TIP60의 과도 한 소모 후 유 방 상피 세포 이동의 라이브 영상

요약

여기, TIP60 소진 MCF10A 유 방 상피 세포를 사용 하 여 상처 치유 분석 결과에서 셀 이동의 실시간 모니터링 하는 것이 선물이. 라이브 세포 이미징 기술 우리의 프로토콜의 구현 분석 하 고 실시간으로 단일 셀 운동 시간을 시각화 수 있습니다.

초록

상처 치유 분석 결과 효율적인 셀 마이그레이션 시험관을 공부 하는 가장 경제적인 방법 중 하나. 전통적으로, 이미지는 시작과 단계 대조 현미경을 사용 하 여 실험의 끝에 고 셀의 마이그레이션 능력 상처의 폐쇄에 의해 평가 됩니다. 그러나, 셀 이동은 동적 현상, 그리고 종래의 방법 단일 셀 이동 추적에 대 한 허용 하지 않습니다. 현재 상처 치유 분석 실험에 개선 하기 위해, 우리는 셀 마이그레이션 실시간으로 모니터링 하 라이브 세포 이미징 기술을 사용 합니다. 이 메서드는 셀 추적 시스템을 기반으로 셀 마이그레이션 속도 확인할 수 있습니다 하 고 셀 마이그레이션 및 세포 증식 사이 명확한 구별을 제공 합니다. 여기, 우리 TIP60의 존재에 의해 영향을 하는 유 방 상피 세포의 다른 마이그레이션 능력을 연구 분석 상처 치유에 라이브 셀 이미징의 사용을 보여 줍니다. 세포 운동 성 높은 동적으로, 우리의 메서드는 상처 치유의 상처 폐쇄 상처 치유 분석 실험에 사용 되는 전통적인 이미징 기술을 함께 찍은 스냅샷 보다 과정에 더 많은 통찰력을 제공 합니다.

서론

HIV Tat에 상호 작용 단백질 60 kDa (TIP60)은 히스톤과 비 히스톤 단백질^1,2acetylate 수 있는 lysine acetyltransferase 이다. 그것의 기능은 전사, DNA 손상 복구 및 apoptosis^1,3,,45,6, 를 포함 하 여 여러 신호 전달 경로에 영향을 찾을 수 있습니다. ^{7 , 8}. 또한, TIP60 자주 downregulated 암에 그 downregulation 암 전이 상관은 고 가난한 생존 요금^{9,,1011,1....}

프로토콜

1입니다. 준비

1. MCF10A 문화 매체를 준비: Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) F12 (1:1) 5% 혈 청, 20 ng/mL 상피 성장 인자, 0.5 mg/mL 날린, 100 ng/mL 콜레라 독 소, 그리고 10 µ g/mL 인슐린 승마 /.
2. 혈 청 무료 매체를 준비: DMEM/F12 (1:1)와 20 ng/mL 상피 성장 인자, 0.5 mg/mL 날린, 100 ng/mL 콜레라 독 소, 10 µ g/mL 인슐린.
3. SiRNA는 다음 순서를 사용 하 여:
   siControl:
   앞으로: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
   역: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
   siTIP60:
   앞으로: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
   역: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'
4. 10 cm 세포 문화 요리와 24-잘 접시를 사용 합니다.

2. TIP60를 사용 하 여 siRNA의 일시적인 고갈

1. 하루에 1, transfection 시 약 (예: Lipofectamine RNAiMAX)의 aliquot 15 µ L의 2 mL 혈 청 ....

결과

일반 스키마의 라이브 셀 이미징 기반 셀 마이그레이션 분석 결과
그림 1A 는이 프로토콜의 스키마입니다. MCF10A 셀 siControl 전형적인 상피 형태를 보여와 페. TIP60의 고갈 후 MCF10A 셀 제어 셀 (그림 1B)에 비해 더 엽 했다.

TIP60 때 려 눕 힘 효율성의 시험
그림 2 는 TIP60 최저 효율을 보여준다. TIP60 식 수준 siTIP60 치료 후 크게 감소. TIP60, 뿐만 아니라 여러 셀 마이그레이션 관련 단백질의 표현 했다 또한 시험된²⁰. 예를 들어 .......

토론

그것은 셀 마이그레이션 과정에서 셀 수 중 이동 부착 시트;의 형태로 알려져 느슨한 클러스터; 또는 단일, 고립 된 세포입니다. 모드와 다이나믹 셀의 다른 한 상태에서 변화할 수 있다 그리고 표현 형 시간 변경할 수 있습니다. 전통적인 상처 치유 분석 결과 12 또는 24 h와 같은 긴 시간 간격으로 현미경에서 찍은 스냅 사진을 기반으로 합니다. 이 어렵게 상처 폐쇄의 동적 및 셀 움직임의 패턴을 잡으려고 합니다.

다른 한편으로, 라이브 셀 이미징 시스템 셀 마이그레이션 훨씬 짧은 간격 (30 분 또는 1 시간)와 직접 촬영 한 이미지에 대 한 실현 되지 않습니다 정확히 같은 위치에서 모니터링 합니다. 시스템은 자동으로, 그리고 연구원은 실험의 끝에 데이터를 내보낼 필요. 이 셀 움직임의 패턴 및 실시간으로 상처 폐쇄의 프로세스 모니터링을 가능 하 게. 이 연구에서 상처 치유 분석의 양적 라이브 셀 이미징 시스템의 제어 또는 TIP60 고갈 세포에 상처 폐쇄의 과정 뿐만 아니라 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
MCF10A 세포	ATCC	CRL-10317TM	유방 상피 세포
DMEM/F12 배지 (1:1)	Gibco	11330-032	MCF10A 배양 배지
상피 성장 인자(EGF)	Peprotech	AF-100-15	MCF10A 배양 배지용 보충제
콜레라 독소	Sigma-Aldrich	C-8052	MCF10A 배양 배지
용 보충제Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H-0888	MCF10A 배양 배지용 보충제
인슐린	Sigma-Aldrich	I-1882	MCF10A 배양 배지용 보충제
하우스 세럼	Gibco	16050-122	MCF10A 배양 배지용 보충제
Trypsin	Gibco	25200-056	MCF10A용 플레이트에서 분리
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110	셀 계수용
Opti-MEM 감소 혈청 배지	Gibco	31985-070	siRNA 혼합물용
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen/Life Technologies	56532	Transfect 시약
Trizol 시약	Invitrogen/Life Technologies	15596-026	mRNA 추출용
iScript cDNA 합성 키트	Bio-Rad	170-8891	cDNA용 generation
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5125	실시간 qPCR
7500 고속 실시간 PCR 시스템	Biosystems		실시간 qPCR 메신
10cm dish	Greiner bio-one	664160	넉다운 실험용
24웰 플레이트	Cellstar	662160	상처 치유 분석용
siControl siRNA	Self designed	self designed	CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT
siTIP60 siRNA	Self	designed	UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT
Live cell observer	Zeiss		Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments