C. 선 충 에서 광범위 한 범위 식이 제한 유전자 식 수준 동안 수명 변조에서 인코딩된 정보의 정량화

Summary

여기, 우리는 넓은-범위 식이 제한 유전자 발현 및 수명에 관련 된 프레임 워크 제시. 우리는 넓은-범위 식이 제한 및 유전자 발현이이 패러다임에서의 양적 이미징에 대 한 프로토콜 설명합니다. 우리는 더 이상 음식 감지에 관여 유전자 회로의 정보 처리 기능 기본 공개 전산 분석 개요.

Abstract

감각 시스템 감지, 처리, 및 그들의 환경에 반응 하는 동물을 수 있습니다. 음식 풍부한 동물 생리학과 행동에 깊은 영향 환경 큐입니다. 최근에, 우리는 음식 풍부에 의해 선 충 류 꼬마 선 충 에서 장 수의 변조는 이전 인식 보다 더 복잡 한 것을 보였다. 음식 수준에 변화에 수명의 응답 신경 회로 내에서 처리 하는 정보를 제어 하는 특정 유전자에 의해 결정 됩니다. 우리의 프레임 워크 결합 유전자 분석, 높은 처리량 양적 이미징 및 정보 이론. 여기, 우리는 넓은-범위 식이 제한과 생리 적인 관련성은 어떤 유전자의 특성 이러한 기법을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 특히,이 워크플로 어떻게 관심사의 유전자 조절 수명 넓은 범위 식이 제한;에서 공개 하도록 설계 되었습니다. 다음 설정 어떻게 유전자의 표현 따라 음식 수준; 그리고 마지막으로, 제공 하는 정보의 양의 편견된 정량화를 환경에서 음식 풍부에 대 한 유전자 발현에 의해 전달. 신경 회로의 컨텍스트에서 여러 유전자를 동시에 검사 하는 경우이 워크플로 회로 의해 고용 된 코딩 전략을 파악할 수 있습니다.

Introduction

모든 유기 체는 감지 하 고 그들의 생존을 위해 환경에 변화에 대처할 수 있이 필요가 있다. 동물, 신 시스템 기본 검출기와 변환기의 환경에 대 한 정보는 고 생물의 생존¹에 영향을 미칠 수 있는 모든 변화에 생리 적인 응답을 조정 합니다. 음식 풍부한은 환경 큐 여러 상황에 잘 공부 뿐만 아니라 채집², 등 음식 관련 행동을 조절 하지만 또한 동물의 장 수에 미치는 영향입니다. 수명 변화 음식 풍부에 의해 변조 식이 제한 (DR)으로 알려진 현상 이며 광범위 한 진화 보존³.

꼬마 선 충 선 충 류는 근본적인 생물학 질문을 해결 하기 위한 강력한 모델 시스템입니다. 기술의 과다 웜 게놈 RNAi 및 vivo에서 유전자 기술 편집 등의 조작을 허용 하는 개발 되었습니다. 벌레 및 광학 투명도의 작은 물리적 크기 또한 빌려 스스로 모두 transcriptional 및 변환 형광 기자 들의 비보에 이미징 및 높은 처리량 등의 기술 마이크로⁴유틸리티. 함께, 이러한 도구 어떻게 신경 회로 직접 동물 행동 검사 밝혀 될 수 있습니다.

C. 선 충 은 bacterivore 이며 여러 가지 방법이 세균성 농도^{5,6,7,8 조작 하 여 음식 풍부의 정확한 제어를 허용 하는 게시 된} . C. 선 충 연구 커뮤니티 내에서 박사 두 개의 다른 문맥에서 연구 되었습니다. 처음으로 다른 유기 체에서 음식 수준 감소에 대 한 응답에서 본 변화 거울 '클래식 닥터', 불릴 수 있다. 이러한 맥락에서 음식 풍부한 광고 libitum 수준에서 감소 결과 증가 수명에 최적에 도달 하면, 후이 지점 장 수 감소 음식^{6,7, 더 감소 될 때까지 9}. 두 번째 컨텍스트는 박사 C. 선 충 에서 공부 하고있다 어떤 세균성 음식 소스^10,11의 완전 한 제거로 벌레의 장 수 증가 규정식 부족 이다. Entchev 외. (2015)¹², 우리는 박사가 두 개의 다른 패러다임에서 결과에 복잡성을 시험 될 수 있다 보였다 동시에 컨텍스트에서 우리 용어 '넓은 범위 박사'. 아래에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 유전자의 새로운 클래스 식별 박사에는 양방향으로 음식 풍요에 수명 응답을 조절 하 고 음식¹² (그림 1)을 감지 하는 신경 회로에 관련 된.

환경 변화에 동물의 응답 생리학에 환경 정보를 전달 하는 복잡 한 규제 상호 작용을 감각 시스템을 연결 하는 생물학 과정의 순서를 통합 합니다. 같은 "정보 흐름"의 기계적 세부 사항 들은 알려진 하 고, 비록 다른 생물 학적 구성 요소 들이 복잡 한 계산 구성 방법을에 대 한 통찰력을 얻으려고 유전 도구를 사용할 수 있습니다. 우리의 최근 작품에서 우리는 daf-7 , tph-1 식품 감지 신경 회로, 변조 선 충 C.¹² 수명 통해 음식 풍부에 대 한 환경 정보의 전송에 참여 보였다 ^{, 13}. 정보 이론¹⁴의 수학적 프레임 워크를 적용 하 여 우리 환경 정보, 비트, daf-7 와 유전자 식 변화에 의해 표현 되는 금액을 정할 수 있었다 tph-1 다른 음식 수준에서 특정 신경 세포에. 이것에서 우리 다음 (그림 2)이 신경 회로 어떻게 유전자 제어에 의해 고용 인코딩 전략을 밝히기 수 있었다.

다음 프로토콜에서 우리는 특정 신경 세포에 표현 된 관심사의 유전자의 영향 무엇 이며 어떻게 그들이 수명 환경에서 음식 정보 흐름에 참여를 이해 하는 데 필요한 단계를 개요. 광범위 하 게, 우리는 분리 두 실험 프로토콜에 계산 워크플로. 실험적인 측면에 대 한 그것은 돌연변이가지고 중요 한 광범위 한 범위에서 검사할 수 있는 관심의 유전자의 박사 충실 transcriptional 기자 다른 음식 수준에서 유전자의 식 수준을 정할 필요가 있습니다. 우리의 방법에서 설명 하는 전산 분석 수행 수 있도록, 데이터 집합 식 배포판의 의미 있는 견적을 제공 하기 위해 충분 한 크기의 필요 합니다. 비록 우리는 분석에 대 한 템플릿 소스 코드를 제공, 사용자는 우리의 계산 프레임 워크에 걸쳐 광범위 하 게 사용 되는 정보 이론의 언어에 잘 알고 있이 필요가 있다. 소스 코드는 R와 c + +에서 작성 됩니다. 따라서, 프로그래밍 능력의 특정 수준을 의미 있는 방식으로 그들을 적용 하는 데 필요한 이기도 합니다.

Protocol

1. 준비의 세균성 문화 및 일반 벌레 문화에 대 한 번호판

1. 250 mL 유리병에 lysogeny 국물 (파운드) 미디어의 100 mL를 준비 하 고 압력가 마로 소독 하 여 소독.
2. 대장균 스트레인 OP50의 단일 식민지와 병을 예방 하 고 37 ° C에서 하룻밤, 품 어 다음 필요할 때까지 4 ° C에서 문화를 저장.
3. 살 균 6 cm 플라스틱 접시에 살 균 선 충 성장의 5 L 중간 (NGM) 한 천 ¹⁵ 및 약 수 12 mL 볼륨 준비.
4. 하룻밤 설정 하 고 필요할 때까지 4 ° C에서 저장 한 천 수.
5. 씨앗 NGM 냉장된 OP50 문화의 225 μ와 함께 사용 하기 최소 3 일 전에 접시. 20 ° c에서 필요할 때까지 접시를 저장.

2. 세균성 문화 및 실험에 대 한 희석의 준비

1. 2l 삼각 플라스 크에 파운드 미디어의 500 mL 두 많이 준비 하 고 압력가 마로 소독 하 여 소독.
2. OP50의 단일 식민지와 각 플라스 크를 예방 하 고 약 14 헤에 대 한 200 rpm에서 떨고 37 ° C에서 성장
3. 보충 50 μ g/mL의 최종 농도에 항생제 스와 문화. 37 ° C에서 30 분 15 분에 대 한 얼음에는 플라스 크 장소에 떨고 계속
4. 별도 멸 균 원심 병 (이상 500ml 용량 병 문화를 분할 하지 않도록)으로 각 문화의 전송 450 mL. 얼음에 남은 문화는 박테리아의 농도 결정 하는 데 사용할 것입니다 유지.
5. 삭제 상쾌한 25 분 4 ° C에서 냉장된 원심 분리기 세트에서 4500 x g에서 병 아래로 회전 하 고 얼음에 병을 저장
6. 100 μ 0 분 광 광도 계, 살 균 파운드의 살 균 파운드 사용 1 mL의 900 μ에 각 플라스 크에서 남은 문화를 희석 하 고 각 문화의 10 희석의 OD ₆₀₀을 결정 합니다. 예를 들어 야간 문화 10 희석의 OD ₆₀₀ 0.28 경우 문화 했다 2.8는 실제 세 ₆₀₀.
7. 10 ¹⁰ OP50 셀/mL, 56의 OD ₆₀₀ 동일한 x 1.12의 박테리아의 작업 재고 솔루션을 사용 합니다. 따라서, 20 ^일 22.50 mL을이 경우에 원래 볼륨의 450 mL 문화에서 펠 릿 resuspend 2.8 위에서 예 세 ₆₀₀를 사용 하 여. 박테리아 살 균 S 기저 솔루션 스 50 μ g/mL (SB + strep)에 보충 resuspend.
8. 살 균 SB + strep의 적절 한 볼륨에는 펠 릿 resuspend.
9. SB에서 작업의 직렬 희석에서 실험에 사용 되는 모든 후속 농도 확인 + strep 희석 요소를 사용 하 여 표 1에 나열 된.

