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방법 논문

TIP60의 과도 한 소모 후 유 방 상피 세포 이동의 라이브 영상

6.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56248

⸱

2017년 12월 7일

 ,  ,  , 
1Cancer Science Institute of Singapore, National University of Singapore, 2Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

이 논문에서

요약

여기, TIP60 소진 MCF10A 유 방 상피 세포를 사용 하 여 상처 치유 분석 결과에서 셀 이동의 실시간 모니터링 하는 것이 선물이. 라이브 세포 이미징 기술 우리의 프로토콜의 구현 분석 하 고 실시간으로 단일 셀 운동 시간을 시각화 수 있습니다.

초록

상처 치유 분석 결과 효율적인 셀 마이그레이션 시험관을 공부 하는 가장 경제적인 방법 중 하나. 전통적으로, 이미지는 시작과 단계 대조 현미경을 사용 하 여 실험의 끝에 고 셀의 마이그레이션 능력 상처의 폐쇄에 의해 평가 됩니다. 그러나, 셀 이동은 동적 현상, 그리고 종래의 방법 단일 셀 이동 추적에 대 한 허용 하지 않습니다. 현재 상처 치유 분석 실험에 개선 하기 위해, 우리는 셀 마이그레이션 실시간으로 모니터링 하 라이브 세포 이미징 기술을 사용 합니다. 이 메서드는 셀 추적 시스템을 기반으로 셀 마이그레이션 속도 확인할 수 있습니다 하 고 셀 마이그레이션 및 세포 증식 사이 명확한 구별을 제공 합니다. 여기, 우리 TIP60의 존재에 의해 영향을 하는 유 방 상피 세포의 다른 마이그레이션 능력을 연구 분석 상처 치유에 라이브 셀 이미징의 사용을 보여 줍니다. 세포 운동 성 높은 동적으로, 우리의 메서드는 상처 치유의 상처 폐쇄 상처 치유 분석 실험에 사용 되는 전통적인 이미징 기술을 함께 찍은 스냅샷 보다 과정에 더 많은 통찰력을 제공 합니다.

서론

HIV Tat에 상호 작용 단백질 60 kDa (TIP60)은 히스톤과 비 히스톤 단백질1,2acetylate 수 있는 lysine acetyltransferase 이다. 그것의 기능은 전사, DNA 손상 복구 및 apoptosis1,3,,45,6, 를 포함 하 여 여러 신호 전달 경로에 영향을 찾을 수 있습니다. 7 , 8. 또한, TIP60 자주 downregulated 암에 그 downregulation 암 전이 상관은 고 가난한 생존 요금9,,1011,12, 13,14. 종양 전이 암 관련 된 죽음의 주요 원인입니다. 그것은 다단계 과정 그리고 전이의 초기 단계는 마이그레이션 및 인접 조직을15,16으로 종양 세포의 내 습을 포함 한다. 그렇게 하기 위해 종양 세포는 먼저 기본 종양 질량 총칭 침입 셀 시트의 모양에서 분리 해야 합니다 또는으로 단일 셀17분리. 이 과정 동안 종양 세포는 종종 엽 전환 (응급), 형태학 및 세포 접착 기능17,18에 변화 결과로 상피 받을.

몇 가지 기법 연구는 마이그레이션 개발 되었습니다 그리고 종양의 내 습 능력 세포 생체 외에서. 그 중, 상처 치유 분석 결과 가장 효율적이 고 경제적인19이다. 첫째,이 방법은 마이그레이션할 및 간격 닫기 셀 되므로 셀 confluent 단층에 인공 갭의 창조를 포함 한다. 둘째, 시작 및 실험의 끝에 간격의 이미지를 캡처할 수 있습니다. 마지막으로, 간격 폐쇄의 비교는 세포 이동의 비율을 결정 하는 데 사용 됩니다. 단계 대조 현미경 일반적으로 기존의 상처 치유 분석 실험에 대 한 이미지를 캡처하는 데 사용 됩니다. 상처 치유 분석 결과의 또 다른 장점은 그것은 부분적으로 종양 세포 마이그레이션 vivo에서 유사한입니다. 유사 하 게 종양 전이 에 비보를 상처 치유 분석 실험에서 셀 마이그레이션 상피 시트의 집단 이주와 분리 된 단일 셀의 마이그레이션을 보여줍니다.

그러나, 셀 마이그레이션 동적, 알려져 있다 그리고 실시간으로 세포의 움직임을 문서화 하는 필요 있다. 예를 들어, 기존의 상처 치유 분석 결과 단일 셀 움직임을 분석 하는 연구원을 허용 하지 않습니다. 다른 한편으로, 상처 치유 분석 실험에 대 한 배양 세포 들은 세포 증식을 억제 하는 혈 청을 굶 어입니다. 이것은 세포 증식으로 인해 간격 폐쇄의 가능성을 배제 하기 위해 이루어집니다. 그럼에도 불구 하 고, 있을 것입니다 아직도 일부 확산 및 세포 죽음, 및 단계 실험은 그들을 구별 수 없습니다 전후를 찍은 이미지.

라이브 세포 이미징 기술을 기존의 상처 치유 분석의 이러한 제한을 해결합니다. 라이브 영상 현미경을 사용 하 여 CO2 배양 기 및 적절 한 온도 제어와 결합 하 여, 연구원은 간격 크기를 측정할 수 있으며 세포 적극적으로 마이그레이션의 움직임을 추적 하는 동안 시간이 지남에 폐쇄의 그것의 비율의 끝에는 침략 앞에. 따라서, 라이브 셀 이미징 셀 마이그레이션 모니터링 구현만 셀 이동의 더 나은 시각화를 제공 하지 않습니다 하지만 또한 셀 마이그레이션 및 세포 증식, 제공 하는 더 구별 가능성에 대 한 수 세포 이동의 신뢰할 수 있는 분석.

이 연구에서는 MCF10A 유 방 상피 세포 상처 치유 분석 결과 및 라이브 셀 이미징 셀 마이그레이션에 TIP60의 역할을 연구 하기의 조합을 설명 하기 위해 사용 되었다. TIP60의 소모 증가 마이그레이션 능력 MCF10A 세포에서 발생합니다.

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프로토콜

1입니다. 준비

  1. MCF10A 문화 매체를 준비: Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) F12 (1:1) 5% 혈 청, 20 ng/mL 상피 성장 인자, 0.5 mg/mL 날린, 100 ng/mL 콜레라 독 소, 그리고 10 µ g/mL 인슐린 승마 /.
  2. 혈 청 무료 매체를 준비: DMEM/F12 (1:1)와 20 ng/mL 상피 성장 인자, 0.5 mg/mL 날린, 100 ng/mL 콜레라 독 소, 10 µ g/mL 인슐린.
  3. SiRNA는 다음 순서를 사용 하 여:
    siControl:
    앞으로: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
    역: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
    siTIP60:
    앞으로: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
    역: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'
  4. 10 cm 세포 문화 요리와 24-잘 접시를 사용 합니다.

2. TIP60를 사용 하 여 siRNA의 일시적인 고갈

  1. 하루에 1, transfection 시 약 (예: Lipofectamine RNAiMAX)의 aliquot 15 µ L의 2 mL 혈 청 매체 (예를 들어, Opti 메모리) 감소와 각각 10 µ L의 각 siRNA (10 µ M 주식), 그들을 혼합.
  2. 20 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어.
  3. 1 x 106 MCF10A 셀 10 cm 접시에 배양의 3 mL 함께 씨앗 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
  4. 10 cm 접시에 siRNA 혼합물에 의해 드롭 추가 합니다.
  5. 세포는 동일 하 게 37 ° C 배양 기에 그것을 올려 놓기 전에 배포 되도록 요리를 흔들어.
  6. 후 보육의 6 h, 포함 하는 siRNA 매체를 8 mL 신선한 문화 매체의 바꿉니다.
  7. 하루에 2, siRNA 혼합물의 다른 배치를 준비 하 고 20 분 동안 실내 온도에 그들을 품 어.
  8. 1 일 추가 문화 매체의 8 mL을 aspirate 하 고 신선한 문화 매체의 3 mL와 함께 그것을 대체.
  9. 요리에 의해 드롭 siRNA 혼합물의 두 번째 배치를 추가 합니다. 요리는 시 약은 완전히 인큐베이터에 그들을 올려 놓기 전에 혼합 되도록 흔들어.
  10. 6 h 후 siRNA 포함 된 매체를 8 mL 신선한 문화 매체의 바꿉니다.

