방법 논문

전송 전자 현미경 검사 법에서 미생물의 직렬 Ultrathin 섹션을 얻기위한 방법

DOI:

10.3791/56235

⸱

2018년 1월 17일

 , 
1Medical Mycology Research Center, Chiba University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 전송 전자 현미경 검사 법에서 고가의 장비 없이 미생물의 직렬 ultrathin 섹션을 얻기 위한 안정적이 고 쉽게 절차를 선물 한다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

셀 및 전송 전자 현미경 검사 법에서 고배율에서 3 차원 구성 요소 셀을 관찰 표본의 직렬 ultrathin 섹션을 준비 해야 합니다. 직렬 ultrathin 섹션 준비는 매우 어려운 것으로 간주 됩니다, 하지만 그것은 오히려 쉬운 경우 적절 한 메서드를 사용 하입니다. 이 종이에 우리는 안전 하 게 미생물의 직렬 ultrathin 섹션을 얻기 위한 단계별 절차를 보여줍니다. 이 방법의 핵심 포인트는: 1)는 시료의 큰 부분을 사용 하 여 견본 표면 및 칼 가장자리; 서로 평행 하 게 되도록 조정 하 2)을 그룹에서 직렬 섹션을 잘라내어 슬릿 격자;에 직렬 섹션의 그룹을 검색할 때 머리 가닥의 쌍을 사용 하 여 섹션 구분에 어려움을 피하기 위해 3) '섹션 지주 루프'를 사용 하 여 섹션 그룹;의 순서를 혼합 하지 마십시오 4) 사용 하 여 '물 표면 높이 루프' 확인 섹션의 꼭대기에 위치 하는 그들은 터치 그리드 첫째, 격자;에 원하는 위치에 배치 하려면 5) 사용 하 여 지원 영화는 알루미늄 선반에 쉽게 격자에 섹션을 복구 하 고 지원 영화;의 주름을 방지 하 그리고 6) 얼룩 튜브를 사용 하 여 실수로 핀셋으로 지원 영화를 위반을 피하기 위해. 이 새로운 메서드는 어려움 없이 직렬 ultrathin 섹션을 취득 수 있습니다. 메서드를 사용 하면 3d, 집중 된 이온 빔 전자 현미경 검사 및 직렬 블록-얼굴 또는 자동 테이프 수집 ultramicrotome 메서드를 사용 하 여 얻을 수 없는 높은 해상도에서 미생물의 세포 구조를 분석 가능 하 게.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

적절 한 직렬 ultrathin 단면 기술은 세포와 세포 구성 요소 전자 현미경 수준에서 3 차원으로 공부에 불가결 이다. 우리 효 모 세포의 세포 주기에서 스핀 들 극 본문의 역학을 공부 하 고 세포 주기 및 중복1,2,3, 의 시간 동안 그들의 열 대권 외의 형태학 변화 공개 4,5. 2006 년에, 우리는 '구조'를 결합해 새로운 단어 'structome'를 만들어낸와 '-오 ', '양적 및 3 차원 구조 정보 전자 현미경 수준에 전체 셀의 ' 6,7로 정의.

Structome 분석, 직렬 ultrathin 단면 기술을 요하는 그것 발견 Saccharomyces cerevisiae 와 Exophiala dermatitidis 효 모 세포 약 200000 리보솜7,8, 는 했다 대장균 셀 26000 리보솜9, 결핵균 셀 했다 1700 리보솜10 고 묘 진 나선형 박테리아만 300 리보솜11했다. 이 정보 뿐만 아니라 각 유기 체 뿐만 아니라 종9의 성장 율을 예측에 유용 합니다.

또한, 새로운 유기 체;의 발견에 지도 하는 structome 분석 Parakaryon myojinensis 는 누구의 셀 구조 원핵생물과 진핵생물12,13,,1415의 그들 사이 중간 했다 일본의 해안 떨어져 깊은 바다에서 발견 되었다. 현재, 직렬 ultrathin 단면 기술 너무 어려운 마스터 오랜 시간이 걸릴 것으로 간주 됩니다. 이 연구에서는 아무도 직렬 ultrathin 단면 어려움 없이 수행할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법을 개발 했습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고:이 연구에 사용 된 표본은 미생물, 액체 질소, 프로 판으로 급속 하 게 냉동 동결 2% 오스뮴 tetroxide, 포함 된 아세톤에 대체 및 에폭시 수 지1,2,3,에에서 포함 된 4,5,6,7,,89,10,11,12,13 ,,1415,,1617,18.

