TIP60의 과도 한 소모 후 유 방 상피 세포 이동의 라이브 영상

요약

여기, TIP60 소진 MCF10A 유 방 상피 세포를 사용 하 여 상처 치유 분석 결과에서 셀 이동의 실시간 모니터링 하는 것이 선물이. 라이브 세포 이미징 기술 우리의 프로토콜의 구현 분석 하 고 실시간으로 단일 셀 운동 시간을 시각화 수 있습니다.

초록

상처 치유 분석 결과 효율적인 셀 마이그레이션 시험관을 공부 하는 가장 경제적인 방법 중 하나. 전통적으로, 이미지는 시작과 단계 대조 현미경을 사용 하 여 실험의 끝에 고 셀의 마이그레이션 능력 상처의 폐쇄에 의해 평가 됩니다. 그러나, 셀 이동은 동적 현상, 그리고 종래의 방법 단일 셀 이동 추적에 대 한 허용 하지 않습니다. 현재 상처 치유 분석 실험에 개선 하기 위해, 우리는 셀 마이그레이션 실시간으로 모니터링 하 라이브 세포 이미징 기술을 사용 합니다. 이 메서드는 셀 추적 시스템을 기반으로 셀 마이그레이션 속도 확인할 수 있습니다 하 고 셀 마이그레이션 및 세포 증식 사이 명확한 구별을 제공 합니다. 여기, 우리 TIP60의 존재에 의해 영향을 하는 유 방 상피 세포의 다른 마이그레이션 능력을 연구 분석 상처 치유에 라이브 셀 이미징의 사용을 보여 줍니다. 세포 운동 성 높은 동적으로, 우리의 메서드는 상처 치유의 상처 폐쇄 상처 치유 분석 실험에 사용 되는 전통적인 이미징 기술을 함께 찍은 스냅샷 보다 과정에 더 많은 통찰력을 제공 합니다.

서론

HIV Tat에 상호 작용 단백질 60 kDa (TIP60)은 히스톤과 비 히스톤 단백질^1,2acetylate 수 있는 lysine acetyltransferase 이다. 그것의 기능은 전사, DNA 손상 복구 및 apoptosis^1,3,,45,6, 를 포함 하 여 여러 신호 전달 경로에 영향을 찾을 수 있습니다. ^{7 , 8}. 또한, TIP60 자주 downregulated 암에 그 downregulation 암 전이 상관은 고 가난한 생존 요금^9,,1011,12, ^13,14. 종양 전이 암 관련 된 죽음의 주요 원인입니다. 그것은 다단계 과정 그리고 전이의 초기 단계는 마이그레이션 및 인접 조직을^15,16으로 종양 세포의 내 습을 포함 한다. 그렇게 하기 위해 종양 세포는 먼저 기본 종양 질량 총칭 침입 셀 시트의 모양에서 분리 해야 합니다 또는으로 단일 셀¹⁷분리. 이 과정 동안 종양 세포는 종종 엽 전환 (응급), 형태학 및 세포 접착 기능^17,18에 변화 결과로 상피 받을.

몇 가지 기법 연구는 마이그레이션 개발 되었습니다 그리고 종양의 내 습 능력 세포 생체 외에서. 그 중, 상처 치유 분석 결과 가장 효율적이 고 경제적인¹⁹이다. 첫째,이 방법은 마이그레이션할 및 간격 닫기 셀 되므로 셀 confluent 단층에 인공 갭의 창조를 포함 한다. 둘째, 시작 및 실험의 끝에 간격의 이미지를 캡처할 수 있습니다. 마지막으로, 간격 폐쇄의 비교는 세포 이동의 비율을 결정 하는 데 사용 됩니다. 단계 대조 현미경 일반적으로 기존의 상처 치유 분석 실험에 대 한 이미지를 캡처하는 데 사용 됩니다. 상처 치유 분석 결과의 또 다른 장점은 그것은 부분적으로 종양 세포 마이그레이션 vivo에서 유사한입니다. 유사 하 게 종양 전이 에 비보를 상처 치유 분석 실험에서 셀 마이그레이션 상피 시트의 집단 이주와 분리 된 단일 셀의 마이그레이션을 보여줍니다.

그러나, 셀 마이그레이션 동적, 알려져 있다 그리고 실시간으로 세포의 움직임을 문서화 하는 필요 있다. 예를 들어, 기존의 상처 치유 분석 결과 단일 셀 움직임을 분석 하는 연구원을 허용 하지 않습니다. 다른 한편으로, 상처 치유 분석 실험에 대 한 배양 세포 들은 세포 증식을 억제 하는 혈 청을 굶 어입니다. 이것은 세포 증식으로 인해 간격 폐쇄의 가능성을 배제 하기 위해 이루어집니다. 그럼에도 불구 하 고, 있을 것입니다 아직도 일부 확산 및 세포 죽음, 및 단계 실험은 그들을 구별 수 없습니다 전후를 찍은 이미지.

라이브 세포 이미징 기술을 기존의 상처 치유 분석의 이러한 제한을 해결합니다. 라이브 영상 현미경을 사용 하 여 CO₂ 배양 기 및 적절 한 온도 제어와 결합 하 여, 연구원은 간격 크기를 측정할 수 있으며 세포 적극적으로 마이그레이션의 움직임을 추적 하는 동안 시간이 지남에 폐쇄의 그것의 비율의 끝에는 침략 앞에. 따라서, 라이브 셀 이미징 셀 마이그레이션 모니터링 구현만 셀 이동의 더 나은 시각화를 제공 하지 않습니다 하지만 또한 셀 마이그레이션 및 세포 증식, 제공 하는 더 구별 가능성에 대 한 수 세포 이동의 신뢰할 수 있는 분석.

이 연구에서는 MCF10A 유 방 상피 세포 상처 치유 분석 결과 및 라이브 셀 이미징 셀 마이그레이션에 TIP60의 역할을 연구 하기의 조합을 설명 하기 위해 사용 되었다. TIP60의 소모 증가 마이그레이션 능력 MCF10A 세포에서 발생합니다.

프로토콜

1입니다. 준비

1. MCF10A 문화 매체를 준비: Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) F12 (1:1) 5% 혈 청, 20 ng/mL 상피 성장 인자, 0.5 mg/mL 날린, 100 ng/mL 콜레라 독 소, 그리고 10 µ g/mL 인슐린 승마 /.
2. 혈 청 무료 매체를 준비: DMEM/F12 (1:1)와 20 ng/mL 상피 성장 인자, 0.5 mg/mL 날린, 100 ng/mL 콜레라 독 소, 10 µ g/mL 인슐린.
3. SiRNA는 다음 순서를 사용 하 여:
   siControl:
   앞으로: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
   역: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
   siTIP60:
   앞으로: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
   역: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'
4. 10 cm 세포 문화 요리와 24-잘 접시를 사용 합니다.

2. TIP60를 사용 하 여 siRNA의 일시적인 고갈

1. 하루에 1, transfection 시 약 (예: Lipofectamine RNAiMAX)의 aliquot 15 µ L의 2 mL 혈 청 매체 (예를 들어, Opti 메모리) 감소와 각각 10 µ L의 각 siRNA (10 µ M 주식), 그들을 혼합.
2. 20 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어.
3. 1 x 10⁶ MCF10A 셀 10 cm 접시에 배양의 3 mL 함께 씨앗 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
4. 10 cm 접시에 siRNA 혼합물에 의해 드롭 추가 합니다.
5. 세포는 동일 하 게 37 ° C 배양 기에 그것을 올려 놓기 전에 배포 되도록 요리를 흔들어.
6. 후 보육의 6 h, 포함 하는 siRNA 매체를 8 mL 신선한 문화 매체의 바꿉니다.
7. 하루에 2, siRNA 혼합물의 다른 배치를 준비 하 고 20 분 동안 실내 온도에 그들을 품 어.
8. 1 일 추가 문화 매체의 8 mL을 aspirate 하 고 신선한 문화 매체의 3 mL와 함께 그것을 대체.
9. 요리에 의해 드롭 siRNA 혼합물의 두 번째 배치를 추가 합니다. 요리는 시 약은 완전히 인큐베이터에 그들을 올려 놓기 전에 혼합 되도록 흔들어.
10. 6 h 후 siRNA 포함 된 매체를 8 mL 신선한 문화 매체의 바꿉니다.

3. 씨 셀 상처 치유 분석 결과 대 한

1. 3 일에 매체를 삭제 하 고 셀 염 분 (PBS) 버퍼 인산 염 버퍼의 2 mL을 한 번 씻어. PBS 버퍼를 삭제 합니다.
2. 접시에 1 mL의 트립 신-EDTA 버퍼 x 1 추가 하 여 siControl 및 siTIP60 치료 세포를 trypsinize. 다시 20 분 동안 인큐베이터에에서 넣어.
3. 각 접시에 완전 한 문화 매체의 4 mL를 추가 하 고 셀 pipetting에 의해 resuspend 15 mL 튜브에 그들을 전송.
4. 5 분 동안 200 g에서 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다.
5. 다시 혈 청 자유로운 매체의 5 mL로 세포를 일시 중단 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀.
6. SiControl 및 siTIP60; 6 x 10⁵ 셀/mL의 세포 현 탁 액을 준비 잘 혼합 셀 인지 확인 합니다. 100 %confluency 위해 24-잘 접시의 한 잘에 세포 현 탁 액의 500 µ L를 추가 합니다. 5 ~ 6 우물 각각 siControl와 siTIP60에 대 한 씨앗
7. 부드럽게 앞뒤로 접시 그리고 사이드-투-사이드 분산 되도록 흔들어. 원형 모션을 하지 마십시오. 24 h에 대 한 인큐베이터에 접시를 남겨 주세요.
8. TIP60의 최저 효율 확인 나머지 셀을 수확. 이렇게 하려면 5 분 동안 200 g에서 나머지 세포 현 탁 액을 원심 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.
9. RNA는 상업적인 시 약을 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 분리 하 고 최저 효율을 평가 하는 실시간 양이 많은 PCR을 진행.