3. 씨 셀 상처 치유 분석 결과 대 한

  1. 3 일에 매체를 삭제 하 고 셀 염 분 (PBS) 버퍼 인산 염 버퍼의 2 mL을 한 번 씻어. PBS 버퍼를 삭제 합니다.
  2. 접시에 1 mL의 트립 신-EDTA 버퍼 x 1 추가 하 여 siControl 및 siTIP60 치료 세포를 trypsinize. 다시 20 분 동안 인큐베이터에에서 넣어.
  3. 각 접시에 완전 한 문화 매체의 4 mL를 추가 하 고 셀 pipetting에 의해 resuspend 15 mL 튜브에 그들을 전송.
  4. 5 분 동안 200 g에서 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다.
  5. 다시 혈 청 자유로운 매체의 5 mL로 세포를 일시 중단 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀.
  6. SiControl 및 siTIP60; 6 x 105 셀/mL의 세포 현 탁 액을 준비 잘 혼합 셀 인지 확인 합니다. 100 %confluency 위해 24-잘 접시의 한 잘에 세포 현 탁 액의 500 µ L를 추가 합니다. 5 ~ 6 우물 각각 siControl와 siTIP60에 대 한 씨앗
  7. 부드럽게 앞뒤로 접시 그리고 사이드-투-사이드 분산 되도록 흔들어. 원형 모션을 하지 마십시오. 24 h에 대 한 인큐베이터에 접시를 남겨 주세요.
  8. TIP60의 최저 효율 확인 나머지 셀을 수확. 이렇게 하려면 5 분 동안 200 g에서 나머지 세포 현 탁 액을 원심 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.
  9. RNA는 상업적인 시 약을 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 분리 하 고 최저 효율을 평가 하는 실시간 양이 많은 PCR을 진행.

4. 상처를 만듭니다

  1. 단계 대조 현미경 셀 완전히 장착 되었는지 확인 하려면 확인 하십시오. 세포는 현미경 관찰 (4 배, 10 배, 및 20 배 확대) 셀 셀 confluent 단층 형성 하고있다 연결 완벽 하 게 됩니다.
    참고: siControl 셀 일반적으로 siTIP60 셀 보다 더 나은 연결합니다. 이 때문에 TIP60의 소모 셀 더 엽 같은20으로 예상 된다. 여기, 일반 벤치탑 화이트 빛 단계 대조 현미경 사용 됩니다.
  2. 상처를 생성 하려면 부드럽게 200 µ L 피 펫 팁; 우물의 중앙에 걸쳐 직선을 긁어 생성 된 상처의 길이 우물의 직경으로 동일 합니다. 모든 나머지 우물에 대 한이 단계를 반복 합니다. 각 잘 새로운 피 펫 팁을 사용 합니다.
  3. 부드럽게 씻어 5 번 잘 각 혈 청 무료 사용 하 여 분리 된 세포를 제거 하는 매체.
  4. 각 잘 하 혈 청 자유로운 매체의 1 mL을 추가 하 고 라이브 셀 이미징에 진행.