1. 지원 영화 (그림 1-3)의 준비

참고: 은색 Formvar 지원 영화 캐스팅에 유리 방법19를 사용 하 여 준비가 되어 있습니다.

  1. 100 mL 1.5%의 추가 Formvar Formvar 만드는 장치 (그림 1)을 에틸렌 dichloride에. 공기 고무 공19를 사용 하 여 'a'를 통해 솔루션을 눌러 유리 슬라이드 (76 m m 26 m m x 1.3 m m x) 기구의 상단 열에서 Formvar 솔루션에서의 절반을 찍어.
    1. 3-방법으로 자 지를 열고 공기 압력을 줄이기 위해 'b'를 발표 하 여 열에서 솔루션을 배출. 유리 슬라이드 표면에 필름 형태의 유리 슬라이드와 공기에서 건조 장치에서 꺼내 주세요. 백열 램프를 사용 하 여 Formvar 영화의 건조를 가속.
  2. 영화 (그림 2a), 면도날으로 유리 슬라이드에 4 개의 가장자리에서 근 근이, 슬라이드20에서 영화의 분리를 촉진 하기 위해 슬라이드에 호흡으로 유리 슬라이드를 immersing 하 여 물에 영화에서 부동 하는 후에 물이 천천히 낮은 수평 각도 (약 10 °, 그림 2b).
  3. 구멍 (지름 4 mm) 알루미늄 랙 (25 m m x 3 m m x 30)를 사용 하 여 물에서 Formvar 영화 올리다 (그림 3a). 사용 (그림 3b)까지 한 desiccator Formvar 영화와 함께 랙 유지.

2. 초음파 트리밍 블레이드와 면도날 21 stereomicroscope (그림 4)에서 표본 블록 트리밍

  1. 셀 블록의 표면에는 블록의 끝 (그림 4a) 가벼운 현미경으로 관찰 하 여 다는 것을 확인 하십시오.
  2. 척 (블록 홀더), 표본 블록을 탑재 하 고 트리밍 단계21 (그림 4b)에 물림 쇠를 탑재. 이 트리밍 단계는 표본 뒤쪽에서 조명 메커니즘이 있습니다.
  3. 0.7 m m x 1.0 m m (그림 4, 5)의 크기에 블록을 잘라. 에폭시 수 지 매우 하드 이기 때문에, 먼저 초음파 트리밍 블레이드를 사용 하 여 블록을 잘라. 초음파 트리밍 블레이드는 새로 도입된 된 기계 이며 블록 쉽게 잘립니다. 다음에 면도날으로 더 블록 트림. (참조 그림 5 d, 그림 8) 절단의 방향을 표시 한 어깨를 잘라.