3. 설정 최대 수명 실험

참고: 수명 분석 NGM agar와 스 carbenicillin (NSC), 50 μ g/mL의 최종 농도 보충의 12 mL 가득 6 cm 처리 조직 문화에서 수행 됩니다. 이러한 조직 문화 접시는 적합 수명 분석 없이 또는 매우 낮은 세균 농도, 벌레 크게 덜 하는 경향이 접시의 벽에 집착 하 고 desiccating. 두 개의 서로 다른 항생제를 사용 하 여 개발 약물 저항,이 접시에 세균 농도 조절에 매우 중요 OP50 긴장을 방지할 수 있습니다. 또한, 항생제로 박테리아를 비활성화 하 여 우리 병원 성 감염 ¹⁶ 인 웜 수명에 영향을 최소화. 음식 관련 된 구성 요소만이 실험에 세균 농도의 고려해 야 할 수 있습니다. 많은 선 충 C. 노화 연구 보충 NGM 접시 화학 불 화-2 ′-deoxyuridine (FUdR) 살 균 성인을 렌더링. 그러나, FUdR의 사용 될 수 있습니다. 문제가 사용 장 수 분석 실험 ^{17 , , 18 19 ,} 몇 가지 혼동 문제가 발생할 수 있습니다. ^{20 , 21}. Entchev 그 외 여러분 (2015) ¹² 달걀-5 ^{22 , 23}, 억제는 RNAi에 L4 애벌레의 노출에 의해이 문제를 우회는 oocyte 배아 전환의 달걀 껍질의 형성을 차단 하 여 수정 된 그들의 죽음의 결과로 선 충 C. oocytes.

에 분석 될 것 이다

1. 문화 선 충 C. 긴장 시드 NGM 접시 20 ° C. 허용 모든 동물은 성장 유니폼 패션에 잠재적으로의 어떤 transgenerational 효과 대 한 계정 수 있도록 밖으로 굶 어 접시 발달 조건.
2. 전송 굶 어 L1 애벌레 새로운 시드 NGM 판 천 (5 x 5 mm)의 작은 조각 절단 하 여 굶 어 접시를 살 균 메스를 사용 하 여 새 접시, 라고 하는 프로세스에 그것을 아래로 배치에서 ' 청크 ' C. 선 충 연구 통신 실에 의해 통일 ¹⁵. L4 단계를 도달할 때까지 벌레를 성장. 스트레인 당 5 L4 애벌레 다음 개별 시드 NGM 접시를 전송 하 고 20 ° c.에 유지 P0 세대를 대표 하는이 동물.
3. F1 세대를 설정 하려면 p 0 세대의 사용 L4 자손. 개별적으로 30 시드 NGM 접시에 야생 타입 N2 스트레인의 F1 L4 애벌레 장소.
   참고: 돌연변이 체 긴장, 필요한 접시의 수에 따라 다릅니다 그들의 성장 율. 예를 들어 daf-7(ok3125) 동물 20 ° c.에 과도 dauer 체포를 받 다 따라서,이 긴장 N2 야생 타입의 플레이트 웜 보다 적은 L4 애벌레 생성.
4. 이 차이 대 한 보상, daf-7(ok3125) 접시를 하루 일찍 설정 n 2 보다 플레이트와 큰 숫자에는 좋은 작업 비율은 3:1.
5. 전송 동기화 NGM 접시와 1mm IPTG 50 µ g/mL carbenicillin (RNAi 접시)을 dsRNA 달걀-5 유전자를 대상으로 표현 하는 HT115 박테리아의 225 µ L로 시드 유지 보완에 F1 부모의 L4 단계 자손 24 h에 대 한 20 ° C입니다. 스트레인, 접시, 당 15 동물의 밀도에 보관 당 적어도 360 웜 실험 당 필요 하다.
6. NSC 번호판 20 ° c.에 추가 24 시간에 대 한 2 x 10 ⁹ 셀/mL (표 1)의 농도에 스 취급 OP50의 225 µ L로 시드 벌레 계란 5 RNAi 치료, 후 전송 이 모든 후속 전송 동안 벌레에 물리적 손상을 방지 하려면 부드럽게 특 종 동물에서 매우 얇은 부드럽게 곡선된 웜 선택을 사용 하 여 웜 아래. 새로운 격판덮개의 표면에 플 로트 동물 벌레에서 SB + strep의 10 µ L 방울에 그것을 immersing 하 여 선택 배치.
7. 다음날, 재배포 NSC 번호판 음식 수준 l의 각각을 대표 하는 것은 벌레NSC 판을 아무 박테리아를 포함 하는 집합으로 표 1에 isted. 모든 NSC 접시 박테리아의 관련 농도의 225 µ L 씨 고 225 µ L SB + strep 박테리아 없는 NSC 접시를 시드하십시오. 접시, 음식 상태 스트레인 당 당 최소 4 판 결과 당 15 동물의 밀도에 벌레를 유지 합니다. 원하는 실험 온도에 번호판 이동.
8. 신선한 NSC 번호판 전송 웜 표 2에 명시 된 일정에 따라 적절 한 음식 농도로 시드.
9. 점수 동물 부드럽게 와이어 괴롭히는 의해 움직임에 대 한 선택. 응답 하는 실패는 죽음으로 점수입니다. 점수 동물 모든 전송에서 죽음에 대 한 포인트와 다음 매일 마지막 환승 후.

