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방법 논문

CRISPR/Cas9 단백질의 유전자 편집에 대 한 채널 메기, Ictalurus punctatus, 배아로 microinjection

14.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56275

⸱

2018년 1월 20일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Fisheries, Aquaculture and Aquatic Sciences, Auburn University, 2Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Suez Canal University, 3Anatomy and Embryology Department, Faculty of Veterinary Medicine, Cairo University, 4Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 5Life Science Institute, University of Michigan

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

CRISPR/Cas9 시스템을 사용 하 여 채널 메기 배아에서 유전자 편집에 대 한 간단 하 고 효율적인 microinjection 프로토콜 제공 됩니다. 이 프로토콜에서 RNAs 가이드 및 Cas9 단백질 1 셀 배아의 노 른 자에 microinjected 했다. 이 프로토콜은 두 채널 메기 면역 관련 유전자를 노크 하 여 검증 되었습니다 않았습니다.

초록

채널 메기, Ictalurus punctatus의 완전 한 게놈은 되었습니다 시퀀싱, 공부 채널 메기 유전자 기능을 위한 큰 기회를 선도. 유전자 녹아웃은 공부 이러한 유전자 기능 비보를 사용 되었습니다. 클러스터는 정기적으로 짧은 구조 반복/CRISPR 관련 된 단백질 9 (CRISPR/Cas9) interspaced 시스템은 유전자의 기능을 변경할 하 genomic DNA 시퀀스를 편집 하는 데 사용 하는 강력한 도구입니다. 전통적인 접근은 microinjection 통해 단일 셀 배아로 CRISPR/Cas9 mRNA를 소개 하 동안, 메기에 느리고 비효율적인 프로세스 수 있습니다. 여기, CRISPR/Cas9 단백질으로 채널 메기 배아의 microinjection에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 간단히, 계란과 정자 수집 하 고 다음 인공 수정 수행 했다. 수정 된 난 자는 Holtfreter의 솔루션을 포함 하는 페 트리 접시로 옮겨 졌다. 사출 볼륨 보정 했다 고 RNAs/Cas9 전화/인터 루 킨 1 수용 체 포함 하는 도메인 어댑터 분자 (TICAM 1) 유전자와 rhamnose 바인딩 lectin (RBL) 유전자 1 셀 배아의 노 른 자에 microinjected은 대상으로 안내 합니다. 유전자 녹아웃 indels DNA 시퀀싱에 의해 확인 되었다 성공 했다. 이러한 돌연변이 인해 예측된 단백질 시퀀스 변경 frameshift 포함 하 고 조 정지 codons 인해 단백질을 잘립니다.

서론

Microinjection 셀 이나 유리 모 세관1통해 배아에 DNA, RNA, 단백질, 및 다른 고분자와 같은 물질의 작은 금액을 제공 하는 일반적인 실험실 기술 이다. Microinjection는 microinjector, micromanipulator, 현미경2등 특수 장비 설치를 사용 하 여 수행 됩니다. 기술은 유전자 세포내 구성 요소3,4 의 역학을 이해 하는 것을 목적으로 제 닉, 유전자 녹아웃, 유전자 치료의 세대를 통해 많은 유기 체를 수정 하려면 연구자에 의해 사용 되었습니다. , 5.

채널 메기 (Ictalurus punctatus)은 미국에서 레크리에이션 어업 활동과 양식에서 가장 인기 있는 메기 종. 거기 증가 하는 필요가 있는 채널 메기, 기능 유전체학을 연구 하 고 채널 메기의 완전 한 게놈의 연속 게놈 편집 도구6,7의 최근 발전의 유틸리티를 강화 한다. 유전자 기능을 이해만 메기에서 수행 되는 연구를 풍요롭게 하지 것 이라고 하지만 또한 이어질 수 더 효과적인 유전자 개선 프로그램 메기 산업을 향상 시키기 위해. 관심의 특정된 특성에 대 한 중요 한 유전자를 파악 하는 그들은 유전자 선택 전송 해로운 대립 유전자를 억제 하는 이러한 대립에 대 한 유익한 대립 유전자를 생성 하 게놈 편집을 통해 메기 생산을 개선 하기 위해 사용할 수 있습니다. transgenesis, 또는 이러한 옵션의 몇 가지 조합을 통해 대립에서 유리한 유전자 한 물고기의 다른 종에서 다른 상업적으로 유리한 특성에 대 한 최고의 유전자를 결합 하 여 생산성과 물고기 생산 작업8의 수익성을 크게 향상 시킬 것 이다.

유전자 녹아웃 유전자 기능 비보를 공부 하는 직접적인 방법입니다. 미래 세대는 다른 세대에 그들의 효과의 연구를 촉진 하 여 DNA 수준에서 돌연변이 상속 됩니다. 다른 게놈 편집 도구 개발된 포함 아연 손가락 nucleases (ZFNs), 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENs) 되었고 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복/CRISPR-관련 단백질 9 (CRISPR/Cas9 클러스터 ) 시스템9,10,,1112.

CRISPR/Cas9 시스템은 강력 하 고 효율적인 도구입니다 RNA 기반 사이트 DNA 분열5,13물고기에 유전자 녹아웃을 포함 하 여 게놈 DNA 시퀀스를 편집 하는 데 사용 되었습니다. 게놈에 있는 DNA endonuclease 효소, Cas9 대상된 시퀀스를 결정 하는 가이드 RNA (gRNA) 시스템에 의하여 이루어져 있다. CRISPR/Cas9 시스템 ZFNs 및 TALENs 여러 이점을 게놈에서 어떤 시퀀스를 대상으로 디자인 될 수 있다: (1) 낮은 비용 (2) 쉽게 (3) 더 특정 바인딩 대상 시퀀스에 가이드 RNA의 엔지니어링 및 감소 대상에서 돌연변이 (4) 여러 시퀀스 수 없습니다 변경 될 TALENs, 그리고 돌연변이 대 한 최대의 (6) 생식 향상 된 전송 속도 의해 접을 ZFNs 및 TALENs14에 비해 유전자에 동일한 시간 (5) 높은 mutagenesis 속도로 다른 gRNA와 함께 타겟이 될 수 있습니다. 15,,1617,18.

Microinjection에 대 한 주요 대체 방법은 이다 electroporation, 전기 자극 배아 또는 막 침투성 및 생물 학적 분자19,20의 통풍 관을 증가 하는 셀에 적용 됩니다. 여러 유전자 변형 물고기 electroporation 채널 메기, 도미 (Sparus sarba), 치 누 크 연어 (Oncorhynchus tshawytscha), zebrafish (Danio rerio), 메 다카 (Oryzias latipes)를 사용 하 여 생성 된 및 일반적인 잉어 (Cyprinus 카 르 피 오)21,22,23,,2425,26.

Electroporation은 플라스 미드 DNA, RNA, 및 Cas9 단백질 유전자 녹아웃에 대 한 제공을 사용 되었습니다. 포유류 세포, Cas9/gRNA 플라스 미드 DNA에서 Cas9 mRNA/gRNA, 및 Cas9 단백질/gRNA 단지 electroporation를 사용 하 여 전달 했다 되었고 mutagenesis 요금 대부분 electroporation 테스트 조건27Cas9 단백질/gRNA 복합물을 사용 하 여 높은. Ascidian 척 (Ciona intestinalis) 구문 표현 TALENs 여러 유전자28의 녹아웃을 유도 하기 위해 수정 된 계란에 electroporated 했다. ZFNs 플라스 미드 구조 표현 electroporated 채널 메기29황 호르몬 밖으로 노크를 했다. 그러나, 일단 세포에 도입, 플라스 미드 구조 필요 합니다 RNA를 변하게 하 여 RNA의 microinjection에 비해 mutagenesis의 시간 지연 가능성이 것 원하는 DNA 시퀀스 대상 기능 단백질에 변환 / 단백질입니다. 배아 개발 지연된 mutagenesis 주입된 설립자의 mosaicism을 증가 합니다. 또한, 유전자 변형 식 가능 microinjection, mutagenesis 효율을 낮추는 식 수준 달성 가능성이 크다.

수단으로 세포로 게놈 편집 도구를 도입, microinjection electroporation에 몇몇 이점이 있다. 게놈 분자 편집 셀 또는 microinjection30통해 배아에 안정적으로 도입 될 수 있습니다. 적은 주입 재료 필요 합니다. 주입 하는 재료의 양을 결정 하는 것이 쉽습니다. 높은 돌연변이 설립자 물고기에 낮은 mosaicism 요금 수 F1에 돌연변이의 생식 전송을 개선 하는 것을 달성. 적은 설립자 물고기 생산 1 세대의 높은 돌연변이 비율 때문에 분석 될 필요가 있다. Electroporation, 더 많은 설립자 물고기 필요가 분석 비용을 증가 합니다. 그러나, microinjected 채널 메기 배아의 생존 보다 낮습니다 electroporated 것 들, 하지만이 더 많은 배아31,32를 주입 하 여 극복할 수 있습니다. 채널 메기, 노 른 자 microinjected 태아 대상 유전자에 따라 55%, 16에서 240의 생존 및 gRNA/Cas9 단백질32의 복용량

그러나 메기 배아의 일반 microinjection는 기술적으로 요구 하 고 시간이 걸리고,, 신속 하 고 효율적인 CRISPR/Cas9 단백질 microinjection 프로토콜은 채널 메기 배아에 대 한. 이 프로토콜 CRISPR/Cas9 단백질 해결책은 한 셀 배아의 노른자위에 주입 이후 적은 시간과 전문성을 요구 한다. 수정 된 난 자 수백 1 h (약 발생을 첫 번째 세포 분열에 필요한 시간)에 주입 수 있습니다. 프로토콜의 유효성을 검사 하려면 두 질병 민감성 관련 유전자 채널 메기, 수신자/인터 루 킨 1 수용 체 포함 하는 도메인 어댑터 분자 (TICAM1) 유전자와 rhamnose 바인딩 lectin (RBL) 유전자에 제압 했다. TICAM 1은 신호 통로 통행세 같이 수용 체 (TLR) 3에 의해 시작에 관여. 채널 메기, TICAM 1는 극적으로 upregulated downregulated 블루 메기, E. ictaluri33종 저항에 했다 Edwardsiella ictaluri, 세균 문제를 다음 이었다. 어디 급성 RBL Flavobacterium columnare의 columnaris 병의 원인이 되는 대리인으로 초기 감염에 중요 한 역할을 재생 하 고 강력한 upregulation에 비해 columnaris 취약 채널 메기 스트레인에 기록 된 한 columnaris 저항 스트레인34

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프로토콜

이 실험은 물고기 유전학 연구 단위, E. W. 셸 수 산 연구 센터, 오 번 대학, 알에서 실시 했다. 실험을 시작 하기 전에이 실험에 사용 되는 모든 실험 프로토콜은 어 번 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC AU)에 의해 승인 되었다. 장비 및 공급이이 실험에 사용 된 목록 자료 테이블에서 찾을 수 있습니다. 다음은 단계 및 절차 준비 및 채널 메기 1 셀 배아의 microinjection 그림 1에서 볼 수 있듯이.

1. 가만히 재고 선택 및 산란

  1. 긴장 또는 관심의 유전 라인에서 건강 채널 메기 쪽 주식을 선택 하십시오. 채널 메기 남성과 여성 좋은 보조 성 특성을 전시 한다.
  2. 잘 발달 된 생식 기 시와 그들의 시체의 나머지 부분 보다 더 광범위 한 근육 머리 남성을 선택 합니다. 어두운 색깔, 흉터 및 영토 싸움에서 상처 또한 성적 준비의 징후입니다. 그들의 시체의 나머지 부분 보다 좁은 머리 여성을 선택 하 고 부드러운, 만져 서, 잘 둥근 복 부를가지고. 정확성에 대 한 초기 처리 동안 물고기를 강조 하지 않으려면, 중지 먹이 여성은 산란에 대 한 그들의 준비 완료 상태를 검토 하기 전에 2-3 일.
  3. 빨리, 하지만 신중 하 게 처리 하는 물고기를 수행 합니다. 스트레스를 줄이기 위해 처리, 처리 여성 가방 (32 m m 크기 메쉬) 산란에서 물고기를 잡고 있는 동안 필요로 하는 모든 절차를 수행 합니다.
  4. 배 란 유도 호르몬 주사의 바로 전에 암컷의 몸 무게를 측정 합니다.
  5. 지속적인 물 흐름 및 적절 한 폭 기 탱크를 통해 흐름에 내부 암컷과 산란 가방을 걸어.
  6. Aseptically, implanter 황 호르몬 방출 호르몬 아날로그 (LHRHa) 임 플 란 트의 85 µ g/k g으로 14 G 바늘을 로드 합니다. 0.9% 멸 균 생리 식 염 수 주사 전에 사출 사이트 (등 쪽 근육) 린스 합니다. implanter 45 ° 각도로 삽입 하 고는 임 플 란 트를 출시. 바늘과 슬쩍 사출 사이트 이전 70% 에탄올에 흠뻑 목화 공 철회.
  7. 장소 지주 탱크에서 산란 가방 물고기 완전히에 빠져들 수 있도록 물 물 표면의 밑에 15-20 cm. (위 해산 5 ppm 산소) 적절 한 환기와 좋은 수 질은 고품질 계란의 배 란에 대 한 중요 합니다.
  8. 도 시간 (h) 관계35를 사용 하 여 물 온도에 따라 배 란 시간을 예측 합니다. 학위-h 응답 시간 = 호르몬 주사와 배 란 (h) 사이의 시간 * 물 온도 (° C). 예를 들어, 900-1000의 학위 h 응답 시간에 대 한 여성 것으로 예상 된다 25 ° c.에 호르몬 주입 시간에서 36-40 h에서 산란 일반적으로, 계란에 대 한 첫 번째 검사에서 호르몬 주사 후 약 36 h 그리고 4 h 간격에서 이루어집니다.
  9. 배 란을 확인 하려면 동안 산란 가방 안에 부착 된 계란에 대 한 찾고 있습니다 부드럽게 수 면 위에 산란 가방을 들어올립니다. 10 알을 보고이 여자는 일해야 하 고 핸드 스트립 준비 나타냅니다.

2. 정자의 준비

참고: 정자 예상된 배 란 시간 전에 몇 h를 준비 수 있습니다.

  1. 마 취 없이 머리에 충격 타격에 의해 안락사 남성 때문에 마 취 정자 운동에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
  2. 작은 무게 팬에 testes 수집, 모든 조직을 제거 하 고 필요한 경우 0.9% 염 분 제거, 혈액의 50 mL와 함께 그들을 씻어. 잘 발달 된 고환 많은 villiform 계획 ( 그림 2)와 흰색입니다.
  3. Testes의 무게를 결정 합니다.
  4. 달걀의 수정에 대 한 정자 솔루션을 준비, 집게를 사용 하 여 100 cm2 100 µ m 메시의 센터에 testes을 전송. 배 안에, 호감 testes와 메쉬 testes 고 50 mL 수집 관으로 정자를 필터링 합니다. 이것은 testes 엄지손가락 통해 컬렉션 튜브의 테두리에 대 한 메시 내부에 압력을 적용 하 여 행 해질 수 있다. 0.9% 생리 식 염 수를 사용 하 여 컬렉션 튜브에 메쉬에서 정자를 세척. 생리 식 염 수는 최대 10 mL/g testes의 추가할 수 있습니다.
  5. 정자의 농도 결정, 운동 성 및 생존 능력을 확인 합니다.
    참고: 농도 milt는 hemocytometer를 사용 하 여 알려진된 희석된 양의에 정자 세포를 계산 하 여 확인할 수 있습니다. 또는, 정자 밀도 milt는 분 광 광도 계를 사용 하 여 광학 밀도 계산 하 여 추정 될 수 있습니다. 이 방법에서는, 505 nm 파장에서 흡수 이전 정자36의 다른 농도의 흡수를 위해 준비 된 제어 차트와 비교 됩니다. 정자의 운동 성 정자 운동 (운동 성 기간 이라고 함)37의 정지까지 정자의 활성화에서 시간으로 현미경 아래에서 확인할 수 있습니다. 정자의 생존 가능한 정자 흠 없는 유지 됩니다만 비 가능한 정자 세포를 얼룩이 trypan 파랑, 같은 선택적 염료와 정자를 얼룩에 의해 확인할 수 있습니다. 그러나, 이러한 microinjection 절차에 대 한 이것은 testes 잘 발달 하는 경우에, 필요입니다.
  6. 4 ° C에서 2.5 단계에서 0.9% 염 분에서 정자를 저장 하 고 준비 후 24 시간 이내에 사용.

3. 계란 수집 및 수정

  1. 야채 깨끗 하 고 마른 팬을 산란 20 cm 직경에 단축의 매우 얇은 레이어를 적용 합니다.
  2. 나트륨 중 탄산염으로 버퍼링 된 tricaine 메탄 된의 100 ppm 포함 된 마 취 솔루션에 여성을 배치 (최종 해결책의 pH는 7.0 있어야 함) 물고기는 완전히 마 취38까지.
    주의: Tricaine 메탄 된 흡입, 섭취 또는 피부를 통해 흡수 하는 경우에 자극적 수 있습니다.
  3. 신중 하 게, 산란 가방에서 물고기를 제거 하 고 마 취 솔루션을 씻어 0.9% 식 염 수에 그것을 찍어. 건조 한 물고기 물고기 몸 표면에 점액 층의 제거를 피하고, 깨끗 한 수건을 사용 하 여 완전히.
  4. 환기, 골반 탄 미 익, 핸드 스트립 하는 동안 계란의 부착을 방지 하기 위해를 포함 하 여 주변 지역에 야채 단축을 적용 됩니다.
  5. 손 난소에 부드러운 압력을 적용 하 여 산란 기름칠된 냄비에 계란을 제거 합니다. 좋은 계란 한다 자유롭게, 색상, 황금 황색 수 있고 최소한의 비슷하게 덩어리 또는 혈전 (그림 2). 물 micropyle 폐쇄 자극으로 계란과 수정, 전에 물 사이의 접촉을 피하십시오.
  6. Microinjection에 대 한 계란을 기름 지 게, 산란 팬 기름칠된을 200-300 계란을 전송. 기름칠된 플라스틱 공장 레이블 산란 기름칠된 냄비에 계란을 전송 하는 숟가락으로 사용할 수 있습니다. 달걀 (2.5 단계)에서 정자 솔루션의 1-2 mL을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 계란에 정자의 비율이 약 11000 정자/계란 해야 합니다.
  7. 정액 및 계란 활성화를 계란에 담 수를 추가 합니다. 약간 계란을 충당 하기 위해 충분히 물을 추가 합니다. 30 미 수정 1-2 분에 발생 해야 합니다에 대 한 부드럽게 계란을 소용돌이 친다. 그것은 층에서 배열 되는 계란을 기름 지 게 해야 합니다. 메기 계란 서로 어려운 배아의 여러 레이어를 microinject 하 고 준수 합니다.
  8. 수정 된 달걀에 담 더 추가 하 고 10-15 분에 대 한 보안을 강화 하는 계란을 허용.
  9. 젖은 수건 건조를 방지 하 고 몇 시간 동안 비 옥 하 여 나머지 unfertilized 계란을 포함 된 산란 팬 커버. 수정 정열 방식으로 할 수 있습니다, 그리고 200-300 계란 수의, 1 개의 배치 microinjection 및 비 주입 제어 배아에 대 한 하나의 셀 단계에서 배아의 지속적인 공급을 보장 하기 위해 매 30-60 분을 수정 하는 예. 계란은 어려운 그들을 제거 하 고 젖은 수건을 준수 수 있습니다 젖은 수건와 계란 사이 접촉을 하지 마십시오. 이 프로토콜에서 계란 제거 후 2-3 h 이내 수정 된 microinjected 효율적으로 했다 하 고 스트립 후 즉시 수정 된 달걀으로 비슷한 성공을 했다.