5입니다. 라이브 셀 이미징의 설치

  1. 현미경을 라이브 셀 이미징 챔버에서 온도 37 ° c.에 도달 하면 되도록 설정 하기 전에 적어도 1 시간을 제어 하는 온도
  2. 라이브 셀 이미징 시작 하기 전에 이산화탄소 (CO2) 가스 공급을 켜십시오. 5% CO2 농도 설정 합니다.
  3. 현미경의 무대에서 24-잘 접시를 놓고 이미징에 대 한 10 배 확대와 대물 렌즈를 선택 합니다. 직접 카메라 대신 접 안경에 내보낸된 빛 고 상처와 주위 세포를 찾기 위해 초점을 조정 합니다.
    참고:이 경우에, 단계 대조와 흰색 빛 사용 되었다.
  4. 라이브 셀 옵저버 시스템을 사용 하 여 각 잘에서 상처의 위치를 표시.
    참고: 라이브 셀 이미징 시스템의 자동화 된 단계는 여러 위치에서 이미지 수집에 대 한 수 있습니다. 이미지는 한 번 모든 간격 모든 표시 된 위치에 이동 됩니다.
  5. 시간 조건 설정: 1 시간 간격 및 72 h 기간; 이 설정에 따라 시스템 것입니다 사진을 찍고 각 표시 된 위치에 72 h. 어떤 원하는 시간 간격 설정에 대 한 모든 시간과 모니터링 기간.
    참고: 여기, 기간 72 h는 최고의 이러한 셀 시작 후 72 h 혈 청 자유로운 매체에 죽어가 고 있기 때문에.

6. 단일 셀 이동 추적

  1. 후에 72 h. JPEG 형식에서 이미지와 동영상을 AVI 형식에서으로 데이터를 내보낼 데이터를 내보냅니다.
    참고: 이것은 중요 ImageJ 소프트웨어만 AVI 형식의 동영상을 인식할 수 있기 때문 에입니다. SiTIP60 및 siControl 세포 사이 다른 셀 마이그레이션 속도 비디오에서 명확 하 게 관찰할 수 있습니다.
  2. ImageJ 소프트웨어에 AVI 비디오를 엽니다.
  3. MTrackJ 플러그인 (플러그인 해야 합니다 다운로드 및 설치 별도)를 열고: 플러그인 > MtrackJ.
  4. MtrackJ 도구 모음에서 "추가" 탭을 클릭 하 여 비디오에서 선택 하는 단일 셀에 대 한 트랙을 추가 합니다. 침략의 끝에 셀 및 자체에 마이그레이션할 수 있는 셀을 선택 (단일 셀 마이그레이션). 비디오에서 선택한 셀의 움직임에 따라 하 고 그들을 추적 하는 것은 MtrackJ를 사용 하 여.
  5. 도구 모음에서 "측정" 탭을 클릭 하 여 이동 거리를 측정 합니다.
    참고: 여기는 siControl에 거의 셀 단일 세포, siTIP60 세포의 많은 단일 세포로 이동 하는 반면 단일 셀 운동 측정 하기 어려운 만들기로 이동. 그러나, 침략 앞에 있는 세포의 움직임 수 여전히 추적 되며, siControl 및 siTIP60 셀에 계산.
  6. 동영상 AVI 형식으로 트랙을 저장 합니다.

7입니다. 셀 마이그레이션 능력의 정량화

  1. 정량화, 0 h 이미지와 "n" h, 여기서 "n" _는 timepoint 닫히면 siTIP60 또는 siControl 세포는 완전히 상처에서 이미지를 선택 합니다.
    참고: 여기, 48 h 선택 되었다, siTIP60 세포에 상처 거의 완전히 폐쇄 했다.
  2. ImageJ는 다음 수식을 사용 하 여를 사용 하 여 백분율 마이그레이션 계량: (0 h-"n" h의 영역에서 상처의 지역) / 0 h x 100의 지역.

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결과

일반 스키마의 라이브 셀 이미징 기반 셀 마이그레이션 분석 결과
그림 1A 는이 프로토콜의 스키마입니다. MCF10A 셀 siControl 전형적인 상피 형태를 보여와 페. TIP60의 고갈 후 MCF10A 셀 제어 셀 (그림 1B)에 비해 더 엽 했다.

TIP60 때 려 눕 힘 효율성의 시험
그림 2 는 TIP60 최저 효율을 보여준다. TIP60 식 수준 siTIP60 치료 후 크게 감소. TIP60, 뿐만 아니라 여러 셀 마이그레이션 관련 단백질의 표현 했다 또한 시험된20. 예를 들어 ...

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토론

그것은 셀 마이그레이션 과정에서 셀 수 중 이동 부착 시트;의 형태로 알려져 느슨한 클러스터; 또는 단일, 고립 된 세포입니다. 모드와 다이나믹 셀의 다른 한 상태에서 변화할 수 있다 그리고 표현 형 시간 변경할 수 있습니다. 전통적인 상처 치유 분석 결과 12 또는 24 h와 같은 긴 시간 간격으로 현미경에서 찍은 스냅 사진을 기반으로 합니다. 이 어렵게 상처 폐쇄의 동적 및 셀 움직임의 패턴을 잡으려고 합니다.

다른 한편으로, 라이브 셀 이미징 시스템 셀 마이그레이션 훨씬 짧은 간격 (30 분 또는 1 시간)와 직접 촬영 한 이미지에 대 한 실현 되지 않습니다 정확히 같은 위치에서 모니터링 합니다. 시스템은 자동으로, 그리고 연구원은 실험의 끝에 데이터를 내보낼 필요. 이 셀 움직임의 패턴 및 실시간으로 상처 폐쇄의 프로세스 모니터링을 가능 하 게. 이 연구에서 상처 치유 분석의 양적 라이브 셀 이미징 시스템의 제어 또는 TIP60 고갈 세포에 상처 폐쇄의 과정 뿐만 아니라 ...

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공개 사항

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

우리는 그들의 도움이 논의 및 의견 Jha 실험실의 구성원 감사. 스는 암 과학 연구소의 싱가포르 (R-713-006-014-271), 국가 의료 국립 연구 재단 싱가포르와 싱가포르 교육부의 연구 센터 우수 이니셔티브의 밑에서 교부 금에 의해 지원 되었다 연구 위원회 (CBRG-검; BNIG11nov001 및 CS-IRG; R-713-000-162-511), 교육 학술 연구 기금 (모에 AcRF 계층 1 T1-2012 년 10 월-04). Y.Z., G.S.C., 및 C.Y.T. 암 과학 연구소의 싱가포르, 싱가포르의 국가 대학에 의해 수 여 하는 대학원 친교에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
MCF10A 세포ATCCCRL-10317TM유방 상피 세포
DMEM/F12 배지 (1:1)Gibco11330-032MCF10A 배양 배지
상피 성장 인자(EGF)PeprotechAF-100-15MCF10A 배양 배지용 보충제
콜레라 독소Sigma-AldrichC-8052MCF10A 배양 배지
용 보충제HydrocortisoneSigma-AldrichH-0888MCF10A 배양 배지용 보충제
인슐린Sigma-AldrichI-1882MCF10A 배양 배지용 보충제
하우스 세럼Gibco16050-122MCF10A 배양 배지용 보충제
TrypsinGibco25200-056MCF10A용 플레이트에서 분리
HemacytometerFisher Scientific267110셀 계수용
Opti-MEM 감소 혈청 배지Gibco31985-070siRNA 혼합물용
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies56532Transfect 시약
Trizol 시약Invitrogen/Life Technologies15596-026mRNA 추출용
iScript cDNA 합성 키트Bio-Rad170-8891cDNA용 generation
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5125실시간 qPCR
7500 고속 실시간 PCR 시스템Biosystems실시간 qPCR 메신
10cm dishGreiner bio-one664160넉다운 실험용
24웰 플레이트Cellstar662160상처 치유 분석용
siControl siRNASelf designedself designedCGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT
siTIP60 siRNASelfdesignedUGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT
Live cell observerZeissZeiss inverted Cell Observer for live cell experiments

참고문헌

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