3. 톰 (그림 5)를 사용 하 여 다이아몬드 칼으로 표본 블록 트리밍

  1. ultramicrotome의 견본 홀더 척 견본 블록 설정 합니다. 장소는 표본 90도 시계 반대 방향으로 직렬 ultrathin 단면 때 실제 위치에 대 한 수행 (참조 그림 5 d).
  2. 다이아몬드 트리밍 나이프 (참조 그림 5 d)와 블록의 표면을 잘라. 다이아몬드 칼 날 견본 블록 얼굴에 평행 하 게 설정 하 고 어떤 견본 (그림 5 d)을 잃을 수 없습니다 견본 표면의 최소 금액을 잘라.
    참고:이 단계 표본 표면을 매끄럽게 수행 됩니다. 슬림 부분의 견본 표면의 일부는 그대로 (따라서이 부분은 아니라 처럼 빛나는 거울, 그림 5 d), 직렬 단면에 대 한 표본의 일부를 잃을 수 없습니다. 이것은 표본 블록의 표면에 노출 되어 있기 때문 에입니다.
  3. 표본 블록 (그림 5c)의 절단을 모니터링 하는 데 칼 스테이지의 거울 (메사 컷, M)를 배치 합니다.
  4. 잘라 칼 무대 왼쪽 (그림 5a)에 30 ° 회전 하 여 트리밍 나이프를 사용 하 여 블록의 왼쪽된 가장자리 (이것은 상단에, 그림 5 d, 직렬 단면에 샘플의 된다).
  5. 칼 무대 오른쪽 (그림 5b)에 30 ° 회전 하 여 표본 (이 됩니다 직렬 단면, 그림 5 d에 견본의 더 낮은 측)의 왼쪽된 가장자리에서 약 100 µ m에서 블록 얼굴을 잘라.
    참고: 직렬 섹션은 약 90의 견본의 슬림 부분에서 삭감 될 것 이다 nm 크기에서 약 1 m m x. 큰 부분은 평행 되도록 견본 표면 및 칼 날을 조정 하기 위해 사용 됩니다. 칼 날에 평행 되도록 견본 표면 조정 후 큰 부분 면도날으로 제거 됩니다. 톰을 사용 하 여 견본의 상단 및 하단 측면을 절단 하 여 표본 양쪽 모두 될 원활 하 고 정확 하 게 서로 평행 하 게 (그림 5 d)는 직선과 끊어지지 리본 섹션을 얻을 필요가 있다.

4. 조정 견본 표면 및 칼 가장자리를 서로 21 병렬 마주

  1. 트리밍 나이프를 제거 하 고 표본 블록 시계 방향으로 90 ° 회전.
  2. 칼 단계로 ultrathin 단면 나이프를 설정 합니다.
  3. 서로 견본 표면의 큰 부분을 사용 하 여 병렬 마주 견본 표면 및 칼 날을 조정 합니다.
    참고: 큰 표본 부분의 사용 됩니다 조정 직렬 단면 절단 얼굴 너무 작습니다, 어렵게 견본 표면 및 칼 지만,이 부분을 사용 하 여 수직 방향에 특히 조정 때문에. 따라서, 표본의 큰 부분을 사용 하 여 쉽게 조정 합니다.

5. 견본 블록 (그림 6)에 네오프렌 솔루션 확산

  1. 원래 위치와 정확히 같은 위치에 견본 척을 배치 하는 척 척 홀더는 톰의에 테이프를 적용 하 고 경계 (그림 6a)에서 잘라.
  2. 톰에서 표본 척 밖으로 하 고 stereomicroscope (그림 6b)에서 그것을 배치. 면도날으로 견본의 큰 부분을 잘라, 슬림 부분 직렬 섹션에서 떠나는 것입니다 얻을 수 있습니다.
  3. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여, 섹션 측 접착제 있도록 직렬 단면에 사용할 표본에 약 1 µ L 0.5 %neoprene 솔루션 (그림 6b) 드롭. 커버 neoprene 솔루션 전체 표본. 필터 종이 시료 근처에 배치와 함께 과잉 neoprene 솔루션을 즉시 흡수. 섹션의 리본을 얻기 직렬 셀 섹션의 사진 촬영을 위한 필수적 이며 neoprene 접착제 섹션을 함께 튀어나와 매우 유용.
  4. 준비 3-슬릿 격자 (슬릿의 크기: 중간, 0.4 m m x 2.2 m m, 모두 양쪽 0.2 m m x 2.2 m m) (그림 6c) 60 ° 격자의 핸들 여 직렬 섹션을 따기 위한 치료 0.5 %neoprene 솔루션, 격자 및 격자에 의해 친수성 만들기 글로우 방전22.