4입니다. 바늘 고 로드

  1. 2 바늘 (그림 3)에 1.0 m m OD 붕 규 산 유리 모 세관 당겨. 스폰지는 여러 절 개 한 조각으로 종이 상자에 있는 바늘을 저장 합니다. 바늘을 위반을 피하기 위해, 스폰지의 직경 바늘 줄기의 길이 보다 작은 되어야 합니다.
  2. 날카로운 개체를 사용 하는 바늘의 얇은 영역의 작은 조각 끊어서 바늘 팁을 엽니다. 또는, 현미경 집게와 팁의 얇은 지역에서 곤란 하 여 바늘을 엽니다.
  3. Cas9 단백질으로 gRNA(s)를 혼합 하 여 주입 솔루션을 준비 합니다. RNA 또는 단백질의 다른 종류는 또한 동일한 절차와 주입 수 있습니다. 이 프로토콜에서 gRNAs 채널 메기 면역 관련된 유전자, 수신자/인터 루 킨 1 수용 체 포함 하는 도메인 어댑터 분자 (TICAM1) 유전자와 rhamnose 바인딩 lectin (RBL) 유전자의 두 대상으로 설계 되었고 샤 외에 따라 준비. 와 고화질 Taq 중 합 효소32,39의 사용. GRNAs에 대 한 게놈 대상 되었고 5' GGA GGT GAA GCA CGT CGA GGA 3' TICAM 1 유전자 (그림 4)에 대 한 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' protospacer 인접 한 모티브 (PAM) RBL 유전자의 exon 1 시퀀스 밑줄된 (그림 6)에 대 한.
    1. 채널 메기 게놈 비교 폭발 가이드 RNA 목표 시퀀싱을 아무 잠재적인 대상 오프 사이트를 선택 합니다.
    2. 페 놀 레드 gRNA/Cas9 단백질 총 볼륨의 1/3을 섞어 색을 추가 합니다.
    3. 각 태아 50 주입 nuclease 무료 수 gRNA/Cas9 단백질 혼합의 최종 농도 조정 nL 약 2.5 ng gRNA 및 7.5 ng Cas9 단백질을 포함. 사용 하기 전에 얼음에 10 분을 위한 혼합물을 품 어.
  4. Microloader, 로드 5-10 µ L gRNA/Cas9 혼합물의 주사 바늘으로 바늘 줄기에는 microloader를 삽입 하 고 microloader 팁 (그림 3)을 제거 하는 동안 천천히 혼합물을 추방. 내부 공기 방울 트래핑 하지 마십시오.
  5. 바늘 micropipette 홀더를 부착 하 고 꽉 연결 다음 소유자는 micromanipulator 연결할. 무료 안정적인 움직임을 확인 하십시오. 질소 실린더를 열고 압력 레 귤 레이 터를 조정 하 여 microinjection에 대 한 압력을 적용.
    참고: 볼륨 주입의 압력, 바늘 조리개의 지름과 사출의 기간에 의해 달라질 수 있습니다. 주입, 주입 한 hemocytometer에 미네랄 오일 한 방울을 볼륨을 결정 합니다. 필요한 경우, 압력, 주입, 및 바늘 직경의 기간을 주사의 볼륨을 늘리거나 조정할 수 있습니다. 일관 된 볼륨을 보장 하기 위해 미네랄 오일에 여러 번 주사.

5입니다. 메기 배아의 microinjection

  1. 야채 깨끗 한 100 mm 페 트리 접시에 단축의 매우 얇은 레이어를 적용 합니다.
  2. 기름칠된 플라스틱 공장 레이블을 사용 하 여, 페 트리 접시에서 수정 팬 50-100 계란을 전송 하 고 Holtfreter의 솔루션 (자료 테이블)와 함께 그들을 커버. 단일 레이어에 서로 대 한 계란을 맞춥니다. 이 정렬 microinjection 과정 자리에 계란을 개최 한다.
  3. 현미경의 스테이지는 달걀으로 페 트리 접시를 놓고 한 손으로 그것을 잡고. 그것은 단일 부드러운 움직임에는 chorion 및 노른자위를 피어 때까지 다른 손으로 (그림 3) 바늘을 낮춥니다. 바늘의 팁은 blastodisc에 가능한 한 가까이 주입 재료를 배달 하기 전에 해야 합니다.
    1. 노 른 자에 주입 재료를 제공 하는 페달 우울 Blastodisc는 명확 하 게 표시 되지 않는 경우에, 주입 재료는 노른자위에서 다른 위치에 퍼질 수 있다. 그렇게 하려면, 노 른 자의 맨 끝에 바늘이 삽입 후 페달을 우울 하 고 바늘을 철회 할 수 있습니다 동시에 노른자위의 다른 영역을 통해 주입 물질 확산. 그러나 50 nanoliters까지 투입 될 수 있는 채널 메기의 노른자위 태아,, gRNA/Cas9 단백질의 양을 각 유전자 돌연변이 율 및 배아 생존32에 대 한 최상의 결과 달성 하기 위해 최적화가 필요한.
  4. 바늘을 원활 하 게 철회 계란을 손상 시킬 수 없습니다. 동일한 절차와 다른 계란 투입 하 페 트리 접시를 이동 합니다. 이 계란을 손상 될 수 있습니다 또는 휴식 바늘 주입 과정에서 페 트리 접시의 움직임을 피하십시오. 파열 되거나 microinjection으로 인해 손상 되는 계란을 제거 합니다. 사출 수정 후 15-20 분에 시작 될 수 있다 고 배아 (수정 후 약 60-90 분)까지 한 셀 단계에 아직도 있는 계속.
  5. Doxycycline40화까지 6-7 일에 대 한 지속적인 부드러운 폭의 10 ppm와 Holtfreter의 솔루션에 주입 된 배아를 배치 합니다. 매일 솔루션을 변경 하 고 죽은 태아를 제거 합니다.

