미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 분석 결과 및 캘리포니아2 +-미토 콘 드 리아 붓기 분석 결과 발생

요약

이 프로토콜 Ca^{2 +} 보존 용량 및 캘리포니아^{2 +}검사 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로-트리거 SH-SY5Y의 고립 된 미토 콘 드리 아의 붓기 미토 콘 드리 아 세포 단계.

초록

산화 인 산화에 의해 ATP의 생산은 미토 콘 드리 아의 주 기능은 이다. 더 높은 진핵생물의 미토 콘 드리 아도 참여할 cytosolic 캘리포니아^{2 +} 버퍼링, 그리고 미토 콘 드리 아에서 ATP 생산 intramitochondrial 무료 캘리포니아^{2 +} 농도 의해 중재 될 수 있다. 캘리포니아^{2 +} 보존 용량 미토 콘 드 리아 매트릭스에 칼슘을 유지 하는 미토 콘 드리 아의 기능으로 간주 될 수 있습니다. 축적 된 세포내 캘리포니아^{2 +} 리드 안 미토 콘 드리 아 막의 침투성을 미토 콘 드리 아 침투성 전환 기 공 (mPTP)는 분자와 분자의 유출에는 리드 무게 1.5 kDa의 개통 되 나. 캘리포니아^{2 +}-트리거 미토 콘 드리 아 붓기 mPTP 개방을 나타내는 데 사용 됩니다. 여기, 우리가 설명 하는 Ca^{2 +} 보존 용량 및 캘리포니아^{2 +}검사를 두 분석-고립 된 미토 콘 드리 아에서 미토 콘 드리 아 붓기를 트리거. 특정 양의 캘리포니아^{2 +} 추가 후 모든 단계는 하루에 완료 고 microplate 리더에 의해 기록 될 수 있습니다. 따라서,이 두 가지 간단 하 고 효과적인 분석 평가 Ca^{2 +}채택 될 수-미토 콘 드 리아 기능 관련.

서론

미토 콘 드리 아 ATP 산화 인 산화에 의해 포유류 세포에서 사용의 거의 95%를 생산 주요 세포 기관 이다. 그것은 그의 캘리포니아^{2 +} 미토 콘 드리 아에 의해 분리 된 micromolar 집중, ADP와 무기 인산 염의 존재를 사용할 수 있는 합성 ATP¹ADP phosphorylate 보고. Cytosolic 캘리포니아^{2 +} 의 농도 임계값 이상 되 면 미토 콘 드리 아 수 이해 캘리포니아^{2 +} 급속 하 게 경과 하 고 그것은 천천히. 따라서, 작동 미토 콘 드리 아 수 유입 증가 cytosolic 캘리포니아^{2 +}. 없는 산화 인 산화에 참여 하는 미토 콘 드 리아 Ca^{2 +} 또한 cytosolic 칼슘 신호에 참여 및 미토 콘 드리 아 내에는 mPTP의 개방을 유도 하 여 미토 콘 드 리아 apoptotic 메커니즘을 활성화 막². 그것은 널리 인정 되었습니다 세포내 캘리포니아^{2 +} 의 비정상적인 상승 mPTP³여 미토 콘 드리 아 대규모 붓기를 일으킬 수 있다. 따라서,이 프로토콜 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 보존 용량 및 캘리포니아^{2 +}측정 하 여 미토 콘 드리 아 기능을 평가 하는 것을 목표로-유혹 trigged 미토 콘 드 리아 붓기.

