CRISPR/Cas9 단백질의 유전자 편집에 대 한 채널 메기, Ictalurus punctatus, 배아로 microinjection

요약

CRISPR/Cas9 시스템을 사용 하 여 채널 메기 배아에서 유전자 편집에 대 한 간단 하 고 효율적인 microinjection 프로토콜 제공 됩니다. 이 프로토콜에서 RNAs 가이드 및 Cas9 단백질 1 셀 배아의 노 른 자에 microinjected 했다. 이 프로토콜은 두 채널 메기 면역 관련 유전자를 노크 하 여 검증 되었습니다 않았습니다.

초록

채널 메기, Ictalurus punctatus의 완전 한 게놈은 되었습니다 시퀀싱, 공부 채널 메기 유전자 기능을 위한 큰 기회를 선도. 유전자 녹아웃은 공부 이러한 유전자 기능 비보를 사용 되었습니다. 클러스터는 정기적으로 짧은 구조 반복/CRISPR 관련 된 단백질 9 (CRISPR/Cas9) interspaced 시스템은 유전자의 기능을 변경할 하 genomic DNA 시퀀스를 편집 하는 데 사용 하는 강력한 도구입니다. 전통적인 접근은 microinjection 통해 단일 셀 배아로 CRISPR/Cas9 mRNA를 소개 하 동안, 메기에 느리고 비효율적인 프로세스 수 있습니다. 여기, CRISPR/Cas9 단백질으로 채널 메기 배아의 microinjection에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 간단히, 계란과 정자 수집 하 고 다음 인공 수정 수행 했다. 수정 된 난 자는 Holtfreter의 솔루션을 포함 하는 페 트리 접시로 옮겨 졌다. 사출 볼륨 보정 했다 고 RNAs/Cas9 전화/인터 루 킨 1 수용 체 포함 하는 도메인 어댑터 분자 (TICAM 1) 유전자와 rhamnose 바인딩 lectin (RBL) 유전자 1 셀 배아의 노 른 자에 microinjected은 대상으로 안내 합니다. 유전자 녹아웃 indels DNA 시퀀싱에 의해 확인 되었다 성공 했다. 이러한 돌연변이 인해 예측된 단백질 시퀀스 변경 frameshift 포함 하 고 조 정지 codons 인해 단백질을 잘립니다.

서론

Microinjection 셀 이나 유리 모 세관¹통해 배아에 DNA, RNA, 단백질, 및 다른 고분자와 같은 물질의 작은 금액을 제공 하는 일반적인 실험실 기술 이다. Microinjection는 microinjector, micromanipulator, 현미경²등 특수 장비 설치를 사용 하 여 수행 됩니다. 기술은 유전자 세포내 구성 요소^3,4 의 역학을 이해 하는 것을 목적으로 제 닉, 유전자 녹아웃, 유전자 치료의 세대를 통해 많은 유기 체를 수정 하려면 연구자에 의해 사용 되었습니다. ^{, 5}.

채널 메기 (Ictalurus punctatus)은 미국에서 레크리에이션 어업 활동과 양식에서 가장 인기 있는 메기 종. 거기 증가 하는 필요가 있는 채널 메기, 기능 유전체학을 연구 하 고 채널 메기의 완전 한 게놈의 연속 게놈 편집 도구^6,7의 최근 발전의 유틸리티를 강....

프로토콜

이 실험은 물고기 유전학 연구 단위, E. W. 셸 수 산 연구 센터, 오 번 대학, 알에서 실시 했다. 실험을 시작 하기 전에이 실험에 사용 되는 모든 실험 프로토콜은 어 번 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC AU)에 의해 승인 되었다. 장비 및 공급이이 실험에 사용 된 목록 자료 테이블에서 찾을 수 있습니다. 다음은 단계 및 절차 준비 및 채널 메기 1 셀 배아의 microinjection 그림 1에서 볼 수 있듯이.

1. 가만히 재고 선택 및 산란

1. 긴장 또는 관심의 유전 라인에서 건강 채널 메기 쪽 주식을 선택 하십시오. 채널 메기 남성과 여성 좋은 보조 성 특성을 전시 한다.
2. 잘 발달 된 생식 기 시와 그들의 시체의 나머지 부분 보다 더 광범위 한 근육 머리 남성을 선택 합니다. 어두운 색깔, 흉터 및 영토 싸움에서 상처 또한 성적 준비의 징후입니다. 그들의 시체의 나머지 부분 보다 좁은 머리 여성을 선택 하 고 부드러운, 만져 서, 잘 둥근 복 부를가지고. 정확성에 대 한 초기 처리 동안 물고기를 강조 하지 않으려면, 중지 먹이 여성은 산란에 대 한 그들의 준비 완료 상태를 검토 하기 전에 2-3 일.
3. 빨리, 하....