6. 직렬 섹션 (그림 7-9)

  1. 장소 견본 블록 녹화 부분을 정렬 하 여 5.1 (그림 6a)와 같은 위치에서 톰에 다시 척. 이 블록 얼굴과 칼 날 완벽 하 게 서로 평행 하 게 유지합니다. 다음에 견본에 가까운 칼가지고.
  2. 물으로 칼 보트를 채우십시오.
  3. 공기 (그림 7)를 방지 하기 위해 플라스틱 커버는 톰을 커버.
    참고: 공기 ultrathin 단면화 및 섹션의 자주 검색 하는 동안 문제가 발생할. 플라스틱 덮개는 3 개의 구멍: 한 구멍 쌍 안 렌즈 이며 다른 두 구멍 덮개에 사용 하는 동안 작업을 허용 하도록 무기에 대 한. 나무 팔걸이 격자와 직렬 섹션을 검색 하는 등 섬세 한 작업을 하 고 있는 동안 무기를 배치 하는 데 사용 됩니다. 나무 팔걸이 톰 연산자의 손의 진동 전송 수 없습니다 톰 테이블 (그림 7, 화살표), 다른 테이블에 배치 됩니다.
  4. 200 nm 섹션 두께 (그림 8)에 시료를 절단 시작 합니다. 200 nm 두께 시료의 표면에 칼을 데 려에 시간을 절약할 것 이다.
  5. 첫 번째 섹션을 잘라 후 설정 섹션 두께 70 nm (그림 8).
  6. 직렬 섹션의 수에 (정확 하 게 말하기, 약 1.8 m m; 섹션의 수에 따라 섹션의 폭의 리본에 도달 후) 20를 도달 하는 경우, 설정 섹션 두께 10 nm (그림 8)을 계속 하는 동안.
    참고: 이후는 톰 10 nm 두꺼운 섹션을 잘라낼 수 없는, 아니 새로운 섹션 나타나고 이전 컷된 섹션에서 칼 날 분리 되. 그것은 머리 가닥의 쌍을 사용 하 여 수동으로 섹션 구분에 어려움을 피하기 위해 직렬 섹션을 따기 위한 분리 된 섹션 그룹 (그림 9)를 얻는 것이 중요. 전송 전자 현미경에서 시야 2.0 m m 이므로, 섹션에서 가장 긴 1.8 m m 이어야 한다.
  7. 설정 섹션 두께 60 nm (그림 8). 이 기계는 이전 10 nm 두께 추가 합니다 때문에 70 nm 섹션 (그림 8)을 생산할 예정 이다.
  8. 섹션 두께 70 다시 설정 nm (그림 8) 절단 1.8 m m 긴 섹션 얻을 때까지 계속.
  9. 6.6-6.8를 반복 하 여 1.8 m m 긴 섹션 5 (그림 9) 얻을 수 있습니다. 우리가 일반적으로 이후 5 견본 홀더 전송 전자 현미경에서 우리의 실험실에서 사용할 수 있지만 5도 아니다 5 섹션 그룹을 확인 합니다.

7. 직렬 섹션 (그림 10-12)를 따기

  1. '루프 섹션 지주'23 장소 (루프의 내부 직경: 5.0 m m) (그림 10a)에 세 번째 섹션 그룹 (그림 10b).
    참고: 그것은 적절 한 순서로 사진을 찍을 그들의 단면 순서 섹션을 검색 하는 데 필요한입니다. 그러나 칼 보트에 5 섹션 그룹 이후, 그것은 종종 되 면 혼동 그룹은. 세 번째 그룹에는 루프를 두어서, 그것은 분명해 연산자 가까이 두 그룹은 첫 번째 및 두 번째, 그리고 연산자에서 먼 2는 네 번째 및 다섯 번째 그룹 (그림 10b). 이 순서를 혼합 되지 것입니다.
  2. '물 표면 높이 루프'23 장소 (WSRL, 루프의 내부 직경: 4.0 m m) (그림 11a) 칼 스테이지 (그림 11b). WSRL 하단에 자석으로 되어 있기 때문에 칼 무대에 굳게 설 것 이다.
    1. 그것의 축과 핸들을 이동 하 여 직렬 섹션 바로 위에 WSRL의 루프를 배치 합니다. 낮은 물 표면에 WSRL의 루프는 루프 encircles 섹션.
    2. 물 표면 표면 장력 (그림 11 c-d)에 의해 발생 합니다 있도록 나사를 아래쪽으로 선회 하 여 루프를 아래로 누릅니다. 섹션 루프의 중심을 이동, 물의 꼭대기에 위치 하 고 머리 가닥21을 사용 하 여 섹션의 방향을 조정 합니다.
    3. 벌 거 벗은 슬릿-그리드, 핀셋에 의해 개최 되 고 (그림 11 d) 물 표면에 평행 하 게 유지 하는 그것을 만져 섹션 그룹을 선택 합니다. 그것은 섹션 그리드를 먼저 터치 하는 물, 격자 (그림 11 d)의 중앙에 정확 하 게 섹션을 배치 하는 것이 중요.
  3. 물 작은 방울과 함께 섹션 격자를 Formvar 지원 영화16 (그림 12)에 놓고 필터 종이 사용 하 여 초과 물을 제거 합니다.
    참고: 지원 영화의 주름 때 종종 문제가 섹션 선택 사용 하 여 그리드 지원 영화 막 (섹션) 막 (지원 영화)를 직접 접촉 하기 때문에. 지원 영화에 주름을 지 고의 문제는 Formvar 지원 영화16에 물 작은 방울과 함께 섹션 베어링 그리드를 배치 하 여 크게 감소 된다.

