666_g1
Taqman TGFb 프라이머	Fisher Scientific	Mm01178820_m1
Taqman Gapdh 프라이머	Fisher Scientific	Mm99999915_g1
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Software:
GraphPad Prism	GraphPad	Prism 7
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Complete diet for adult rats/mouses	안전한	UB220610R