4. 이미징 실험을 설정

참고:이 섹션에 설명 된 단계는 주어진된 온도에서 한 실험 음식 상태 이미징에 대 한 스트레인 당 충분 한 벌레를 생성 하기에 충분. 이 프로토콜은 어떤 주어진된 일 든 지에 몇 군데는 조건의 수에 맞게 확장할 수 있습니다. 그러나, 기간 합리적 이다 고 다른 변종에 걸쳐 동물 이미징의 하루에 12 시간 이상 나이 차이가 없는 실험적인 디자인에 배려를가지고 한다. 그것은 좋습니다 transcriptional 기자 몇 군데 되는 단일 복사 제 닉이 됩니다 더 유사한 유전자의 기본 규칙으로. 프로토콜을, 아래에 설명 하 고 표 3에 요약 실험 다른 워크플로 위한 사용 될 수 있는 긴장의 일치 하는 큰 동기 나이 인구를 얻기 위한 효율적인된 방법을 제공 합니다.

1. 문화 영상 벌레의 더 큰 밀도 대 한 허용을 취급 하는 10cm 조직 문화 접시에 실험 동물 (∼ 접시 당 100 동물) 수명 분석 보다.
2. 십자가 모양의 대형 냉장된 OP50 문화의 5 225 µ L aliquots와 NGM 한 천 배지와 씨앗의 30 mL 10 cm 접시를 채울.

5. 문화 기자 긴장 초기

에 분석 될 것 이다

1. 문화 선 충 C. 긴장 시드 NGM 접시 20 ° C. 허용 모든 동물 제복 패션에 잠재적으로 계정에 대 한 성장 되도록 밖으로 굶 어 접시 transgenerational 발달 조건의 효과.
2. 청크 굶 어 L1 애벌레를 NGM 접시 시드와 L4 단계를 도달할 때까지 성장. 20 ° c.에 2 개의 시드 NGM 번호판 스트레인 당 3 L4 애벌레를 전송 P0 세대를 대표 하는이 동물.
3. P0 세대의 L4 자손을 사용 하 여 F1 세대를 설정. 4 시드 NGM 접시에 야생 타입 기자 스트레인의 F1 L4 애벌레를 놓습니다. 돌연변이 체 긴장, 접시 필요한 수 그들의 성장 속도에 따라 달라 집니다. Daf-7(ok3125)의 이전 예제를 사용 하 여, 기자가이 배경에서 세 번 번호판 필요 긴장과 이틀 전에 야생 타입 기자 긴장 성장 율에 차이 대 한 계정 설정 필요.

6. 달걀 수집 및 동기화의 기자 긴장

참고: 선 충 C. 노화 연구 커뮤니티의 일부 유전자 성장과 계란-누워 결함 돌연변이 때 더 어렵게 하는 결과 다른 genotypes의 동물의 큰 동기 인구를 생성 합니다. 예를 들어 daf-7(ok3125) 돌연변이 야생 타입 N2 스트레인에 비해 심한 계란-누워 결함을 발생합니다. 따라서, 충분 한을 양적 이미징 실험에 대 한 다른 긴장의 동기 L4 애벌레의 수 수동으로 벌레를 따기 보다 더 강력한 방법론이 필요 합니다. 이러한 이유로 transcriptional 기자 긴장 염소 (NaClO)를 복종 되었다 / 벗 성인 휴식의 수산화 나트륨 (NaOH) 솔루션 치료 동물 열고 그들의 계란, 일반적으로 라고도 하는 프로세스를 해방 ' 표백 ' C. 선 충에 의해 연구 커뮤니티 ¹⁵.

성장에 차이 대 한 계정
1. 긴장 사이 속도 그리고 각 스트레인의 접시를 수확 하 고 표백 한다 때 계산. 야생 유형 및 daf-7(ok3125) 기자 종자는 표백 하는 때의 예 표 3을 참조 하십시오.
2. 직렬 SB의 15 mL를 사용 하 여 적절 한 날에는 접시에서 주어진된 긴장의 벌레를 세척 하 고 살 균 15 mL 튜브에 수집 합니다. 자연스럽 게 앙금을 동물을 허용 하 고 7 ml 액체의 볼륨을 조정 합니다.
3. NaClO 5%의 추가 2 mL과 벗 성인을 포함 하는 튜브를 5 M NaOH의 1 mL. 부드럽게 바위 더 이상 3 분 동안 실내 온도에 혼합물. NaClO는 NaOH 하면 벌레 액체에 포함 된 모든 수정 된 달걀을 풀어 분리를 하는 동안 박테리아와 벌레, 죽 것. 으로 노출 시간 남아 상대적으로 짧은 배아 주위 껍질 틴은 치료의 효과에서 그들을 보호 합니다. 3 민 화, 소용돌이 ~ 30 튜브 후 벌레 시체의이 별을 더 촉진 하기 위하여 s.
4. 1000 x g 작은 알을 1 분 동안에 혼합물 내려 3 분 인큐베이션 스핀 후. 계란을 방해를 하지 않도록 각 관에서 ~0.5 mL를 떠나 진공 플라스 크에 연결 된 메 마른 유리 피 펫을 사용 하 여 상쾌한의 대부분을 멀리 발음.
5. SB의 9.5 mL와 펠 릿을 resuspend 하 고 원심 분리 단계와 물의 resuspension 단계 추가 두 번 계란 총 세 번의 SB로 씻어 되었습니다 있도록 반복 합니다.
6. 마지막 세척 후 원심 분리를 통해 계란을 작은 고는 상쾌한의 0.5 mL를 제외한 모든 삭제 다음. SB와 세 시드 10 cm NGM 접시에 다음 aliquot 100 µ L의 나머지 0.5 mL에 계란을 resuspend. 각 접시에 모든 5 개의 세균 잔디 위에 100 µ L를 동등 하 게 배포 합니다. 강포한 유형 긴장에 대 한 계란 해야 하지 밀도 접시 당 200 이상에서 입금 수.
   1. 계속 20 ° C 48 h에 대 한 하 고 L4 애벌레의 높게 균질 인구에서 접시. 지연된 성장 고기와 긴장에 대 한 그것은 가능한 많은 계란을 예금 하 고 부 화 시간을 증가 하는 것이 좋습니다. 예를 들어 daf-7(ok3125)를 유지-계란 부 화 하 여 L4 단계에 도달 수 있도록 ~ 64 h 20 ° C에서 기자 긴장을 포함 하.

7. 달걀 5 RNAi 기자 긴장의 치료

1. 직렬 SB의 15 mL를 사용 하 여 3 개의 격판덮개에서 벌레를 세척 하 고 살 균 15 ml 튜브에 액체를 수집. 자연스럽 게 앙금을 L4 애벌레를 허용 하 고 액체의 ~0.5 mL를 제외한 모든 발음. 야생 일반에전자 기자 긴장,이 단계 L4 보다 어떤 애벌레를 제거합니다. 돌연변이 배경에서이 단계는 daf-7(ok3125)의 경우 dauers와 같은 어떤 체포 애벌레의 제거 에이즈.
2. Resuspend SB의 9 mL와 벌레. 다시, L4 애벌레의 침전 속도 모니터링 하 고 일단 L4 애벌레의 대부분 있다 수송과 상쾌한의 ~0.5 mL를 제외한 모든 발음. 이 프로세스를 한 번 더 반복 합니다. 일단 대부분 L4 애벌레의 정착 다음 액체의 ~0.5 mL를 제외한 모든 발음.
3. 추가 10 µ L 살 균 S 기저의 0.1% 보충 Pluronic F-127 (SB + Plu) L4 애벌레를 포함 하는 액체. 이 계면 활성 제 역할을 하며 애벌레 플라스틱 피 펫 팁의 내부 표면에 집착 하는 것을 방지.
   1. 부드럽게 애벌레 계란 5 RNAi 박테리아의 5 x 225 µ L로 P200 낮은 보존 피 펫 팁과는 시드 3 10 cm RNAi 접시에 다음 aliquot 150 µ L를 사용 하 여 resuspend. 벌레는 동등 하 게 모든 5 개의 세균 잔디 분산 하는 확인 하십시오.
4. 액체는 agar에 흡수는, 모든 비-L4 애벌레 수동으로 그들을 따기에 의해 세척 절차에 의해 제거 되지 했다 접시에서 제거. 다음 접시 24 h. 20 ° C에서 저장

8. 넓은 범위의 박사의 개시

참고: 24 시간 계란 5 RNAi 치료, 후 접시에 원래 예금 되었다 L4 애벌레 될 것 이다 1 일 오래 된 성인.

1. 플레이트에만 1 일 오래 된 성인을 떠나,이 단계에서 사전 수동 제거 단계에서 탈출 어떤 젊은 애벌레 떨어져 선택.
2. 각 스트레인에 대 한 15 mL 튜브에 살 균 SB + strep의 15 mL와 함께 세 접시에서 1 일 오래 된 성인을 씻어. 자연스럽 게 토사 하 벌레를 허용 하 고은 상쾌한의 0.5 mL를 제외한 모든 발음. SB + strep의 9.5 mL와 함께 벌레를 resuspend 하 고 침전 및 세척 단계를 반복 하십시오.
3. 마지막 세척 후 앙금을 벌레 고 상쾌한의 0.5 mL를 제외한 모든 발음. 10 µ L SB + Plu를 추가 하 고 부드럽게 애벌레 P200 피 펫 팁 5 x 225 µ L 세균 농도 2 x 10 ⁹ 셀/mL에로 시드 NSC 접시에 다음 aliquot 100 µ L를 사용 하 여 resuspend. 모든 5 개의 세균 잔디밭에 걸쳐 균등 하 게
   1. 배포 100 µ L. 현미경 아래 접시에 동물의 수를 추정: 목표는 접시에 100-150 벌레 사이.
   2. 벌레 밀도 범위 내에서이 다음 두 개의 추가 접시에 약 수를 달성 하는 데 필요한 액체의 볼륨을 결정 합니다. 또한이 범위에가 고 다음 24 h. 20 ° C에서 접시를 저장 하는 첫 번째 접시에는 벌레의 수를 조정
4. 다음 날 2 일 오래 된 성인을 수집 하 고 새로운 NSC 접시의 음식 (표 1), 원하는 실험 농도와 시드 단계 2와 3 단계에 설명 된 방법을 재사용을 배포. 일단 액체에는 한 천, 흡수 판 24 헤에 대 한 원하는 실험 온도 이동
5. 다음날, 3 일 오래 된 성인을 수집 하 고 식품, 8.3, 8.4 단계에 설명 된 방법을 재사용의 동일한 실험 농도와 시드 신선한 NSC 판 배포. 일단 액체에는 한 천, 흡수 판 48 헤에 대 한 실험 온도 반환
6. 5 일 오래 된 성인을 수집 하 고 식품, 8.3, 8.4 단계에 설명 된 방법을 재사용의 동일한 실험 농도와 시드 신선한 NSC 판 배포. 일단 액체에는 한 천, 흡수 판 24 h. 실험 온도 반환

9. 기자가 긴장의 미세 이미징의 인해

1. 성년의 날 6, ²⁵ 사용자 지정 미세 플랫폼 ^{24 ,} 사용 하 여 동물 이미지. 물리적으로 세 접시에서 동물을 선택 하 고 포함 된 4.5 mL SB + strep의 5 mL 저온 관에 중단.
   1. 한번 벌레 토사는 상쾌한의 ~0.5 mL를 제외한 모든 발음 하 고 SB + strep의 4 mL에 동물을 resuspend. 이 세척 그렇지 않으면 이미징 방해할 수도 과잉 박테리아를 제거 합니다. 벌레는 압력 흐름 ^{24 , 25}를 구동을 통해 사용자 지정 미세 장치에 소개 된다. 장치 내에서 개별 벌레로 감독 고 압력 구동 칩에 밸브 ²⁶ 사용자 정의 소프트웨어의 통제에 의해 문이 이미징 채널 안에 갇혀.
2. 벌레 이미징 채널에 headfirst 갇혀, 일단 수집는 형광 z-스택, 표준 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 오일 목표 (1.3 없음)와 카메라 X 40와 2 µ m 단계에 50 섹션. 각 transcriptional 기자 동시에 방출 분배기를 사용 하 여 분석을 위한 저장의 빨강 및 녹색 형광 이미지를 수집 합니다. 사용자 정의 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 수집을 자동화.
3. 는 사용자 지정 MATLAB 스크립트 ²⁷ (https://github.com/meizhan/SVMelegans에서 사용 가능)를 사용 하 여 자동으로 이미지를 처리 합니다. Z-스택 MATLAB에 로드 되며 신경 쌍 및 이미징 비행기 내의 그들의 위치를 확인에 대 한 분석. 최대 예측 계산 되 고 하 고 임계 처리 알고리즘은 개별 형광 세포를 찾으려고 활용 하 고 있다. 셀 식별 다음 상대 거리와 벌레 내의 위치에 따라 계산 됩니다 ' s 머리.
4. 기자 형광, 척도를 z 스택의 각 세포 위치 주변 3 차원 볼륨을 추출 합니다. 모든 경우에 전체 셀을 완벽 하 게 캡슐화 밝은 픽셀의 일관 된 수 강도 통합.
모드의 추정을 통해 용기 (ADF 및 ASI) 가장 가까운 셀 쌍에 대 한 배경 강도 계산 하는
5. 각 동물의 창 자 자동 형광에 실험 조건 또는 스트레인 변경에서 간섭 제거 하는 신경 주위 볼륨에서 강도 분포입니다. 최종 출력을 가져오기 위해 통합된 형광이 배경 강도 값 빼기.

10. 데이터 어셈블리

참고: 형광 강렬 이미지 프로세싱 소프트웨어에 의해 분석 하는 모든 신경 세포의 유전자의 배포 프로필을 추정 하는 데 사용 되는 필터링된 식 데이터 파일 (연 준)으로 결합 되어 식 (c + + 스크립트 및 템플릿 R https://github.com/giovannidiana/templates에서 사용할 수 있습니다).

수동으로 확인 각 처리 이미지 모든 셀에 대 한 올바른 id를 확인 하려면

. 잘못 된 셀 식별과 이미지 제외 파일에 기록 합니다. 다이아나 외. (2017) ¹³ 제외 파일 구성으로 이진 표 ' 0 '에 대 한 수정 및 ' 1 ' 잘못 된 셀 식별. 테이블에 있는 행의 수는 벌레 몇 군데 각 셀에 대 한 열 군데 (즉, ASI, ADF 및 NSM)의 수.

연 준 파일 생성:

1. 실행 bash 스크립트 " gen_data + 시간 " 제외 파일을 사용 하 여 필터링 셀 전용 파일 결합 각 벌레 몇 군데에서 가져온 식 값을 생성 하. 이미지 프로세싱 소프트웨어에 의해 생성 된 각 폴더에 대 한 bash 스크립트 주석 파일을 읽고 < folderprefix > 실험 조건 및 제외 파일을 추출 하는 _EXP.txt < folderprefix > _X.csv만 올바르게 선택 하 뉴런을 식별합니다. 식 값은 파일에서 읽을 < folderprefix > _data_ < 신경 >.csv.
2. 에 모든 파일을 연결 하 여 " FED_split.dat " 및 실험 배치 코드에 의해 정렬, 레이블 및 셀 정체성 벌레.
3. 실행 " 종류 " (c + + 프로그램, 사용법:. FED_split.dat FED_merged.dat 정렬 /)와 0이 아닌 형광 각 셀에 대 한 항목을 선택 하 고 FED_merged.dat에 단일 행으로 그들을 결합 하.

11. 평가 정보 인코딩

참고: 다음 절차 진 식의 집합에 의해 특정 환경 조건에 대 한 정보를 계량 하는 방법에 설명 합니다. 다이아나 외에 (2017) 그러나 ¹³, 환경에서 음식 풍부에 대 한 인코딩된 정보 조사 되었다,, 방법 자체는 어떤 개별 환경 상태 수에 적용 됩니다. 정보 엔트로피 등 중복 정보 이론적 변수 척도를 필수 요소 고려 설정된 환경 자극에 신경 응답의 합동 확률 분포 이다. 이러한 추정을 수행 하려면 그것은 벌레의 인구에 걸쳐 응답의 충분 한 샘플링을 중요입니다. 상대적으로 작은 샘플;에서 가우스 분포를 예상할 수 있습니다 그러나, 신뢰할 수 있는 밀도 추정에 대 한 적절 한 샘플 크기를 계량 식 배포의 예상된 모양의 아이디어가 중요 하다. 때문에 다른 시험에서 피할 수 없는 다양성, 그것은 에센셜 같은 실험의 다른 반복에서 얻은 배포판의 중앙 값 체계적으로 이동 하지는 확인 또는 그의 통계 기능에 식 배포는 재판에서 크게 변경 되지. 그것은 재판 재판 재판 재판에 영향을 주는 그 환경/생물 요소 평균을 내는 벌레의 수 대 수의 균형을 중요 한 경우에 재판 재판 변화는 각 시도 내의 가변성와 호환, 가변성입니다. 그 요인 언더샘플링 수 무 겁 게 편견을 정보 이론적 분석.