8. 얼룩 섹션16,24 (그림 13)

  1. 섹션은 완전히 건조 후 격자, 주위에서 Formvar 영화 눈물 고 섹션 베어링 격자를 제거 합니다.
  2. (그림 13), 적절 한 순서로 얼룩 튜브16 의 홈에 격자를 설정 하 고 얼룩 uranyl 아세테이트 및 리드 시트르산24섹션.
    참고: 저기 홈 깊이 0.6 m m 튜브의 긴 축을 따라 면도날으로 잘라. 튜브는 격자의 직접 처리 얼룩 및 세탁기 과정16동안 필요 하지 않습니다 이후 핀셋를 사용 하는 경우 지원 영화의 실수로 파손을 방지 하기 위한 유용 합니다.

9. 직렬 섹션 (그림 14)의 관찰

  1. 방향을 견본 홀더 축에 수직 그리드 슬릿의 긴 축에 적절 한 순서로 (그림 14a), 멀티 견본 홀더 5 격자를 설정 합니다. 격자의 핸들 (화살촉) 할 필요가 없습니다 수 컷, ' 그리드 설치 ' 핸들 건드리지 않을 때문에.
  2. ' 그리드-설치 ' (그림 14b)와 격자를 해결 하 고 전송 전자 현미경 견본 홀더를 삽입.
    참고: 그것은 종종 목표 셀의 사진을 복용 하기 전에 모든 셀 섹션 (그림 15) 좋은 조건 좋은 고정과 오염 없이 재미 있는 미생물 또는 세포를 찾을 수의 낮은 확대 이미지를 유용 합니다.
  3. 높은 확대에 모든 셀 섹션에 대상 셀의 사진을 찍을.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에서는 3-슬릿 격자 직렬 섹션을 따기 위해 사용 되었다. 격자는 니켈 이나 구리의 만들어집니다. 직렬 섹션 중간 슬릿에 배치 됩니다. 양쪽에 슬릿 그리드와 그들을 따기 때 섹션을 볼 필요가 있습니다. 핀셋 (그림 11 d)으로 그들을 따기 때 격자를 직렬 섹션으로 병렬 계속 핸들 굽습니다 (그림 6 c, 오른쪽). 작은 핸들은 섹션을 따기에 심각한 문제가 발생, 그리드의 주요 부분의 굽 힘을 방지 하 고 얼룩 동안 섹션을 삭제 방지 하기 위해 유리 하다. 이 그리드는 기존의 2.0 m m x 1.0 m m 단일 구멍 격자에 이점이 있다. 즉, 섹션 2 개의 금속 바 0.4 m m 간격에 의해 직접 지원 됩니다 (1.0 m m 보다 좁은)와 섹션 지원 영화 기존의 단일 구멍에 의해서만 지원 됩니다 3-슬릿 격자에서 Formvar 지원 영화. 표본 드리프트...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시 된 방법을 비싼 장비를 요구 한다. 그것은 필요로 한 알루미늄 랙 (그림 3), 3-슬릿 격자 (그림 6c), 섹션 지주 루프 (그림 10a), 루프 물 표면 높이 (그림 11a), 및 얼룩 튜브 (그림 13). 현재 방법의 많은 기능을 확인 하 고 있습니다. 시료의 큰 부분 그들은 얼굴을 서로 병렬 견본 표면 및 칼 가장자리를 조정 하는 데 사용 됩니다. 직렬 섹션을 슬릿 격자에 직렬 섹션의 그룹을 검색할 때 머리 가닥의 쌍을 사용 하 여 분리 섹션에서 어려움을 피하기 위해 그룹에서 잘립니다. '섹션 지주 루프' 섹션 그룹의 순서를 혼합 하지 않도록 하는 데 사용 됩니다. '물 표면 높이 루프' 섹션의 꼭대기에 위치 하 고는 그들은 터치 그리드 첫째,...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 진심으 그의 귀중 한 제안 및 토론을 위한 시게오 기타 감사합니다. 우리 또한 그들의 중요 한 독서의 원고에 대 한 존과 스미 레 크 스 테 인을 감사합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Formvar 제조 장치Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo652W 180 x D 180 x H 300 mm
유리 슬라이드Matsunami Co. Ltd.,Osaka-76x 26 x 1.3 mm
알루미늄 랙 4mm 구멍Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo658W 30 x D 25 x H 3 mm, 이 논문을 참조
NikonCo. Ltd., 도쿄-SMZ 645
LED 조명 실체 현미경니콘 (주), 도쿄-SM-LW 61 지
트리밍 스테이지Sunmag Co.Ltd., 도쿄-틸팅 메커니즘 장착,
트리밍 스테이지 용 LED 조명Sunmag Co.Ltd., 도쿄-초음파
트리밍 블레이드Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo5240EM-240,
Diatome Co. Ltd.,Switzerland-45°를 트리밍하기 위해 이 종이 다이아몬드 나이프
초박형 절편용 다이아몬드 나이프Diatome Co. Ltd.,Switzerland-45°
초박박극Leica Microsystems,Vienna-UltracutS
Mesa cutLeica Microsystems,Vienna-Mirror
0.5% 네오프렌 W 솔루션Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo605
Special 3-slit nickel gridNisshin EM Co. Ltd., Tokyo2458paper
Special 3-slit copper gridNisshin EM Co. Ltd., Tokyo2459to this paper
유지 루프Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo526Refer to
this paper Water-surface-raising loopNisshin EM Co. Ltd., Tokyo527
Refer to this paper staining tubeNisshin EM Co. Ltd., Tokyo463Refer
this paper Multi-specimen holderJEOL Co. Ltd., Tokyo-EM-11170
JEM-1400JEOL Co. Ltd., 도쿄-투과 전자 현미경
를 참조하십시오. Refer to this Refer 단면 to

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).
  2. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).
  3. Yamaguchi, M. Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy. Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).
  4. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).
  5. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells. J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).
  6. Yamaguchi, M. Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).
  7. Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).
  8. Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).
  9. Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66, 283-294 (2017).
  10. Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS ONE. 10, e0117109(2015).
  11. Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65, 363-369 (2016).
  12. Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).
  13. Yamaguchi, M. Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea. Cytologia. 78, 333-334 (2013).
  14. Yamaguchi, M., Worman, C. O. Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell. Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).
  15. Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).
  16. Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).
  17. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).
  18. Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans. mBio. 4, e00614-e00613 (2013).
  19. Yamaguchi, M., Adachi, K. Specimen support. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 52-57 (2011).
  20. Hayat, M. A. Support films. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 4th ed, Cambridge, Univ. Press. Cambridge, United Kingdom. 216(2000).
  21. Yamaguchi, M., Kita, S. Ultrathin sectioning. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 40-52 (2011).
  22. Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65, 444-450 (2016).
  23. Kita, S. Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools. Kenbikyo. 46, in Japanese 253-257 (2011).
  24. Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).
  25. Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions. Microsc. Microanal. 12, Suppl . 2. 86-87 (2006).
  26. Hildebrand, D. G. C., et al. Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish. Nature. 545, 345-349 (2017).
  27. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329(2004).
  28. Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

Serial Ultrathin SectionsTransmission Electron MicroscopyMicroorganism SpecimenSection Holding LoopWater Surface Raising LoopFormvar Support FilmUltramicrotome TechniqueDiamond Knife TrimmingNeoprene Solution ApplicationGrid Section Retrieval

관련 논문