6. 돌연변이 탐지

  1. 임의로, 72 h 게시물 수정에서 여러 주입된 태아를 수집 하 고 노른자위를 제거 하 고, genomic DNA를 추출. 제어로 3-5 비 주입 태아를 포함 합니다.
    참고: 게놈 DNA는 추출할 수 있습니다 배아에서 달걀 껍질과 노 른 자 소재 K 성분 소화와 에탄올 강수량32를 사용 하 여 제거 후.
  2. 측면에 서는 돌연변이, 고 충실도 Taq 중 합 효소32를 사용 하 여 발생할 것으로 예상 된다, 각 유전자의 gRNA에 대 한 게놈 목표 DNA 세그먼트를 증폭. TICAM 1, 뇌관 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG에 대 한 3' (앞으로)와 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (반전)를 사용한 증폭 한 750 bp RBL, 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 뇌관에 3' (앞으로)와 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (반전)에 사용 된 RBL 유전자에서 375 bp 세그먼트를 증폭.
    1. 다음 PCR 반응 사용: 최대 20 µ L PCR 학년 물; 1 x 고 충실도 Taq 효소 반응 버퍼 MgCl2, 0.2 m m dNTP와 혼합, 고 충실도 Taq 효소 혼합의 1.25 단위, 100-300 ng genomic DNA 및 동일한 집합의 정방향 및 역방향 뇌관의 각각 0.4 µ M. PCR 순환 조건 수행: 3 분;에 대 한 94 ° C에서 초기 변성 30 대 94 ° C에서 변성의 35 주기 55 60 ° C에서 어 닐 링 s s TICAM, 및 40 RBL, 1 분/kb; 72 ° C에서 확장에 대 한 s 그리고 10 분 동안 72 ° C에서 최종 확장.
  3. 순화 된 PCR 제품, 측량 돌연변이 탐지 분석 결과, heteroduplex 이동성 분석 결과, 제한 효소 인식 사이트의 손실의 연속 같은 돌연변이 검출 방식 또는 다른 어떤 돌연변이 탐지 메서드를 사용 하 여 돌연변이 배아를 감지 대상에 대 한 적절 한. 이 프로토콜에서 돌연변이 배아 TICAM 1 및 RBL 유전자에 대 한 정화 PCR 제품의 연속으로 제한 효소 SapI 잘라 사이트의 손실에 대 한 측량 돌연변이 탐지 분석 결과 사용 하 여 검색.
  4. 돌연변이 체 대립 유전자를 식별 하려면 PCR 제품 및 개별 식민지에서 시퀀스 벡터를 복제. 그림 4 와 그림 6 에 제시 하는 돌연변이 체 대립 유전자 주입 된 배아에서 왔다. 6에서 PCR 제품 microinjected 및 각 유전자에 대 한 3 제어 배아 TICAM 1 및 RBL 유전자 시퀀싱, 8을 포함 하 여 48 벡터에 대 한 두 개의 별도 튜브, microinjected 배아에 대 한 하나, 고 86 벡터 제어 배아, 빠르게 복제에 대 한 다른에 풀링된 했다 시퀀싱 각 유전자에 대 한 3 제어 주입 비 배아에서 반응.
  5. 다른 돌연변이 체 대립 유전자를 식별 하기 위해 돌연변이 배아에서 시퀀스 폭발 또는 T-커피 등 어떤 DNA 순서 정렬 도구를 사용 하 여 야생 타입 시퀀스를 비교 합니다.

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결과

Microinjection 프로토콜의 효율성을 보여 채널 메기 수신자/인터 루 킨 1 수용 체 포함 하는 도메인 어댑터 분자 (TICAM1) 유전자와 rhamnose 바인딩 lectin (RBL) 유전자를 대상으로 설계 된 gRNAs microinjected 했다.

TICAM 1
DNA 시퀀싱 풀링된, 복제 PCR 제품에서 개별 식민지에서 벡터의 TICAM 1 유전자에 유도 indel 돌연변이 밝혔다. 돌연변이 율 분석 24 개인에 79% 이었다. 돌연변이의 예는 그림 4 및 그림 5에 설명 됩니다. Indel 채널 메기의 시퀀스를 코딩 하는 TICAM1 유전자에 있는 돌연변이의 효과 예측된 단백질에 길이 ...

