방법 논문

건설 및 무 균 완화에 CoCrMo 입자에 노출에 의해 Calvarial Osteolysis Murine 모델의 평가

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DOI:

10.3791/56276

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2018년 2월 17일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Jinling Hospital, School of Medicine, Nanjing University, 2Center for Translational Medicine, Nanjing University Medical School, 3Jiangsu Key Laboratory for Molecular Medicine, Nanjing University Medical School

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 원고는 마모 입자 및 무 균 완화에 다양 한 세포 간의 상호 작용을 평가 하기 위한 이상적인 동물 모델을 구성 하는 CoCrMo 입자에 노출에 의해 calvarial osteolysis murine 모델을 설명 합니다.

초록

마모 입자 유도 osteolysis 관절 교체 실패, 무 균 완화의 주요 원인 이지만 기본 메커니즘 불분명 남아. 검색 및 산발적 발생에 필요한 긴 후속 인 그것 병 인 ofparticle 유도 osteolysis 임상의 경우에서 평가 하기 위해 도전적 이다. 따라서, 최적의 동물 모델은 추가 연구 필요. CoCrMo 입자에 노출에 의해 설립 calvarial osteolysis murine 모델은 입자와 무 균 완화에 다양 한 세포 간의 상호 작용을 평가 하기 위한 효과적이 고 유효한 도구. 이 모델에서 CoCrMo 입자 처음 높은 진공 3 전극 직류 여 되었고 50 mg/mL의 농도에서 인산 염 버퍼 염 분에 resuspended. 다음, 후 분리 하 여 두개골과 날카로운 해 부 결과 서 스 펜 션의 50 µ L murine calvaria의 중간에 적용 되었습니다. 2 주 후, 생쥐 희생 했다, 및 calvaria 표본 수확 했다; 질적 및 양적 평가 되며 고 오신 얼룩 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영에 의해 수행 되었습니다. 이 모델의 장점 절차 단순, 뼈 손실의 양적 평가, osteolysis 개발, 잠재적인 사용 유전자 변형 또는 녹아웃 모델, 그리고 상대적으로 저렴 한 비용의 속도 포함 한다. 그러나,이 모델은 기계적인 힘 및 입자 무 균 완화의 만성 효과 평가 하는 데 사용할 수 없습니다. Calvarial osteolysis murine 모델 CoCrMo 입자에 노출에 의해 생성 된 마모 입자 및 다양 한 셀, 예를 들면, 대 식 세포, 섬유 아 세포, osteoblasts 및 osteoclasts, 무 균 완화에 사이 상호 작용을 평가 하기 위한 이상적인 도구입니다.

서론

가장 일반적인 원인은 이다 무 균을 풀면 총 엉덩이 관절 (THA) 교체 및 총 무릎 관절 (TKA) 교체 실패의 개정 수술1필요. 그러나, 기본 메커니즘 불분명2남아 있습니다. 긴 후속 입자 유도 osteolysis, 그 발생은 드문; 검색 하는 데 필요한 따라서, 그것은 임상의 경우에서 자사의 pathogenesis 탐험 도전 이다. 따라서, 복잡 한 세포와 조직 메커니즘에 초점을 맞추고 더 연구에 실험 비보에 모두 착용 입자 유도 osteolysis 모델 및 분석 실험 체 외에 세포 항상성3뼈에 관련 된 필요 합니다. 유효한 동물 모델 더 세포질 분석 실험에 대 한 증거를 제공 하는 뼈 손실에 마모 입자의 효과 드러내는에서 중요 하다.

CoCrMo 입자에 노출에 의해 건설 murine calvarial osteolysis 모델 입자와 무 균 완화에 다양 한 세포 간의 상호 작용을 평가 하기 위한 효과적이 고 유효한 방법입니다. 이 모델에서 CoCrMo 입자 발생할 calvarial osteolysis 유도 하는 대 식 세포에서 염증 성 cytokines, osteoclasts 활성화, osteoblast 확산 억제 및 osteoblast apoptosis를 홍보.

그것은이 모델을 설정 하려면 2 주 걸립니다. Osteolysis 수 수 시각 hematoxylin와 오신 (H & E) 얼룩 계량 및 마이크로 계산 된 단층 촬영 (마이크로 CT)2. 또한,이 모델은 상대적으로 저렴 한 비용, 그리고 유전자 변형 및 녹아웃 마우스 모델 다양 한 복용량3화합물의 많은 화면을 사용할 수 있습니다.

설정 하 고이 모델을 평가 절차는 간단 합니다. 첫째, CoCrMo 입자 높은 진공 3 전극 직류 여 되었고 50 mg/mL의 농도에서 인산 염 버퍼 염 (PBS)에서 resuspended. 다음, 후 분리 하 여 두개골과 날카로운 해 부 결과 서 스 펜 션의 50 µ L murine calvaria의 중간에 적용 되었습니다. 쥐 2 주 후, 희생 했다 및 calvaria 샘플 수확 했다; 질적 및 양적 분석 H & E andmicro-코네티컷 얼룩에 의해 수행 되었다

CoCrMo 입자에 노출에 의해 건설 murine calvarial osteolysis 모델 CoCrMo 입자와 대 식 세포, 섬유 아 세포, osteoblasts, osteoclasts에 무 균 완화 등 다양 한 세포 간의 상호 작용을 평가 하기 위한 이상적인 도구입니다.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 난징 대학에 의해 승인 되었습니다.

1. CoCrMo 입자 준비

  1. 조작된 높은 진공 3 전극 직류4를 사용 하 여 CoCrMo 입자를 얻을. 10-3 Pa 진공, 0.04 MPa 아르곤 및 수소 3:2 (v/v), 악기에서 장소 CoCrMo 합금 그리고 현재 650 A 음극 선.
  2. CoCrMo 입자의 직경을 측정 합니다.
    1. 무수 에탄올의 1.5 mL에 CoCrMo 입자의 1 밀리 그램을 추가 합니다.
    2. 무수 에탄올에 초음파 진동 28 kHz, 600 W 5 분에 의해 CoCrMo 입자를 resuspend.
    3. 전송 전자 현미경 (TEM)의 객관적인 테이블에 결과 현 탁 액의 한 방울 (약 20 µ L)를 적용 합니다. 200 kV 가속 전압 및 0.24 nm 해상도에 가장 사진 시리즈를 캡처하십시오.
    4. TEM 현미경 사진에서 평균 직경 및 입자 크기 분포를 계산 하기 위해 제공 된 소프트웨어를 사용 합니다.
  3. 오염을 부유
    1. 고압 121 ° C와 15 psi에서 15 분 동안 입자의 50 g.
    2. Limulus Amebocyte Lysate (LAL) 분석 결과 양적으로 독 검색 (< 0.25 %EU / mL 내 부재를 나타내기 위해 여겨졌다)5.
  4. 재고 솔루션650 mg/mL의 농도에서 인산 염 버퍼 염 (PBS)에 입자를 resuspend.

2입니다. Calvarial Osteolysis 모델의 건설

  1. 6 주 된 C57BL/J6 쥐 (그룹 당 6 쥐) withpentobarbital (50 mg/kg) anesthetize 핀치 테스트를 사용 하 여 마 취의 수준을 평가 하기 위해. 일반적인 염 분으로 눈의 건조를 방지 합니다.
  2. 경향이 위치에서 마우스를 놓습니다. 두개골에 모피는 면도기로 제거 하 고 75%의 에탄올을 포함 하는 의료 면봉을 사용 하 여 피부를 소독.
  3. 포인트 지역화, 각각 두 눈과 귀 사이의 중간점을 포함 하 여 2 포인트를 식별 합니다. 다음, 포인트, 위의 두 사이의 라인을 확인 하 고가 위 (그림 1A)와 위의 라인을 따라 피부를 incise.
  4. 메스 (그림 1B)6calvaria에서 두개골과 제거 합니다.
  5. 간단한 중단된 봉합으로 양쪽 끝에 봉합 피부.
  6. 노팅 없이 절 개의 중간을 통해 봉합 라인을 확인 합니다. 봉합 선의 두 끝을 잡으십시오.
  7. Calvarias (그림 1C)2의 한가운데에 CoCrMo 입자 현 탁 액 (PBS에 50 mg/mL)의 50 µ L를 포함 합니다.
  8. 간단한 중단된 봉합 (그림 1D) 내 마지막 스티치 매듭
  9. 또 다른 2 주 동안 마우스를 유지.

3. 마이크로-CT 스캔 하 여 Calvarial Osteolysis 모델의 평가

  1. 이산화탄소와 쥐를 희생. 수평 평면에 쥐 목을 벨. 뇌 조직 내부, 그리고 피부를 제거 하 고 밖에 서 모피. 추가 실험을 위한 calvarias을 수확.
  2. 부드럽게 핀셋으로는 calvaria에 모든 연 조직 정리. 마이크로-CT 검사 전에 PBS 24 h calvarias 24 h. 담가 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde 지운된 calvarias을 수정.
  3. 마우스 calvarias 18 µ m의 아이소메트릭 해상도 및 45의 x 선 에너지 설정에서 고해상도 마이크로-CT 분석 kV 및 550 mA.
  4. 소프트웨어와 마이크로-CT 데이터의 3 차원 재구성을 수행 합니다.
  5. 정성 및 정량 분석입니다.
    1. 먼저, 관심의 영역으로 중간 봉합 사 주위의 사각형 영역을 선택 합니다.
    2. 둘째, 뼈 미네랄 밀도 (BMD)를 측정, 볼륨/총 뼈 볼륨 (BV/TV), 배수 수 (Tb.N), 배수 두께 (Tb.Th), 배수 분리/간격 (Tb.Sp), 그리고 마이크로-코네티컷에 대 한 제공 된 소프트웨어와 함께 총 다공성의 비율
    3. 셋째, 일방통행 ANOVA에 의해 다양 한 측정을 위한 3 개 그룹을 비교할 수 있습니다. 포스트 hoc 분산 분석 적용 Bonferroni 방법2.

4. Calvarial Osteolysis 모델 H & E 염색 법의 평가

  1. 15% 에틸렌 diamine tetraacetic 산 (EDTA) calvaria 샘플을 알려줍니다-4 ° c.에서 PBS 3 주 동안 매일 decalcification 솔루션을 변경 합니다.
  2. 2 cm x 1 cm x 1 cm 큐브, 파라핀에 석된 샘플을 포함 하 고 입자 증 착의 영역에서 2 µ m 섹션으로 그들을 슬라이스.
  3. 되며 섹션 얼룩 하 고 오신 앞7에서 설명한.
  4. 가벼운 현미경 검사 법에 의해 전체 pathomorphism의 현미경을 캡처하십시오.

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결과

사내 생산된 nanoscale CoCrMo 입자 했다 약 50 nm (3.56의 표준 오차) 직경, 가장 (그림 2)에 의해 정량으로. 마우스 calvarias의 CoCrMo 입자, 동물에 노출 된 후 (n = 그룹 당 6) 또 다른 2 주 동안 유지 되었다. 2 주 이내에 calvarial 절 개는 완전 하 게 치유 하 고 봉합 떨어질 수 있습니다. 모든 로컬 감염 또는 뼈 손실 평가 영향을 없앤 5 월. 마우스 희생 후 calvaria 샘플 수확 했다. 그리고, 모든 부드러운 조직을 부드럽게 정돈 했다 마이크로 CT 뼈 손실을 측정 하는 데 사용 되었다. 3 차원 재구성 이미지와 횡단면에 대표적인 코로나 사진에서 중요 한 뼈 손실은 CoCrMo 입자 (그림 3)으로 치료 하는 쥐에서 관찰 되었다. 뼈 미네랄 밀도 (BMD), 뼈 볼륨/총 볼륨 (BV/TV), 배...

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토론

마모 입자 유도 osteolysis 쥐에 대 한 두 가지 주요 방법이 있다: 공기 주머니 모델과 calvarial osteolysis 모델. 공기 주머니 모델에서 피하 생성 된 공기 주머니는 처음 설립, 마모 입자 소개 및 이식 뼈 조직8에 이어서. 주머니 벽 무 균 완화에 모방합니다. 그러나, 뼈 이식이 이다 nonvascular 생물 학적 활동 없이, 입자와 뼈 조직 간의 직접적인 상호 작용을 평가 하기 어렵습니다. Calvarial osteolysis 모델 공기 주머니 대응 이상의 몇 가지 이점이 있다. 첫째, 마모 입자는 직접 노출 calvaria, 마모 입자 간의 상호 작용을 평가 하 고 항상성, 뼈 재흡수, 그리고 osteoblast, osteoclast 및 대 식 세포 활동9,10 포함 하 여 뼈를 가능 하 게 하 . 둘째, 뼈 손실의 양적 측정 뼈 손실 예방

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 연구는 국립 자연 과학 재단의 중국 (81572111), 과학 및 기술 프로젝트 재단의 장쑤 성 (BL2012002), 과학 연구 난징 프로젝트 (201402007), 자연 과학에 의해 지원 되었다 장쑤 성 (BK20161385)의 기초 그리고 중국 의사 협회 (2015COS0810)의 특별 한 기초.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
보철물의 CoCrMo 합금Waldemar Link GmbH & CoGEMINI MK IICoCrMo 나노 입자를 얻기 위한 원료
날조된 고진공 3전극 직류재료 과학 대학 및 공학, 난징 공과자체 설계 기계
6 주 된 남성 C57BL / 6J 마우스모델 난징 대학의 동물 연구 센터N000013
100 % 에탄올난징 시약C0691514023투과 전자 현미경 스캐닝 용 CoCrMo 나노 입자 용매
1.5 ml 마이크로 원심 분리기 튜브Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTDW603
미세 분석 저울심천 Qun 긴 악기 장비 CO,. LTDEX125DZH
초음파 쉐이커상하이 Yuhao 과학 기기 co., LTDYH-200DHCoCrMo 나노 입자
투과 전자 현미경FEITecnai G20
SimplePCI 소프트웨어Compix Inc.를6.6 버전: 평균 직경 및 입자 크기 분포를 계산합니다.
고용량 살균 팬QIULONGYIQIKYQL-100DS오염 제거 엔도톡신
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) 분석Charles RiverR13025엔도톡신을 감지하기 위해 
15 ml 마이크로 원심 분리기 튜브Taizhou Suyi MedicalB122
인산염 완충 식염수Boster Biological TechnologyAR0030CoCrMo 나노 입자 원액
용매 Pentobarbital 나트륨시그마P3761마우스 마취
일반 식염수SACKLERSR8572EP-15마우스 눈의 건조를 방지하기 위해
75 % 에탄올난징 시약C0691560275소독
의료 면봉Shuitao1278298933소독
면도기KemeiKM-3018모피 면
위RWD 생명 과학S12005-10피부
봉합RWD 생명 과학F34001-01피부 봉합
바늘 홀더RWD LIFE SCIENCEF33001-01피부 봉합
바늘RWD LIFE SCIENCER14003-12피부
봉합 혈관 집게RWD 생명 과학F22003-09피부 봉합
메스RWD 생명 과학S31010-01calvaria
핀셋RWD 생명 과학F12006-10calvaria
100 µ를 봉합하려면; L 피펫Eppendorf3120000240에 입자 현탁액을 삽입하려면
; L 피펫 팁AXYGENT-200-Y칼바티아스 5 ml 마이크로튜브에 입자 현탁액을 삽입하려면
Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTDW621
4% 파라포름알데히드ServicebioG1101고정
마이크로 컴퓨터 단층 촬영 SkyScanSkyScan1176
에틸렌 디아민 테트라아세트산서비스bioG1105석회질
제거 파라핀서비스bio#0001
파라핀 슬라이싱 머신라이카RM2125RTS
유리 슬라이드서비스bioG6004
커버 유리서비스bio200
HE 염색 키트Servicebio#1-5HE 염색
광학 현미경니콘E200
대학 중단합니다.도 가사 calvatias 100 µ

참고문헌

  1. Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
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  3. Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
  4. Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
  5. Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
  6. Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
  7. Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
  8. Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
  9. Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
  10. Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774(2015).
  11. Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
  12. Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853(2015).
  13. Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
  14. Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
  15. Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).

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