캘리포니아^{2 +} 보존 용량 글귀 cytosolic 칼슘을 미토 콘 드리 아의 능력의 측정입니다. 미토 콘 드리 아 무료 cytosolic 칼슘을 버퍼링 하 고 비활성 침전의 형태로 칼슘 통풍 관에 의해 칼슘-의존 세포질 과정을 조절 수 있습니다. 장애인된 캘리포니아^{2 +} 보존 용량 에너지 제한 및 심지어 neurodegenerative 질병^4,5와 관련 된 스트레스 현상에서 발생 합니다. 고립 된 미토 콘 드리 아 또는 셀 digitonin permeabilized Ca^{2 +} 보존 용량, 식별 하는 데 수 고 축적 캘리포니아^{2 +} 추가 조미료와 malate 고립 된 미토 콘 드리 아에 의해 상승 된 능력에 의해 영향을 받지는 합니다 미토 콘 드리 아 격리 절차⁶. 적정 한 양의 digitonin 플라즈마 막 종류의 다른 세포를 permeabilize를 사용 해야 합니다. 캘리포니아^{2 +}의 hexapotassium 소금-녹색 형광 염료, 캘리포니아^{2 +}바인딩-민감한 셀 impermeant 표시 빛 고르기 표시기, 널리⁷되었습니다. 캘리포니아^{2 +}-(5 분) stimulations⁸연장 바인딩 녹색 형광 성 염료는 낮은 선호도 표시기 이며 무료 세포내 캘리포니아^{2 +} 농도 동안 상승 계속 표시 하는 데 사용. 이 방법은 방사성 필터 기법 보다 덜 민감한 하지만 매우 간단 하 게 했다. 추가 Ca^{2 +} 칼슘 녹색 형광을 끌어올리고 고 미토 콘 드리 아에 의해 Ca^{2 +} 통풍 관 기준선에 형광을 반환 합니다. 캘리포니아^{2 +} 의 순차적 추가 mitochondria 통풍 관 extramitochondrial Ca^{2 + 9}실패까지 했다. 형광 microplate 리더는 지속적으로 칼슘 녹색 형광을 보고 사용할 수 있습니다.

캘리포니아^{2 +} 축적, 후 미토 콘 드리 아 depolarized, 캘리포니아^{2 +} , 매체에 발표 고 팽창 하기 시작 했다. 캘리포니아^{2 +}-트리거 미토 콘 드리 아 붓기 mPTP 개방을 나타내는 데 사용 됩니다. 전자 현미경 및 측정 캘리포니아^{2 +}데 540 nm 수에 빛 흡 광도 감소-미토 콘 드 리아 붓기^10,11을 실행. 앞으로 각 산란¹², 흡수도 감소 미토 콘 드 리아 매트릭스의 수동 붓기를 반영 미토 콘 드리 아 볼륨을 직접 확인할 수 있습니다.

여기, 우리는 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 보존 용량 및 캘리포니아^{2 +}검사 방법론 설명-SH-SY5Y 세포에서 고립 된 미토 콘 드리 아에서 미토 콘 드리 아 붓기를 트리거.

프로토콜

1입니다. 미토 콘 드리 아의 격리

참고: 모든 솔루션 및 장비 0-4 ° C에 precooled와 있어야 얼음에 보관 합니다.

1. 10 cm 세포 배양 접시 당 종자 약 3 x 10⁶ SH SY5Y 셀. 높은 포도 당 Dulbecco에 문화 세포의 10% 태아 둔감 한 혈 청, 페니실린 (100 U/mL)와 글 중간을 수정-스 (100 µ g/mL). 밤새 5% CO₂ 를 포함 하는 인큐베이터에서 37 ° C에서 유지 합니다.
   참고: 10⁷ SH SY5Y 셀 x 적어도 1-2 각 격리 분석 결과 대 한 필요.
2. 매체를 제거 하 고 세척 약 1 mL 10 cm 세포 배양 접시에 얼음 차가운 PBS의 셀 3 번.
3. 10 cm 세포 배양 접시에 얼음 차가운 PBS의 새로운 1 mL을 추가 하 고 새로운 1.5 mL 튜브에 부착 세포를 긁어. 4 ° c.에서 10 분 동안 800 x g에서 원심 분리기
4. 원심 분리, 동안 5 mL 미토 콘 드 리아 절연 버퍼 (250 m m 자당, 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethanesulfonic 산), 10mm KCl, 1.5 m m MgCl₂, 1 mM EDTA) protease 억제제 주식의 50 μ 보완 준비 솔루션 (100 x 농도; 1 EDTA 무료 태블릿 ddH₂O의 500 µ L에 용 해).
5. 상쾌한을 제거 하 고 미토 콘 드리 아 절연 버퍼의 1 mL와 펠 릿을 resuspend. 30 분 동안 얼음에 1.5 mL 튜브를 품 어.
6. Lyse 유리 균질 화기 (15-25 선)와 일시 중단 된 셀 아래로 수동으로 얼음에.
   참고: 저기 없는 거품 세포 무 균 다는 것을 확인 하십시오. 현미경에 의해 그대로 셀과 드러난된 핵을 시각적으로 계산 하 고 확인 > 90% 셀 파손 발생 했습니다.
7. 1.5 mL 튜브 및 (핵 및 나머지 그대로 셀) 파편을 제거 하 4 ° C에서 5 분 동안 1000 x g에서 원심 분리기에는 homogenate를 전송 합니다.
8. 새로운 1.5 mL 튜브를 5 분 동안 1000 x g에서 원심 분리기에는 상쾌한 전송 4 ° c.
9. 새로운 튜브와 15 분 동안 14000 x g에서 원심 분리기에는 상쾌한 전송 4 ° c.
10. 상쾌한을 제거 하 고 미토 콘 드리 아 절연 버퍼의 1 mL와 함께 미토 콘 드리 아를 포함 하는 펠 릿을 resuspend.
11. 침전은 미토 콘 드리 아를 14000 x g 4 ° C에서 15 분에 대 한 솔루션을 원심.
12. 결과 미토 콘 드리 아 펠 릿 얼음에 보관 되어야 하며 50-100 μ KCl 미디어 (125 m KCl m, 2 m m K₂HPO₄1 m m MgCl₂, 20 mM HEPES, 5mm 조미료, 5mm malate, 및 2 μ M로 테 논, pH 7.4) 어떤 엉덩이 전에 펠 릿 볼륨에 따라 resuspended 불안.
13. 미토 콘 드 리아 솔루션의 5 μ를 사용 하 여 표준 BCA 분석 결과, OD562를 측정 하 여 미토 콘 드리 아 단백질 농도 측정 하는 플레이트 리더¹³를 사용 하 여.

2. 미토 콘 드리 아 캘리포니아^{2 +} 보존 용량 결정

1. KCl 미디어를 준비 하 고 추가 Ca^{2 +}-실험 전에 0.5 μ M의 최종 농도에 녹색 형광 염료를 바인딩.
2. 고립 된 미토 콘 드리 아 (0.4 mg/mL)에 포함 된 0.5 μ M Ca^{2 +}KCl 미디어의 1 mL를 전송-각 6 잘 플레이트에 녹색 형광 염료를 잘 바인딩.
3. 품 어는 미토 콘 드리 아 및 캘리포니아^{2 +}-20 mM CaCl₂ 솔루션 (20 m m CaCl₂, 127 m m KCl, 1 mM MgCl₂ 의 1 분 추가 4 μ aliquots에 대 한 주위 빛에서 보호 하는 실 온에서 6 잘 플레이트에서 녹색 형광 염료를 바인딩 20 mM HEPES, 5mm 조미료, 5mm malate, pH 7.4) 각 6-잘 접시에 잘 사용 하 여 자동 분배 200 nmol Ca^{2 +}/mg 미토 콘 드리 아 단백질을 소개 하는 설정.
4. 모든 3 형광 변화를 모니터링 하는 형광 분석기 사용 506의 여기 파장을 2 분에 대 한 s 및 531의 방출 파장 nm. 접시 3 600 rpm에서 떨고 갖춘 소프트웨어 (그림 1)에 의해 제어 신호 사이 s.
5. 각 영역 20 mM CaCl₂ 솔루션의 추가 4 μ 약 수를 추가 하 고 모든 3 형광 변화를 모니터링 형광 시간 증가 될 때까지이 단계를 반복 하는 2 분에 대 한 s.
   참고: 미토 콘 드리 아와 추가 Ca^{2 +} 증가 기록 형광으로 표시도 전했다. mPTP가 열리면 형광 시간이 증가 합니다.
6. 캘리포니아^{2 +} 는 mPTP Ca^{2 +} 보존 용량으로 열릴 때까지 추가의 총 금액을 해석 합니다.

3. 결정의 캘리포니아 ^{2 +}-미토 콘 드 리아 붓기를 유발

1. 실험 전에 KCl 미디어를 준비 합니다.
   1. 잘 각 6 잘 플레이트에 KCl 미디어에서 고립 된 미토 콘 드리 아 (0.4 mg/mL)의 1 mL를 전송.
2. 미토 콘 드 리아 붓기 하 미토 콘 드리 아 단백질으로 10 μ의 20mm CaCl₂ 수성 해결책 (500 nmol/mg 미토 콘 드리 아 단백질)를 추가 합니다.
3. 540에 흡 광도 감소를 기록 nm 매 3 10 분 (그림 2)에 대 한 소프트웨어에 의해 제어 microplate 리더에 s. 형광 변화 미토 콘 드리 아 내 막에 걸쳐 용액의 유입에 의해 발생 합니다.
   참고: 540에서 감소 흡 광도 nm 부 미토 콘 드리 아에 해당. 독자 흡 광도 감소 관찰 되지 않는 경우는 더 긴 간격 읽거나 독서 시간을 채택 수 있습니다.

결과

캘리포니아^{2 +} 보존 용량의 대표 결과:
결과 형광 값으로 표현 되었다. 캘리포니아^{2 +} (200 nmols/mg 미토 콘 드리 아 단백질)의 더블 mPTP 오프닝 베이스 위에 증가 하는 형광의 추가 펄스와. 5 μ M Bongkrekate (BKA), 캘리포니아^{2 +}의 억제제-mPTP 개방, 또는 1 μ M atractyloside (ATR), 캘리포니아^{2 +}의 활성 유도-mPTP 개방을 유도, 고립 된 미토 콘 드리 아에 추가 되었다. 양의 총 추가 Ca^{2 +} mPTP 개방 기준 형광 위에 이중 증가 의해 표시 될 때까지 캘리포니아^{2 +} 보존 용량으로 해석 되었다. 우리의 데이터는 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 보존 용량 BKA 치료에 ATR 그룹에서 보다 훨씬 높은 것 나타났다. 이러한 데이터는 미토 콘 ...

토론

여기, 우리는 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 보존 용량 분석 결과 및 캘리포니아^{2 +}에 대 한 간단 하 고 효과적인 프로토콜을 설명-미토 콘 드 리아 붓기 분석 결과 유발.

미토 콘 드리 아 격리에 대 한 모든 자료와 튜브는 얼음, 특히 때 세포 조직 확인 하십시오. 37 ° c.에 5 분 동안 접시에서 세포를 분리 하 0.25% trypsin EDTA는 사용할 수 있습니다. 후에 15-25 선, 그것은 그대로 세포 막 현미경을 관찰 하 고 미토 콘 드리 아 막의 파손을 방지 하는 데 필요한. 그러나, 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아 원유 미토 콘 드리 아 및 순화 된 미토 콘 드리 아 1.0 M 통해 얻어질 수 있다 / 1.5M 불연속 자당 기온 변화도. 살아있는 세포에서 미토 콘 드리 아의 생물 학적 특성은 미토 콘 드리 아를 포위 하는 중간 구성 요소의 농도 때문에 그 비보에 보다 고립 된 미토 콘 드리 아에 같은...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SH-SY5Y 세포주	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC 번호: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
글루타메이트	, 시그마-알드리치	, RES5063G-A7
말레이트	, 시그마-알드리치	46940-U
로테논	, 시그마-알드리치	R8875
HEPES,	시그마-알드리치	H3375
MgCl2	시그마-알드리치	00457
K2HPO4	시그마-알드리치	V900050
KCl	시그마-알드리치	P9541
CaCl2	시그마-알드리치	V900266
바리오스칸 플래시 기기	Thermo Scientific	IC100E
봉크레케이트	바이오비전	1820-100
아트랙틸로사이드	시그마-알드리치	C4992
고포도당 둘베코' s 변형 이글 배지	Hyclone	SH30022	4.5 g/L 포도당, L-글루타민, 피루브산 나트륨 없이
태아 소 혈청	Hyclone	SV30087
페니실린	Sigma-Aldrich	P3032
스트렙토마이신	Invitrogen	11860-038
BCA 분석 키트	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10cm 세포 배양 접시	NEST	704001