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토론

채널 메기 배아 유전자 녹아웃을 달성 하기의 microinjection에 대 한 상세한 프로토콜을 제시 했다. 노 른 자에 CRISPR/Cas9 단백질의 주입 훨씬 간단 하 게, 시간, 그리고 대부분 유전자 이동 및 유전자 물고기와 편집을 위한 일반적인 기법 1 셀 배아의 blastodisc microinjecting에 비해 광범위 한 훈련을 필요로 하지 않습니다. 30 , 42. 현재 프로토콜 채널 메기 TICAM 1 및 RBL 유전자에에서 indels 유도에 성공 하려면 입증. 이러한 안정적이 고 효과적인 절차 채널 메기에서 미래의 유전자 녹아웃을 생성 하기 위한 기초를 하다. 프로토콜은 다른 유전자 CRISPR/Cas9 시스템을 사용 하 여 채널 메기 게놈 또는 메기, 중재 tol2 transgenesis 같은 다른 유전자 기술을 적응에 대 한 대상으로 수정할 수 있습니다. 그것은 또한 가치 평가 블루 메기 (I...

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공개 사항

저자 들은 전혀 상충 선언 합니다.

감사의 글

이 연구는 미국 농 무부 NIFA 수상 2015-67015-23488 로저 콘에 의해 투자 되었다. 저자는 박사 로널드 펠프스 비디오에 가만히 재고 선택 기준의 설명 감사. 아메드 Elaswad과 카림 칼 릴 박사 연구 자금에 대 한 워싱턴 DC에서 이집트 문화 및 교육 국에 감사 하 고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Reproboost 임플란트해양 생명 공학메기 암컷의 배란 유도를 위한 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 아날로그(LHRHa)
TRICAINE-SWestern Chemical. Inc.호르몬 주입 및 알 제거 중 무리 스톡 물고기의 진정을 위해. 
페놀 레드Sigma-AldrichP02900.5%, 멸균 필터링
스테레오 현미경Olympus213709마이크로 주입 중 알을 시각화하기 위해
MicroinjectorASI-Applied Scientific Instrumentation 모델 MPPI-3배아로의 주입 재료 전달을 위해
MicromanipulatorASI-Applied Scientific Instrumentation 모델 MM33 주사 바늘의 움직임을 잡고 제어하는 데 사용됩니다. 
Eppendorf MicroloaderEppendorf5242956.003마이크로 주입 바늘에 주입액을 주입하는 용도.
수직 바늘 풀러David Kopf Instruments모델 720마이크로 주입 바늘 풀링 Cas9
단백질PNA Bio Inc. CP01연쇄상구균 발열유전자의 재조합 Cas9 단백질.
High FidelityPLUS PCR 시스템 확장  Roche Diagnostics, 미국gRNA 준비에 사용되는 DNA 템플릿의 PCR 및 증폭을 위해
붕규산 유리 모세관Fisher Scientific1mm 외경(OD), 마이크로주사 바늘 제작용.
페트리 접시VWR25384-302미세 주입 중 배아를 잡기 위해.
CriscoThe J.M. Smucker Company산란 팬 및 페트리 접시 코팅을 위한 야채 쇼트닝. 
Holtfreter의 해결책홈메이드59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4를 사용하여 미세주입된 배아를 부화시킬 때까지 배양합니다.
Doxycycline hyclate USP (monohydrate)Letco Medical690904세균 감염을 예방하기 위해 Holtfreter의 용액에 항생제를 10ppm 첨가했습니다.
센터 채널