4. 상처를 만듭니다

1. 단계 대조 현미경 셀 완전히 장착 되었는지 확인 하려면 확인 하십시오. 세포는 현미경 관찰 (4 배, 10 배, 및 20 배 확대) 셀 셀 confluent 단층 형성 하고있다 연결 완벽 하 게 됩니다.
   참고: siControl 셀 일반적으로 siTIP60 셀 보다 더 나은 연결합니다. 이 때문에 TIP60의 소모 셀 더 엽 같은²⁰으로 예상 된다. 여기, 일반 벤치탑 화이트 빛 단계 대조 현미경 사용 됩니다.
2. 상처를 생성 하려면 부드럽게 200 µ L 피 펫 팁; 우물의 중앙에 걸쳐 직선을 긁어 생성 된 상처의 길이 우물의 직경으로 동일 합니다. 모든 나머지 우물에 대 한이 단계를 반복 합니다. 각 잘 새로운 피 펫 팁을 사용 합니다.
3. 부드럽게 씻어 5 번 잘 각 혈 청 무료 사용 하 여 분리 된 세포를 제거 하는 매체.
4. 각 잘 하 혈 청 자유로운 매체의 1 mL을 추가 하 고 라이브 셀 이미징에 진행.

5입니다. 라이브 셀 이미징의 설치

1. 현미경을 라이브 셀 이미징 챔버에서 온도 37 ° c.에 도달 하면 되도록 설정 하기 전에 적어도 1 시간을 제어 하는 온도
2. 라이브 셀 이미징 시작 하기 전에 이산화탄소 (CO₂) 가스 공급을 켜십시오. 5% CO₂ 농도 설정 합니다.
3. 현미경의 무대에서 24-잘 접시를 놓고 이미징에 대 한 10 배 확대와 대물 렌즈를 선택 합니다. 직접 카메라 대신 접 안경에 내보낸된 빛 고 상처와 주위 세포를 찾기 위해 초점을 조정 합니다.
   참고:이 경우에, 단계 대조와 흰색 빛 사용 되었다.
4. 라이브 셀 옵저버 시스템을 사용 하 여 각 잘에서 상처의 위치를 표시.
   참고: 라이브 셀 이미징 시스템의 자동화 된 단계는 여러 위치에서 이미지 수집에 대 한 수 있습니다. 이미지는 한 번 모든 간격 모든 표시 된 위치에 이동 됩니다.
5. 시간 조건 설정: 1 시간 간격 및 72 h 기간; 이 설정에 따라 시스템 것입니다 사진을 찍고 각 표시 된 위치에 72 h. 어떤 원하는 시간 간격 설정에 대 한 모든 시간과 모니터링 기간.
   참고: 여기, 기간 72 h는 최고의 이러한 셀 시작 후 72 h 혈 청 자유로운 매체에 죽어가 고 있기 때문에.

6. 단일 셀 이동 추적

1. 후에 72 h. JPEG 형식에서 이미지와 동영상을 AVI 형식에서으로 데이터를 내보낼 데이터를 내보냅니다.
   참고: 이것은 중요 ImageJ 소프트웨어만 AVI 형식의 동영상을 인식할 수 있기 때문 에입니다. SiTIP60 및 siControl 세포 사이 다른 셀 마이그레이션 속도 비디오에서 명확 하 게 관찰할 수 있습니다.
2. ImageJ 소프트웨어에 AVI 비디오를 엽니다.
3. MTrackJ 플러그인 (플러그인 해야 합니다 다운로드 및 설치 별도)를 열고: 플러그인 > MtrackJ.
4. MtrackJ 도구 모음에서 "추가" 탭을 클릭 하 여 비디오에서 선택 하는 단일 셀에 대 한 트랙을 추가 합니다. 침략의 끝에 셀 및 자체에 마이그레이션할 수 있는 셀을 선택 (단일 셀 마이그레이션). 비디오에서 선택한 셀의 움직임에 따라 하 고 그들을 추적 하는 것은 MtrackJ를 사용 하 여.
5. 도구 모음에서 "측정" 탭을 클릭 하 여 이동 거리를 측정 합니다.
   참고: 여기는 siControl에 거의 셀 단일 세포, siTIP60 세포의 많은 단일 세포로 이동 하는 반면 단일 셀 운동 측정 하기 어려운 만들기로 이동. 그러나, 침략 앞에 있는 세포의 움직임 수 여전히 추적 되며, siControl 및 siTIP60 셀에 계산.
6. 동영상 AVI 형식으로 트랙을 저장 합니다.