결과

Microinjection 프로토콜의 효율성을 보여 채널 메기 수신자/인터 루 킨 1 수용 체 포함 하는 도메인 어댑터 분자 (TICAM1) 유전자와 rhamnose 바인딩 lectin (RBL) 유전자를 대상으로 설계 된 gRNAs microinjected 했다.

TICAM 1
DNA 시퀀싱 풀링된, 복제 PCR 제품에서 개별 식민지에서 벡터의 TICAM 1 유전자에 유도 indel 돌연변이 밝혔다. 돌연변이 율 분석 24 개인에 79% 이었다. 돌연변이의 예는 그림 4 및 그림 5에 설명 됩니다. Indel 채널 메기의 시퀀스를 코딩 하는 TICAM1 유전자에 있는 돌연변이의 효과 예측된 단백질에 길이 .......

토론

채널 메기 배아 유전자 녹아웃을 달성 하기의 microinjection에 대 한 상세한 프로토콜을 제시 했다. 노 른 자에 CRISPR/Cas9 단백질의 주입 훨씬 간단 하 게, 시간, 그리고 대부분 유전자 이동 및 유전자 물고기와 편집을 위한 일반적인 기법 1 셀 배아의 blastodisc microinjecting에 비해 광범위 한 훈련을 필요로 하지 않습니다. ^{30 , 42}. 현재 프로토콜 채널 메기 TICAM 1 및 RBL 유전자에에서 indels 유도에 성공 하려면 입증. 이러한 안정적이 고 효과적인 절차 채널 메기에서 미래의 유전자 녹아웃을 생성 하기 위한 기초를 하다. 프로토콜은 다른 유전자 CRISPR/Cas9 시스템을 사용 하 여 채널 메기 게놈 또는 메기, 중재 tol2 transgenesis 같은 다른 유전자 기술을 적응에 대 한 대상으로 수정할 수 있습니다. 그것은 또한 가치 평가 블루 메기 (I.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Reproboost 임플란트	해양 생명 공학		메기 암컷의 배란 유도를 위한 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 아날로그(LHRHa)
TRICAINE-S	Western Chemical. Inc.		호르몬 주입 및 알 제거 중 무리 스톡 물고기의 진정을 위해.
페놀 레드	Sigma-Aldrich	P0290	0.5%, 멸균 필터링
스테레오 현미경	Olympus	213709	마이크로 주입 중 알을 시각화하기 위해
Microinjector	ASI-Applied Scientific Instrumentation	모델 MPPI-3	배아로의 주입 재료 전달을 위해
Micromanipulator	ASI-Applied Scientific Instrumentation	모델 MM33	주사 바늘의 움직임을 잡고 제어하는 데 사용됩니다.
Eppendorf Microloader	Eppendorf	5242956.003	마이크로 주입 바늘에 주입액을 주입하는 용도.
수직 바늘 풀러	David Kopf Instruments	모델 720	마이크로 주입 바늘 풀링 Cas9
단백질	PNA Bio Inc.	CP01	연쇄상구균 발열유전자의 재조합 Cas9 단백질.
High FidelityPLUS PCR 시스템 확장	Roche Diagnostics, 미국		gRNA 준비에 사용되는 DNA 템플릿의 PCR 및 증폭을 위해
붕규산 유리 모세관	Fisher Scientific		1mm 외경(OD), 마이크로주사 바늘 제작용.
페트리 접시	VWR	25384-302	미세 주입 중 배아를 잡기 위해.
Crisco	The J.M. Smucker Company		산란 팬 및 페트리 접시 코팅을 위한 야채 쇼트닝.
Holtfreter의 해결책	홈메이드	59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4를 사용하여 미세주입된 배아를 부화시킬 때까지 배양합니다.
Doxycycline hyclate USP (monohydrate)	Letco Medical	690904	세균 감염을 예방하기 위해 Holtfreter의 용액에 항생제를 10ppm 첨가했습니다.

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