G2-seq: 높은 처리량 시퀀싱 기반 기술을 늦게 게놈의 복제 확인

Summary

Cytometry 및 높은 처리량 연속 게놈 늦게 복제 영역을 식별 하는 기술을 설명 합니다.

Abstract

DNA 복제는 세포 주기의 S 단계의 진행에 따라 수많은 기술 개발 되었습니다. 이러한 기술의 대부분의 위치 및 게놈 중복 보다는 그것의 완료의 개시의 타이밍으로 지시 되어 있다. 그러나, 그것은 우리가이 지역 돌연변이, 염색체 파손의 높은 수준의 고통 때문에 마지막 복제를 완료 하는 게놈의 지구를 이해 하 고 그들은 질병과 노화와 연관 된 중요 한. 여기 우리는 어떻게 우리가 대신 마지막 완전 한 복제에 게놈의 그 영역을 식별에 복제 개시를 모니터링 하는 데 사용 된 기술 확장을 설명 합니다. 이 방법은 cytometry 및 높은 처리량 시퀀싱의 조합을 기반으로 합니다. 이 보고서에서는 효 모에이 기술 적용, 접근 교류 cytometer DNA 내용에 따라 정렬 될 수 있는 모든 세포와 함께 사용할 수 있습니다.

Introduction

진 핵 게놈 복제 복제, 복제에서 포크 (Fragkos 그 외 여러분, 2015¹에서 검토) 두 방향에서 진행의 기원 이라고 하는 여러 개별 사이트에서 시작 됩니다. 기원 그들의 타이밍 및 발사의 효율성에서 변화 하 고 몇 가지 기술을 복제 원점 활동을 모니터링 하 고이 변화의 원인 명료 하도록 개발 되었습니다. 개별 근원의 활동의 단일 가닥 DNA², 활성 기원, 주위는 양식 수준에서 추정 될 수 있다 또는 특정 복제 중간체³모니터를 2 차원 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 둘 다로 검출 될 수 있다 방사성 조사 합니다. 이러한 기술을 모두 기원 전에 특정 알려진된 시퀀스에 제한 때문에 더 쉽게 S. cerevisiae 보다 포유류 세포에 적용 됩니다. Microarrays의 도래와 함께 세계적으로 발사 하는 근원 평가 수 되었다. 이 하 여 무거운 동위 원소와 DNA 라벨, 셀 g 1 블록에서 중간 포함 가벼운 동위 원소에 다음 무거운-가벼운 하이브리드 DNA 게놈⁴에 걸쳐 형성 모니터링 처음 이루어졌다. 높은 처리량 시퀀싱의 소개 허용 비슷한 게놈 넓은 비싼 동위 원소 라벨의 요구 없이....

Protocol

1. 셀에 대 한 준비 흐름 Cytometry 정렬

1. 15 mL 문화 하룻밤 성장 후 1.5 mL 당 10⁷ 셀 x 5 x 10⁶ 의 밀도 도달 되도록 각 YEPD 국물의 8 mL를 포함 하는 시험관에 접종 (참조 토론 참고 1).
2. 효 모 세포 (1400 x g, 실 온 또는 4 ° C에서) 5 분에 대 한 15 mL 스크류 캡 원심 관에 다운 스핀, 1.5 mL 70% 에탄올, 실 온에서 1 h 또는 얼음 (에 적어도 3 h이이 앉아 시키는 1.6 mL microfuge 관에 전송 셀 resuspend 4 ° C에서 무기한 저장할 수) (토론 포인트 (2) 참조).
3. 1 분 동안 microfuge (14000 x g, 4 ° C)에서 효 모 세포를 스핀, 1 분 1 mL 50 m m 나트륨 구 연산 염, pH 7.2, 스핀 (14000 x g, 4 ° C) 아래에 resuspend, 상쾌한 발음, 1 mL 50 m m 나트륨 구 연산 염, pH 7.2에서 resuspend 0.25 mg/mL 1 시간 또는 밤새 껏 열 블록 또는 물 목욕에서 37 ° C에서 50 ° C에서 RNAse 솔루션 포함.
4. 50 µ L 성분을 K 솔루션 (20 mg/mL 10 mM Tris pH 7.5, 2mm....

Results

싹 트는 효 모에 늦게 복제 사이트 식별 위에서 설명한 절차를 사용 했습니다. 테스트는 인공 염색체에 알려진된 늦은 복제 영역을 사용 하 여이 이렇게 정확 하 고 신뢰할 수 있는 기술을 입증 했다. 우리의 결과 또한 시연 복제의 적시 완료의 생물학 중요성 우리가 우리의 G2-seq 결과 근거 하 여 늦은 복제로 식별, 염색체 7에 늦게 복제 영역 손실 되었음을 표시 하 여 약 three-fold는 유사한 보다는 더 빈번 하 게 지역¹¹제어 합니다.

G2-seq와 결과의 특정 한 예는 그림 2에 표시 됩니다. 우리 했다 가설을 거기 것 이다 특히 늦은 세포 복제 게놈의 지역 부족 단백질 deacetylase Sir2 라는. 그림 2A.......

Discussion

이 기술은 강력 하 고 비교적 똑 바른 동안 앞으로, 특정 주의 다음에 전념 한다.

(1) 문화 차이 매니페스트 세포 주기 배포판에 문화는 접종 후 원하는 밀도 그냥 4 h를 도달 하는 데 후 수확 하는 경우 이후 로그 단계를 도달 하기 전에 적어도 12 h에 대 한 성장 좋습니다. 우리의 가정은 세포 주기 분포는 비교적 안정 된 평형에 도달 했습니다 더 나타내는 "진짜" 로그 단계 배포는 아직 유출 때 포화 문화 양도 되었습니다 최근 신선한 매체 배포 보다.

(2) 고정 하기 전에 셀 아래로 회전의 대신 세포 또한 직접 에탄올의 최종 농도 70% 효 모 문화를 100% 에탄올을 추가 하 여 해결할 수 있습니다. 세포 합성 또는 풍부한 (YEPD) 매체에 성장 될 수 있다.

(3) 세포 주기 단계 530 nm 방출 영역의 기능으로 플로팅 휴대 번호로 정렬에 대 한 시각화 됩니다. .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
YeaStar 게놈 DNA 키트	Genesee Scientific	11-323
1 &마이크로; M SYTOX Green	ThermoFisher	57020	50mM 구연산 나트륨, pH 7.2
50mM 구연산 나트륨, pH 7.2
RNase 용액 (0.25 mg / mL)	에	R6513	0.25 mg / mL RNaseA를 50 mM 구연산 나트륨, pH 7.2에 재현탁시키고 RNase 용액을 처음 사용하기 전에 10 분 동안 끓이고 그 다음에는 -20 °C에서 보관합니다.
proteinase K 용액 (20 mg / mL)	ThermoFisher / Invitrogen	25530-015	10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50 % 글리세롤에 재현탁, -20 °C에 보관; C
모델 50 음파 분석기	Fisher Scientific	FB50A220
BD Biosciences FACSAria II	BD Biosciences	644832
Zymo-spin III 컬럼	Zymo Research	C1005
Qubit dsDNA HS 분석 키트	ThermoFisher	Q32851
Qubit 3.0 형광측정기	ThermoFisher	Q33216
Covaris 모델 LE220 집속-초음파기	Covaris	500219
Illumina TruSeq DNA LT 샘플 준비 키트	Illumina	15026486
Illumina HiSeq 2500 기기	Illumina	SY– 401– 2501
gsnap 정렬 소프트웨어	오픈 소스 소프트웨어 / Genentech		http://research-pub.gene.com/gmap