참고문헌

  1. Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
  2. Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. Components of a microinjection system. , Cold Spring Harb. Protoc. 935-939 (2011).
  3. Du, S. J., et al. Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an "all fish" chimeric growth hormone gene construct. Nat. Biotechnol. 10 (2), 176-181 (1992).
  4. Davis, B., Brown, D., Prokopishyn, N., Yannariello-Brown, J. Micro-injection-mediated hematopoietic stem cell gene therapy. Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (4), 412-419 (2000).
  5. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  6. Liu, Z., et al. The channel catfish genome sequence provides insights into the evolution of scale formation in teleosts. Nat. Commun. 7, (2016).
  7. Abdelrahman, H., et al. Aquaculture genomics, genetics and breeding in the United States: current status, challenges, and priorities for future research. BMC Genomics. 18 (1), 191(2017).
  8. Dunham, R. A. Aquaculture and Fisheries Biotechnology : Genetic Approaches. , 2nd, CABI. (2011).
  9. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat. Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  10. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  11. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  12. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Cradick, T. J., Fine, E. J., Antico, C. J., Bao, G. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res. 41 (20), 9584-9592 (2013).
  16. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  17. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  18. Li, M., Zhao, L., Page-McCaw, P. S., Chen, W. Zebrafish genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Trends Genet. 32 (12), 815-827 (2016).
  19. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841(1982).
  20. Powers, D. A., et al. Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 301-308 (1991).
  21. Inoue, K., et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Differ. Dev. 29 (2), 123-128 (1990).
  22. Buono, R., Linser, P. Transient expression of RSVCAT in transgenic zebrafish made by electroporation. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 271-275 (1991).
  23. Sin, F., et al. Gene transfer in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA. Aquaculture. 117 (1-2), 57-69 (1993).
  24. Dunham, R. A., et al. Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel catfish Ictalurus punctatus possessing cecropin genes. Mar. Biotechnol. 4 (3), 338-344 (2002).
  25. Lu, J. K., Fu, B. H., Wu, J. L., Chen, T. T. Production of transgenic silver sea bream (Sparus sarba) by different gene transfer methods. Mar. Biotechnol. 4 (3), 328-337 (2002).
  26. Cheng, Q., et al. Interaction of diet and the masou salmon Δ5-desaturase transgene on Δ6-desaturase and stearoyl-CoA desaturase gene expression and N-3 fatty acid level in common carp (Cyprinus carpio). Transgenic Res. 23 (5), 729-742 (2014).
  27. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J. Biotechnol. 208, 44-53 (2015).
  28. Treen, N., et al. Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts by TALEN electroporation provide new approaches to investigating gene function in Ciona. Development. 141 (2), 481-487 (2014).
  29. Qin, Z., et al. Editing of the luteinizing hormone gene to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using a modified zinc finger nuclease technology with electroporation. Mar. Biotechnol. 18 (2), 255-263 (2016).
  30. Qin, Z. Gene editing of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone and gonadotropin-releasing hormone genes to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 technologies. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2015).
  31. Dunham, R. A., Winn, R. N. Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. Pinkert, C. A. , Elsevier BV. Amsterdam. 308-336 (2014).
  32. Elaswad, A. Genetic technologies for disease resistance research and enhancement in catfish. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2016).
  33. Baoprasertkul, P., Peatman, E., Somridhivej, B., Liu, Z. Toll-like receptor 3 and TICAM genes in catfish: species-specific expression profiles following infection with Edwardsiella ictaluri. Immunogenetics. 58 (10), 817-830 (2006).
  34. Thongda, W., Li, C., Luo, Y., Beck, B. H., Peatman, E. L-rhamnose-binding lectins (RBLs) in channel catfish, Ictalurus punctatus: Characterization and expression profiling in mucosal tissues. Dev. Comp. Immunol. 44 (2), 320-331 (2014).
  35. Phelps, R. P., et al. Effects of temperature on the induced spawning of channel catfish and the production of channel× blue catfish hybrid fry. Aquaculture. 273 (1), 80-86 (2007).
  36. Poole, W., Dillane, M. Estimation of sperm concentration of wild and reconditioned brown trout, Salmo trutta L. Aquacult. Res. 29 (6), 439-445 (1998).
  37. Billard, R. Spermatogenesis and spermatology of some teleost fish species. Reprod. Nutr. Dev. 26 (4), 877-920 (1986).
  38. Coyle, S. D., Durborow, R. M., Tidwell, J. H. Anesthetics in aquaculture. , Southern Regional Aquaculture Center Publication 3900. Stoneville, Mississippi. (2004).
  39. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nat. Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  40. Armstrong, J., Duhon, S., Malacinski, G. Developmental Biology of the Axolotl. , 220-227 (1989).
  41. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J. Vis. Exp. (46), (2010).
  42. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055(2016).
  43. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).
  44. Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. Biology and Culture of Channel Catfish. 34, Elsevier. 69-94 (2004).
  45. Su, B., et al. Relative effectiveness of carp pituitary extract, luteininzing hormone releasing hormone analog (LHRHa) injections and LHRHa implants for producing hybrid catfish fry. Aquaculture. 372, 133-136 (2013).
  46. Aluru, N., et al. Targeted mutagenesis of aryl hydrocarbon receptor 2a and 2b genes in Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus). Aquat. Toxicol. 158, 192-201 (2015).
  47. Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
  48. Edvardsen, R. B., Leininger, S., Kleppe, L., Skaftnesmo, K. O., Wargelius, A. Targeted mutagenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) using the CRISPR/Cas9 system induces complete knockout individuals in the F0 generation. PLoS ONE. 9 (9), e108622(2014).
  49. Li, M., et al. Efficient and heritable gene targeting in tilapia by CRISPR/Cas9. Genetics. 197 (2), 591-599 (2014).
  50. Zhong, Z., et al. Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp. Sci. Rep. 6, (2016).
  51. Chakrapani, V., et al. Establishing targeted carp TLR22 gene disruption via homologous recombination using CRISPR/Cas9. Dev. Comp. Immunol. 61, 242-247 (2016).
  52. Lim, J., Ghadessy, F. J., Yong, E. A novel splice site mutation in the androgen receptor gene results in exon skipping and a non-functional truncated protein. Mol. Cell. Endocrinol. 131 (2), 205-210 (1997).
  53. Gatfield, D., Unterholzner, L., Ciccarelli, F. D., Bork, P., Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. The EMBO Journal. 22 (15), 3960-3970 (2003).
  54. Talerico, M., Berget, S. M. Effect of 5'splice site mutations on splicing of the preceding intron. Mol. Cell. Biol. 10 (12), 6299-6305 (1990).

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