7입니다. 셀 마이그레이션 능력의 정량화

1. 정량화, 0 h 이미지와 "n" h, 여기서 "n" _는 timepoint 닫히면 siTIP60 또는 siControl 세포는 완전히 상처에서 이미지를 선택 합니다.
   참고: 여기, 48 h 선택 되었다, siTIP60 세포에 상처 거의 완전히 폐쇄 했다.
2. ImageJ는 다음 수식을 사용 하 여를 사용 하 여 백분율 마이그레이션 계량: (0 h-"n" h의 영역에서 상처의 지역) / 0 h x 100의 지역.

결과

일반 스키마의 라이브 셀 이미징 기반 셀 마이그레이션 분석 결과
그림 1A 는이 프로토콜의 스키마입니다. MCF10A 셀 siControl 전형적인 상피 형태를 보여와 페. TIP60의 고갈 후 MCF10A 셀 제어 셀 (그림 1B)에 비해 더 엽 했다.

TIP60 때 려 눕 힘 효율성의 시험
그림 2 는 TIP60 최저 효율을 보여준다. TIP60 식 수준 siTIP60 치료 후 크게 감소. TIP60, 뿐만 아니라 여러 셀 마이그레이션 관련 단백질의 표현 했다 또한 시험된²⁰. 예를 들어 ...

토론

그것은 셀 마이그레이션 과정에서 셀 수 중 이동 부착 시트;의 형태로 알려져 느슨한 클러스터; 또는 단일, 고립 된 세포입니다. 모드와 다이나믹 셀의 다른 한 상태에서 변화할 수 있다 그리고 표현 형 시간 변경할 수 있습니다. 전통적인 상처 치유 분석 결과 12 또는 24 h와 같은 긴 시간 간격으로 현미경에서 찍은 스냅 사진을 기반으로 합니다. 이 어렵게 상처 폐쇄의 동적 및 셀 움직임의 패턴을 잡으려고 합니다.

다른 한편으로, 라이브 셀 이미징 시스템 셀 마이그레이션 훨씬 짧은 간격 (30 분 또는 1 시간)와 직접 촬영 한 이미지에 대 한 실현 되지 않습니다 정확히 같은 위치에서 모니터링 합니다. 시스템은 자동으로, 그리고 연구원은 실험의 끝에 데이터를 내보낼 필요. 이 셀 움직임의 패턴 및 실시간으로 상처 폐쇄의 프로세스 모니터링을 가능 하 게. 이 연구에서 상처 치유 분석의 양적 라이브 셀 이미징 시스템의 제어 또는 TIP60 고갈 세포에 상처 폐쇄의 과정 뿐만 아니라 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
MCF10A 세포	ATCC	CRL-10317TM	유방 상피 세포
DMEM/F12 배지 (1:1)	Gibco	11330-032	MCF10A 배양 배지
상피 성장 인자(EGF)	Peprotech	AF-100-15	MCF10A 배양 배지용 보충제
콜레라 독소	Sigma-Aldrich	C-8052	MCF10A 배양 배지
용 보충제Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H-0888	MCF10A 배양 배지용 보충제
인슐린	Sigma-Aldrich	I-1882	MCF10A 배양 배지용 보충제
하우스 세럼	Gibco	16050-122	MCF10A 배양 배지용 보충제
Trypsin	Gibco	25200-056	MCF10A용 플레이트에서 분리
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110	셀 계수용
Opti-MEM 감소 혈청 배지	Gibco	31985-070	siRNA 혼합물용
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen/Life Technologies	56532	Transfect 시약
Trizol 시약	Invitrogen/Life Technologies	15596-026	mRNA 추출용
iScript cDNA 합성 키트	Bio-Rad	170-8891	cDNA용 generation
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5125	실시간 qPCR
7500 고속 실시간 PCR 시스템	Biosystems		실시간 qPCR 메신
10cm dish	Greiner bio-one	664160	넉다운 실험용
24웰 플레이트	Cellstar	662160	상처 치유 분석용
siControl siRNA	Self designed	self designed	CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT
siTIP60 siRNA	Self	designed	UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT
Live cell observer	Zeiss		Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments