Method Article

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

DOI:

10.3791/56261

⸱

November 18th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

속눈썹 개발 적절 한 organogenesis에 생명 이다입니다. 이 프로토콜 레이블을 하 고는 제 브라의 ciliated 셀을 시각화 하는 최적화 된 방법을 설명 합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

최근 몇 년 동안, zebrafish 태아 배아 개발 utero 전 및 광학 투명도 같은 특성으로 인해 개발 생물학 공부를 인기 모델로 떠오르고 있다. 특히, zebrafish 태아 척추 신장 organogenesis multiciliated 셀 (MCC) 개발 공부 하는 중요 한 유기 체 되고있다. 배아 zebrafish 신장에서 MCCs를 시각화, 우리 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)의 결합 된 프로토콜을 개발 했습니다 하 고 전체 고해상도 이미징 수 있도록 면역 형광 (IF)를 탑재. 이 원고 공동 다양 한 혈통 요소의 표현을 통해 발달 프로그램의 규칙을 이해 하는 도구로 서 RNA 사본 및 단백질을 지역화 우리의 기술을 설명 합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

지난 몇 년간 제 브라 (Danio rerio) 개발 생물학을 공부 하는 주요 모델 생물으로 떠오르고 있다. 태아는 어머니 이상으로 개발 하 고 광학 투명. 또한, 눈, 신장, 개 등 중요 한 장기의 형성, 그냥 24 시간 게시물 수정 (hpf)에 의해 형성 된 구조와 발생 합니다. 중요 한 것은, zebrafish 게놈이 포유류1,2,3높은 보존 된다. 또한, 제 브라와 포유류 장기 비슷한 해부학과 생리학 있다. 제 브라 미 발달 신장, 또는 pronephros, 초기 nephrogenesis 및 척추 nephron4, 의 보존된 상피 세포 인구의 운명 결정 하는 동안 유전자 기능을 조사 하기 위한 모델 시스템의 값을 보여 줍니다. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. 마찬가지로, zebrafish 태아 MCCs11,12,13,,1415, 의 그렇습니다 검사에 점점 더 중요 해지고 있다 16 , 17.

그들의 이름에서 알 수 있듯이, Mcc는 상피 세포 꼭대기 표면17에 있는 운동 속눈썹의 특징 이다. Zebrafish에서 MCCs 유체 흐름에서 작동 하 고 24 hpf11,12,,1314, "salt-and-pepper"는 pronephros의 각 nephron의 중간에 걸쳐 패션에 분산 되어 있는 15 , 16 , 17. 비록 그들은 단지 한 줌에 지적 되었습니다 인간 신장의 질병 케이스18,,1920,21, MCCs 두뇌 같은 다른 포유류 조직에서 유행 하 고 기관22,23,24, 실험 설계에 대 한 도전의 호스트 포즈는. Zebrafish를 포함 한 다양 한 척추 동물 모델에서 우아한 연구 노치 신호 전달 경로 고객 센터 개발12,,1725 의 억제제로 보존된 통로 MCC 운명의 증명 ,2627. 따라서, zebrafish pronephros MCC 개발 vivo에서11,12,,1314, 의 유전 메커니즘을 연구 하 쉽게 접근할 수 있는 모델 제공 15 , 16 , 17.

투명성과 zebrafish 태아의 쉬운 유전자 조작 입증 귀중 한 특성 세포 운명, 조직 성장, 및 초기 배아1,2 개발 유전과 분자 경로 공부를 할 때 ,3. 현장에서 교 잡 등 전체 마운트 경우 단백질 및 유전자 내용은 시각화에 적용 되었고 zebrafish16,,2829에 대 한 최적화를, 전통적인 기법으로 30,31,32,33,34,35,36,,3738. 물고기와 IF에 대 한 인기 있는 프로토콜을 결합 하 여 레이블 및 Mcc vivo에서16,28,,3738분석 하 가능 하다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다음 프로토콜 사용 zebrafish 성인 Zebrafish의 Notre Dame 대학에서 연구를 위한 센터에 의해를 걱정 하 고 유지 합니다. Zebrafish 성인 및 태아에 대 한 모든 방법은 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 배아 고정

  1. Zebrafish 태아 앞에서 설명한 방법39,40을 사용 하 여 수집 합니다. 24 hpf, 배아에 E3에 일반적인 효소 혼합물 해결책 (50 mg/mL)의 500 µ L 상 온 (RT) 품 요리를 추가.
  2. 배아는 chorion의 돌발을 시작, 일단 태아 요리에서 모든 액체를 제거 합니다.
  3. E 3의 약 20 mL를 추가 하 고, 부드럽게 접시에는 E3 소용돌이 다음 액체 폐기물 용기에 액체를 decanting 여 2-3 회 신선한 E3와 배아를 씻어.
  4. 수정 하기 전에 배아를 안락사는 e 3에 0.2 %tricaine 2 개 mL를 추가 합니다.
  5. 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 5 mL 유리 유리병에 배아를 전송 합니다. 배아는 유리병의 바닥에 정착 후는 피 펫을 사용 하 여 tricaine/E3 솔루션의 대부분을 제거 합니다.
  6. 4 %paraformaldehyde (PFA)의 5 mL와 함께 동요 없이 RT에 2-4 h 24 hpf 배아 수정.
    주의: PFA 독성 하 고 연구원 눈 보호, 장갑, 그리고 실험실 외 투를 착용 하는 동안 화학 후드 PFA 솔루션을 처리 해야 합니다. 입자가 굵은 PFA 파우더 PFA 정착 액의 준비 입자가 굵은 PFA 정전기를 통해 분산 경향으로 우수한 치료와 함께 수행 되어야 한다.
    참고: 배아 4% PFA 4 ° c.에 하룻밤 사이에서 고칠 수 있다 준비 4 %PFA 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 종 x 1 지속적으로 해결책을 교 반 하면서가 열 하 여 완전히 입자가 굵은 PFA 해산. 일단 솔루션은 실시간, PFA는 0.45 μ m 진공 여과 위한 일회용 시스템을 통해 그것을 전달 하 여 살 균 필터 4% 아래로 다시 냉각 후 및 저장-20 ° c.에 대 한 15 mL 또는 50 mL 부분으로 aliquoted
  7. 4 제거 %PFA 및 1 X 인산 염 버퍼와 두 번 세척 배아 0.1% 식 염 수 트윈-20 (PBST)에서 실시간 실시간 추가 5 mL 신선한 100%에서 100% 메탄올 (MeOH)의 5 mL로 한 번 태아를 씻어 MeOH 배아를 고 적어도 20 분 동안-20 ° C에서 품 어.
    참고: 배아는 100%에 저장할 수 있습니다 MeOH 배아 준비를 위한 준비까지-20 ° C에서.

2. 태아 준비와 교 잡

  1. 50%의 5 mL에 한번 세척 하 여 배아를 rehydrate MeOH 1에서 30%의 5 ml에서는 배아를 세척 하 여 실시간 계속 재에서 5 분 동안 x PBST 1에서 MeOH 실시간에 5 분 동안 x PBST 1의 5 mL에 배아를 씻어 5 분 각각에 대해 두 번 x PBST 실시간
  2. 1에서 1:1,000 가수분해 K의 솔루션 (pK) (10mg/mL) 5 mL에 그들을 배양 하 여 배아를 permeabilize 실시간에서 2 분 x PBST
    그러나 참고: 이전 배아 수 있습니다 알을 품을 5 mg/mL 및 외피의 농도 시간 2 분 미만, 위에 명시 된 pK 농도에서 2 분 24 미만 태아에 대 한 제안 보다 더 이상 hpf.
  3. PK 솔루션 및 세척 즉시에 1 x PBST 실시간에 두번 수정 배아 4%의 5 mL의 5 mL을 제거 PFA RT 적어도 20 분 동안에.
    참고: 배아 4% PFA 4 ° c.에 하룻밤 사이에서 고칠 수 있다
  4. PFA 및 세척 두 번에 1의 5 mL을 제거에서 실시간 x PBST
  5. 1의 5 mL에 배아를 전송 평면 바닥 microcentrifuge 튜브 x PBST microcentrifuge 선반에 각 배아와 후속 교 잡 솔루션 간의 상호 작용을 촉진 하는 RT에 똑바로 배치.
  6. 신선한 Hyb + 실시간 추가 1.5 mL에서 교 잡 솔루션 (Hyb +)의 1.5 mL에 두 번 배아를 세척 하 고 4-6 h 동안 교 잡 오븐에서 70 ° C에 태아를 품 어.
  7. 프로브 솔루션의 볼륨의 Hyb + 1.5 mL를 바꿉니다 (10 µ L RNA 프로브/500 µ L Hyb +)는 배아를 완벽 하 게 커버 하기에 충분.
    참고: 음성 antisense RNA 프로브를 사용 하 여 이전에 설명한 방법39합성.
  8. 동요 하지 않고 microcentrifuge 랙에 위치 개별 관 직으로 70 ° C에서 교 잡 오븐에서 밤새 조사를 교배.

3. 뜨거운 세척 및 차단

참고: 뜨거운 세척 배아에 적절 한 솔루션을 추가 하 고 다음 70 ° c.에서 교 잡 오븐에 잠복기에 의해 수행 됩니다. 70 ° C에 세척 솔루션을 지키려고 장소 50 mL 튜브 각 솔루션의 교 잡 오븐 때 프로브 / Hyb + 혼합물 추가 됩니다.

  1. 프로브를 제거 합니다. 20-30 분 각 염-나트륨 시트르산 (SSC) 버퍼 x 50 %formamide / 2의 1.5 mL에서 70 ° C에서 두 번 배아를 씻어.
    참고: 프로브-20 ° C에서 Hyb +에 저장 되며 나중에 다시 사용 될 수 있습니다.
  2. 2의 1.5 mL에서 70 ° C에서 배아를 한 번 씻어 15 분에 대 한 x SSC 20-30 분 각 0.2 X SSC의 1.5 mL에서 70 ° C에서 두 번 배아를 씻어. 차단 시 약의 1.5 mL와 바꾸기 0.2 x SSC 및 4 ° c.에서 밤새 품 어
    참고: 그것은 하룻밤 대신 4 h에 대 한 실시간에 차단 시 품 어 수 있습니다.

4. 항 체 외피와 Maleic 산 버퍼 세척

참고: 배아 주위 빛 으로부터 보호 유지.

  1. 1:1,000의 비율로 차단 시에 반대로 DIG-포드의 0.2 mL 차단 시 약 교체 및 3 h 호 일 또는 실시간에 다른 빛 차단 커버 아래에 품 어
    참고: 또는, 항 체 수 품 어 하룻밤에 4 ° c.
  2. 3 h 후 배아를 maleic 산 2-4 회 10-15 분 각 실시간 품 배아 1.5 ml 신선한 maleic 산 버퍼의 4 ° C에서 하룻밤에 대 한 버퍼의 1.5 ml에서 씻으십시오.
    참고: 그것은 하룻밤 사이, maleic 산 버퍼에서 품 어 필요가 없습니다 하지만 하 고 이렇게 조사 배경 감소.

5. 프로브 탐지 및 과산화 효소의 제거

참고: 배아 주위 빛 으로부터 보호 유지.

  1. Maleic 산 버퍼를 제거 하 고 1x PBS의 1.5 mL를 바꿉니다. 실시간에서 60 분에 대 한 솔루션을 얼룩이 지기 형광 5 분 동안 각각 0.2 mL에 실시간 품 배아에서 Cy3의 1 x PBS의 1.5 mL에 두 번 배아를 씻어
    참고: 보육 시간 다른 프로브에 대 한 달라질 수 있습니다.
  2. RT에서 10 분에 대 한 1 X PBS에 다음 %MeOH 1.5 mL를 한번 배아를 세척: 30 %MeOH, 50% 75 %MeOH 100% MeOH MeOH.
  3. RT에서 10 분의 1 x PBS에 다음 MeOH 솔루션의 1.5 mL를 한번 배아 실시간 세척에서 30 분 동안 MeOH에 1% H2O2 의 1.5 mL와 함께 태아를 품 어: 75 %MeOH, 50 %MeOH, 및 30 %MeOH. 1 x PBS의 1.5 ml에서 RT에서 5 분 동안 두 번 배아를 씻어.
    참고: 배아에에서 저장할 수 있습니다 PBS 하룻밤에 4 ° c.

6입니다. 면역 형광 검사

참고: 배아 주위 빛 으로부터 보호 유지.

  1. DdH2O 5 분의 1.5 ml 배아 실시간 세척에 미리 냉장된 아세톤 (-20 ° C에서 보관 하는)의 1.5 ml 배아 한 세척 실시간에서 7 분 1.5에 한번 배아 실시간 세척에 배아 ddH2O 5 분의 1.5 mL에 한 번 세척 1 mL 실시간 5 분의 1 %DMSO (PBDT)와 x PBST
  2. 2 시간에 대 한 실시간에 로커에 PBDT + 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 1.5 mL에 태아를 품 어.
  3. PBDT + FBS를 제거 하 고 기본 항 체, 안티 acetylated tubulin (마우스에서 생산) 및 안티-γ-tubulin (토끼에서 생산), 함께 1:400 PBDT + 1%에 희석의 1.5 mL를 바꿉니다 FBS. 밤새 4 ° c.에 태아를 품 어
    참고: 보육 시간 1 차 항 체에 따라 달라질 수 있습니다. 다른 시간 간격의 테스트 라벨 최적화를 해야 수 있습니다.

7. 이차 항 체

참고: 배아 주위 빛 으로부터 보호 유지.

  1. FBS + 로커에 RT에 1 분 동안 0.1 M NaCl 배아에서 초과 언바운드 항 체를 제거 하려면 PBDT + 1%의 1.5 ml에서 씻으십시오.
  2. 배아를 씻어 PBDT + 1%의 1.5 mL에 5 번 FBS + 실시간에 로커에 각 30 분 0.1 M NaCl 배아에에서 씻어 1.5 mL PBDT + 1 %FBS 로커에 RT에서 30 분.
  3. 이차 항 체의 200 µ L에 4 ° C에서 하룻밤 태아를 품 어 알 렉 사 488 염소 반대로 마우스 IgG와 알 렉 사 647 염소-토끼 IgG, 1: 500에 PBDT에 함께 희석.

8. DAPI 얼룩

참고: 배아 주위 빛 으로부터 보호 유지.

  1. 워시 배아 신속 하 게 RT에서 PBDT의 1.5 mL에 두 번. PBDT DAPI의 1.5 mL, 희석 1:15000 1 X PBST에 고는 로커에 RT에서 15 분을 품 어.
  2. 1.5 ml PDBT + 1%의 배아를 씻어 FBS + 0.1 M NaCl 3 번 15-20 분에 대 한 실시간에. 마운트 및 이미지 준비가 될 때까지 4 ° C에서 PBDT의 1.5 mL에 배아를 저장 합니다.

9. 장착 및 Zebrafish Pronephros 이미지

  1. 작은 볼륨, PBDT의 약 10 µ L에에서 유리 슬라이드에 누워 태아 측면.
  2. 한 켤레 미세 집게는 머리를 제거 하 고 노 른 자 공의 일부와 눈 뒤에 배아를 짠 다.
  3. 미세 집게를 사용 하 여 부드럽게 긁어 떨어진 태아 몸에서 남은 노 른 자 공. 얇은 티슈로 슬라이드에서 천연된 노 른 자 및 여분 액체를 제거 합니다.
  4. 미디어는 태아의 나머지 꼬리를 장착 한 방울을 추가 하 고 위치는 꼬리 옆으로 누워. 샘플, 병합 다음 커버 슬라이드 상자에 꼬리 위에 coverslip을 놓습니다.
  5. 신장 속눈썹에 다음과 같은 채널을 사용 하 여 confocal 현미경 60 배 확대에 이미지: 파란색에서 DAPI (408.0 설정 레이저 nm), 녹색에서 FITC (488.0 설정 레이저 nm), Cy3 염료-표시 된 빨간색에서 (561.0 설정 레이저 nm), 및 흰색에서 알 렉 사 680 (637.0 설정 레이저 nm).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

야생-타입 zebrafish 태아 24 고정 hpf 바로 위에서 설명한 대로 준비 하 고. 그림 1 선택한 그림된 단계 함께 실험적인 워크플로 보여 줍니다. 1-8 단계에서 설명 하는 워크플로 샘플 조달, 고정, 및 면역 형광 라벨 protein(s) 관심의 뒤 센스 riboprobes와 생 성적표를 고정된 조직의 조작의 과정을 포함 합니다. 워크플로의 단계 9 장착 및 이미징 zebrafish 배아 트렁크의 시각화를 최적화 하도록 특별히 설계 된 기술을 말합니다. 9 단계를 동반 하는 도면에서 우리 유리 슬라이드에 조직의 위치에 대 한 조작 방법을 설명 합니다. 이 단계에서 태아 머리와 노 른 자 볼 꼬리 옆으로 유리 슬라이드와 coverslip 사이 위치를 떠나 제거 됩니다. 노 른 자 공과 헤드의 제거와 노 른 자 공 자동 fluoresces 장착 과정을 방해 pronephros, 거주 고객 센터 인구 최고의 이미징에 대 한 제안입니다.

Confocal 현미경을 사용 하 여 얻은 대표 이미지 그림 2, 60 X 확대 같은 야생-타입 배아와 동일한 배율에서 디지털 줌 표시에 제공 됩니다. 상위 패널 아래쪽 두 패널은 이러한 이미지 데이터의 복합 오버레이 각 개별 채널의 이미지를 제공 합니다. (왼쪽된 열 이미지)에서 백색 상자 영역을 디지털 줌 (오른쪽 이미지)의 초점을 설명 합니다. 디지털 줌의 마지막 패널에 강조 표시, 핵, DAPI에서 표시 했다 그리고 MCCs odf3b, γ-tubulin에 항 체 나타내는 기초 시체와 α-tubulin는 속눈썹을 인식 하도록 하는 센스 riboprobe에 따라 감지 했다. 복합 오버레이의 디지털 줌에서 노란색 점선된 원 odf3b 성적표, 여러 기초, 몸과 속눈썹의 소유로 인해 확인 된 MCC의 경계를 나타냅니다. 노란 점선 동그라미 표시 된 인접 한 모노 ciliated 셀 단일 기초 신체 및 단일 cilium의 표현 형에 따라 확인 되었다.

figure-results-1
그림 1: 실험 순서도의 도식. 이 중요 한 단계는 눈송이 차가운 외피를 나타냅니다의 삽화 동반 순서도 실험적인 워크플로 보여줍니다, 3 개의 곡선된 라인 열, 나타내고 시계 긴 부 화 시간을 나타냅니다. 프로토콜에서 설명한 것 처럼 오랜 시간 동안 어떤 단계를 수행할 수 있습니다 있지만 최소 6 일 (과정에서 각 단계의 숫자 오른쪽 상단 모서리에 참조)에 워크플로 수행할 수 있습니다. 설치 과정의 상세한 묘사, 유리 슬라이드와 coverslip 최종 탑재 된 배아 꼬리를 보여주는 그려집니다. 검은 점선된 박스 60 X 배율에서 이미지 영역을 설명 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-2
그림 2: 대표 zebrafish pronephros MCCs를 시각화에 대 한 결과. 최대 이미지 확대 뿐만 아니라 같은 태아의 60 배 확대에 confocal에 디지털 줌 X 60 24 hpf 야생-타입 zebrafish 태아의 예측. 흰색 상자 확대/축소에 대 한 초점 영역을 나타냅니다. DAPI (핵), odf3b (MCCs), γ-tubulin (기초 기관), 및 α-tubulin (속눈썹)의 개별 얼룩 표시 되며 하단 2 패널에 함께 병합 다음. 디지털 줌에서 우리 같이 셀 위치의 근사를 제공: MCC 점선 노란색 원으로 개설 하 고 점선된 노란색 원 설명 모노 ciliated 셀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

위의 상세한 프로토콜 pronephros odf3b 성적표와 α-tubulin 24 hpf zebrafish 태아에 있는 MCCs를 라벨에 대 한 최적화 됩니다. 최상의 결과 얻으려면 갓 고정 하 고 준비 된 배아를 사용 하는 것이 좋습니다. 고정 되어 MeOH 또는 Hyb + 1 주 이상-20 ° C에서 저장 된 배아 배아 저장소에 유지 됩니다 시간 증가 얼룩 원치 않는 배경의 확률만 사용할 수 있습니다.

수정 및이 기술의 문제 해결 특정 마커, 예를 들어 다른 센스 riboprobes 및 다른 항 체의 다른 제품군에 대 한이 메서드를 조정할 필요가 있습니다. 전체 산 현장에서 교 잡 과정 단계 매개 변수를 조정 하기 위한 많은 방법이 있다 이전 우리의 그룹 및 다른 사람에 의해31,,3436,38, 문서화 39. 마찬가지로, 각 단백질 항 체 얼룩이 번, 측면에서 몇 가지 문제 해결 필요 합니다 하 고 희석 및 보육 시간 각 1 차 항 체에 대 한 대략적인 범위는 최고의 문서화 된 결과28, 의 평가 의해 추정 35. 24 미만 태아에 대 한 hpf, pK 치료 2 분 보다 짧은 있어야 어디 24 보다 오래 된 배아 hpf pK 2 분 이상 대우 되어야 한다. 또한, 24 보다 더 오래 된 배아 hpf pK 치료 하기 전에 안료의 표백 한다.

형광 성 얼룩 솔루션 얼룩 후 메탄올과 과산화 수소 세척의 시리즈를 수행 하 여 모든 나머지 얼룩, 항 체, 및 peroxidases를 제거 하는 중요 한 이다. 바로 다음 PBS 세척은 배아에서 초과 메탄올을 제거 하는 중요 한. 만약 항 체를 계속 하기 전에 중요 한 것은, 우리는 그 아세톤 및 이온된 수 세척 배아 서로 또는 원심 분리기 튜브 준수 하 게 발견 했다. 우리의 경험, 특정 전사 인자와 다른 유전자에 대 한 항 체에 그들은에서 효율적으로 일할 수 있습니다 비록 서양 지우고에서 zebrafish에 경우에 잘 작동 하지 않습니다. 그러나, 매우 보존 하 고 풍부한 단백질, tubulin α 및 β-catenin 같은 경우16,37제 브라에서 잘 작동지 않습니다.

물고기, 그것 되지 않은 아직 특정 항 체는 제 브라에서 유전자의 RNA 사본을 시각화 가능 하다. 경우 물고기를 결합해 서,이 프로토콜에 의해 증명으로 볼 vivo에서 (그림 2) RNA 사본 및 단백질의 공동 지역화 될 수 있습니다. 프로토콜의 유연한 특성 다양 한 RNA 사본 및 수많은 조직 및 시간 포인트에서 단백질의 시각화에 대 한 빠른 문제 해결 수 있습니다. Zebrafish 태아의 이미 존경 받는 특성 결합, 생선 + IF이이 프로토콜 유전자와 단백질 중요 한의 식을 발달 통로 규제를 탐험 다른 도구를 제공 합니다.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 원시와 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 제를 부여 R01DK100237에 의해 부분적으로 지원 A.N.M. DGE-1313583 우리는 또한 대학의 과학 여름 학부 연구 친교 프로그램 M.U. 지원 위한 감사 합니다. 우리는 Zebrafish의 Notre Dame 대학 우리의 zebrafish의 전용된 그들의 관리에 대 한 연구는 센터를 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 생물 학적 과학의 부서 뿐만 아니라 그들의 지원 및 중요 한 통찰력의 모든 연구소의 회원을 감사 하 고 싶습니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
비특이적 프로테아제 혼합물 용액Roche11459643001, Streptomyces griseus의 프로나제를E3 <강한>없이 메틸렌 블루로 희석하여 50mg/mL 원액 만들기;-20°C에서 보관; C
E3 용액수에 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4)를 희석하고, 오염을 억제하기 위해 1 x 10-5 M 메틸렌 블루 (시그마 M9140)를 첨가
트리카인 (에틸 3- 아미노 벤조 에이트 메탄 설포 네이트)FlukaA5040-250G0.2 % 원액을 만들려면 10 mL Tris에 트리카인 분말 1g을 용해하고, pH 9.5 및 증류수, 최대 500mL
배아 접시VWR351029
5mL 유리 바이알Wheaton225012
일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫VWR414004-004
4% 파라포름알데히드(PFA) 용액전자 현미경 서비스192104X PBS에 1% PFA를 녹이고 흄 후드 아래에서 끓입니다. 식히고 부분 표본을 얻은 다음 -20°C에서 보관하십시오. 사용을 위해 한 번 해동하면 다시 냉동하지 마십시오.
10X PBSAmerican BioanalyticalAB11072증류수에 희석하여 1X 스톡
Tween-20 스톡American BioanalyticalAB02038증류수에 희석하여 0.1% Tween-20 스톡을 만듭니다.
0.1% Tween 20 (PBST)를 함유한 1X 인산염 완충 식염수SigmaP94160.1% Tween-20 in 1X PBS
메탄올 (MeOH)Sigma34860-4L
proteinase KRoche3115879001증류수에 용해시켜 10 mg/mL 스톡을 만듭니다. C
편평한 바닥 마이크로 분리기 관VWR87003-300; 87003-298
포름 아미드미국 생물 분석AB00600-20 °C에 저장; C
혼성화 용액 (HYB+)50% 포름아미드, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL 효모 토룰라 RNA, 50 μ 지/&무; L 헤파린; -20°C에 저장하십시오. C
혼성화 오븐Fisher Scientific13-247-10Q
20X 식염수-구연산나트륨(SSC) 완충 용액American BioanalyticalAB13156증류수에 희석하여 2X 및 0.2X 스톡
차단 시약 용액Roche11096176001maleic acid buffer에 희석하여 10% 재고 용액을 만듭니다. 4°deg에서 보관하십시오. C
말레 산 완충 용액시그마M0375 및 S7653150mM 말레 산, 100mM NaCl (pH 7.5)
안티 디곡시게닌 -포드, 팹 단편Roche112077399104°deg에 저장; C
Cy3 형광 염색 용액PerkinElmer, Inc.NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 시스템스토어 4° C; 키트 버퍼에 TSA 시약(DMSO 60uL에 용해됨)을 1:50 희석하여 신선한 염색 용액을 준비
과산화수소(H2O2)SigmaH1009-500mL4°C에 보관합니다. C
분자 등급 증류수 (ddH2O)Mediatech25-055-CM
아세톤American BioanalyticalAB00636-01000은 -20°C에서 분취액을 저장합니다. C
DMSOAmerican BioanalyticalAB00435-01000
소 태아 혈청 (FBS)Gibco10438-034부분 표본 및 -20°C에 보관; C
monoclonal anti-acetylated tubulin 클론 6-11B-1Sigma-AldrichT6793부분 표본 및 -20°C에 보관;
C anti-γ -tubulin anitbody는 토끼Sigma-AldrichT5192부분 표본에서 생산되어 -20°C에 보관됩니다. C
odf3b cDNA 클론 MGC:63985OpenBiosystems이미지:6792478-80°C에 세균성 글리세롤 재고를 저장합니다. C
NaCLAmerican BioanalyticalAB01915-05000
Alexa 밀가루 647 염소 안티 토끼 IgGLife TechnologiesA212454°에 저장; C; 빛으로부터 보호
Alexa fluor 488 염소 안티 마우스 IgGLife TechnologiesA110294°에서 저장; C; 빛으로부터 보호하십시오
DAPILife TechnologiesD1306부분 표본 및 -20°C에서 보관하십시오. C
유리 슬라이드Thermo-Fisher4445
유리 커버 슬립Thermo-Fisher12-540A18 x 18mm
미세 집게RobozRS-1050Dumont 핀셋 패턴 #55
장착 매체Polysciences, Inc.18606, 4°의 Aqua-Poly/Mount매장; C
컨포칼 현미경 및 관련 소프트웨어와 함께 Nikon C2plus 컨포칼 현미경을 사용합니다
증류하십시오., 합니다.는 우리는 NIS 요소 AR 소프트웨어 로커 Bio-Rad 1660710EDU.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).">Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  2. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341(2012).">Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341(2012).
  3. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).">Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  4. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).">Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
  5. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).">Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  6. The zebrafish pronephros: a model to study segmentation. Kindey Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).">Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study segmentation. Kindey Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
  7. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).">Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  8. Renal progenitors: roles in kidney disease and regeneration. World J Stem Cells. 8 (11), 367-375 (2016).">Chambers, B. E., Wingert, R. A. Renal progenitors: roles in kidney disease and regeneration. World J Stem Cells. 8 (11), 367-375 (2016).
  9. Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish. World J Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).">Drummond, B. E., Wingert, R. A. Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish. World J Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).
  10. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease. Kidney Int. 89 (6), 1204-1210 (2016).">Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease. Kidney Int. 89 (6), 1204-1210 (2016).
  11. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).">Kramer-Zucker, A. G., Olale, F., Haycraft, C. J., Yoder, B. K., Schier, A. F., Drummond, I. A. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
  12. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithlelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134, 1111-1122 (2007).">Liu, Y., Narendra, P., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithlelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134, 1111-1122 (2007).
  13. Jagged2a-Notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genetics. 3, e18(2007).">Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-Notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genetics. 3, e18(2007).
  14. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386 (1), 111-122 (2014).">Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386 (1), 111-122 (2014).
  15. miR-34b regulates multiciliogenesis during organ formation in zebrafish. Development. 140, 2755-2764 (2013).">Wang, L., et al. miR-34b regulates multiciliogenesis during organ formation in zebrafish. Development. 140, 2755-2764 (2013).
  16. Epithelial cell fate in the nephron tubule is mediated by the ETS transcription factors etv5a and etv4 during zebrafish development. Dev Biol. 411 (2), 231-245 (2016).">Marra, A. N., Wingert, R. A. Epithelial cell fate in the nephron tubule is mediated by the ETS transcription factors etv5a and etv4 during zebrafish development. Dev Biol. 411 (2), 231-245 (2016).
  17. Antennas of organ morphogenesis: the roles of cilia in vertebrate kidney development. Genesis. 54 (9), 457-469 (2016).">Marra, A. N., Li, Y., Wingert, R. A. Antennas of organ morphogenesis: the roles of cilia in vertebrate kidney development. Genesis. 54 (9), 457-469 (2016).
  18. Ciliated human renal proximal tubular cells. Observations in three cases of hypercalcemia. Am J Pathol. 53, 609-616 (1968).">Duffy, J. L., Suzuki, Y. Ciliated human renal proximal tubular cells. Observations in three cases of hypercalcemia. Am J Pathol. 53, 609-616 (1968).
  19. Cilia in the human kidney. Ultrastruct Pathol. 6, 285-294 (1984).">Katz, S. M., Morgan, J. J. Cilia in the human kidney. Ultrastruct Pathol. 6, 285-294 (1984).
  20. Ciliated renal tubular cells in crescentic glomerulonephritis. Ultrastruct Pathol. 19, 201-203 (1995).">Hassan, M. O., Subramanyan, S. Ciliated renal tubular cells in crescentic glomerulonephritis. Ultrastruct Pathol. 19, 201-203 (1995).
  21. Detection of proximal tubular motile cilia in a patient with renal sarcoidosis associated with hypercalcemia. Am J Kidney Dis. 45, 1096-1099 (2005).">Ong, A. C., Wagner, B. Detection of proximal tubular motile cilia in a patient with renal sarcoidosis associated with hypercalcemia. Am J Kidney Dis. 45, 1096-1099 (2005).
  22. Ependymal cilia: distribution and activity in the adult human brain. Science. 139, 221-222 (1963).">Worthington, W. C., Cathcart, R. S. III Ependymal cilia: distribution and activity in the adult human brain. Science. 139, 221-222 (1963).
  23. Disorders of ciliary motility. Am J Med Sci. 321, 3-10 (2001).">Cowan, M. J., Galdwin, M. T., Shelhamer, J. H. Disorders of ciliary motility. Am J Med Sci. 321, 3-10 (2001).
  24. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 731-739 (2010).">Jain, R., et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 731-739 (2010).
  25. Multicilin promotes centriole assembly and ciliogenesis during multiciliate cell differentiation. Nat Cell Biol. 14, 140-147 (2012).">Stubbs, J. L., Vladar, E. K., Axlerod, J. D., Kitner, C. Multicilin promotes centriole assembly and ciliogenesis during multiciliate cell differentiation. Nat Cell Biol. 14, 140-147 (2012).
  26. Myb promotes centriole amplification and later steps of the multiciliogenesis program. Development. 140, 4277-4286 (2013).">Tan, F. E., et al. Myb promotes centriole amplification and later steps of the multiciliogenesis program. Development. 140, 4277-4286 (2013).
  27. Gmnc is a master regulator of the multiciliated cell differentiation program. Curr Biol. 25, 3267-3273 (2015).">Zhou, F., Narasimhan, V., Shboul, M., Chong, Y. L., Reversade, B., Roy, S. Gmnc is a master regulator of the multiciliated cell differentiation program. Curr Biol. 25, 3267-3273 (2015).
  28. Analysis of Protein and gene expression. Methods Cell Biol. 59, 63-85 (1999).">Jowett, T. Analysis of Protein and gene expression. Methods Cell Biol. 59, 63-85 (1999).
  29. Chapter 2: Looking at Embryos. Zebrafish: A practical approach. 261, 39-58 (2002).">Schulte-Merker, S. Chapter 2: Looking at Embryos. Zebrafish: A practical approach. 261, 39-58 (2002).
  30. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (25), (2009).">Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (25), (2009).
  31. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, (2011).">Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, (2011).
  32. The tbx2a/b transcription factors direct pronephros segmentation and corpuscle of Stannius formation in zebrafish. Dev Biol. 421 (1), 52-66 (2017).">Drummond, B. E., Li, Y., Marra, A. N., Cheng, C. N., Wingert, R. A. The tbx2a/b transcription factors direct pronephros segmentation and corpuscle of Stannius formation in zebrafish. Dev Biol. 421 (1), 52-66 (2017).
  33. Imaging cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).">Jaffe, K. M., Thiberge, S. Y., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Imaging cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).
  34. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6, (2011).">Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6, (2011).
  35. Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3. J Vis Exp. (82), e51060(2013).">Sorrells, S., Toruno, C., Stewart, R. A., Jette, C. Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3. J Vis Exp. (82), e51060(2013).
  36. Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish. Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).">Schumacher, J. A., Zhao, E. J., Kofron, M. J., Sumanas, S. Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish. Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).
  37. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).">Julich, D., et al. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
  38. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, (2014).">Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, (2014).
  39. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J Vis Exp. (89), e51604(2014).">Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J Vis Exp. (89), e51604(2014).
  40. A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (93), e52063(2014).">Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (93), e52063(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiciliated CellsZebrafish EmbryoWhole Mount FISHImmunofluorescence ProtocolRNA Protein Co localizationConfocal MicroscopyODF3BAcetylated Alpha TubulinGamete TubulinPronephros Imaging

Related Articles