R로 스크립트

" code3D.R " 파일 기반 3 차원 밀도 생성 하기 위한 템플릿을 제공 합니다 " FED_merged.dat ", 특정 연방 헤더 형식에 따라이 서식 파일을 수정. 목록 " HeaderNames " 동안 연 준 파일에서 각 필드의 이름을 나타내는 " RONames "는 판독의 목록입니다. R 패키지를 사용 하는 스크립트 ' ks ' ^{28 , 29} GS로 hypercubic grid 내의 다변량 분포를 추정 하는 최소값과 최대값 사이의 범위를 분할 하는 각 차원에서 통 각 판독에 대 한 데이터 집합의 값입니다. 때 내부 변수 " 그룹 " 모든 데이터 밀도 추정에 사용 되는 0으로 설정 됩니다. 경우는 " 그룹 " 라벨 1-5 데이터 집합 5 분리형 세트,으로 나누어져 사이 이며 식 밀도 제외 5 개 세트 중 하나에서 발생 하는 데이터의 80%에서 견적 된다. 이 기능은 나중에 불확실성 추정에 사용 됩니다.
참고: code3D.R의 사용: Rscript code3D.R < GT > < 음식 > < GS > < outfolder > < 레이블 > < 그룹 > < frac > GT 나타냅니다 유전자 형, 어디 음식 환경 조건, outfolder는 기존의 폴더를 배포판 저장 됩니다, 파일 이름 접두사입니다 frac 사용 되는 데이터 집합의 일부입니다.

다른 그리드와 복수 배포판을 생성 하는 각 환경 상태에 대 한 GS (예: 20,30,40 쓰레기통) 크기. 미세한 해상도 변경 되지 않습니다 크게 정보 추정 때 계산 부하를 줄이기 위해, GS의 작은 값은 바람직. 유전자 발현 배포 폴더 작성 된 < outfolder > 파일 이름 구조와 code3D.R로 단일 열 텍스트 파일을 실행할 때 지정 된 < 레이블 > _ < GT > _ < 식품 > _GS < GS > _group < 그룹 >. dat.
참고: 조건부 확률 분포의 견적을 제공 하는 이전 단계에서 g 나타냅니다 모든 지요의 벡터와 f는 환경 조건. 그러나, 유전자 발현 및 환경 ^{30 , 31} 간의 상호 정보를 계산 하.

우리는 입력의 배포 필요 유전자 발현을 평균 또한 결정 하는 (입력-) < img alt = "방정식 4" src="/files/ftp_upload/56292/56292eq4.jpg" / >. 입력된 분포, 직접 사용할 수 없는 경우 코딩 기능을 특성화 하는 의미 있는 수량은 모든 가능한 입력된 배포판에 걸쳐 상호 정보를 극대화 하 여 얻을 수 있는 채널 용량.

아리 Blahut ³² 알고리즘 시스템의 채널 용량 및 정보를 극대화 하는 환경 입력의 분포 추정을 적용 유전자 발현 분포를 사용 하 여. 알고리즘의 구현 예제는 c + + 프로그램에서 찾을 수 있습니다 " Ccap3D.cpp " 3 차원 유전자 발현에 대 한 코드 분석 다이아나 외. (2017) ¹³. 예: GT123 유전자 형에서 배포판에서 가져온 경우 데이터 (그룹 3) 그리드 크기의 80 0 평등 및 폴더에 저장 ". /pdf/ " 접두사 레이블을 사용 하 여 = " PDF ". GT123 배경에서 인코딩된 정보를 계산 하는 명령은. / Ccap3D GT123 pdf PDF 30 3
참고: 시스템에 의해 인코딩된 정보 추정 불확실성의 밀도 추정을 포함 한 여러 소스에 의해 영향을 알고리즘 및 샘플 크기 바이어스입니다. 각 알고리즘에 의해 도입 된 체계적인 바이어스의 크기를 평가 하기 위해 서로 다른 밀도 추정 방법을 사용 하 여 단계 11.1-11.2를 반복 해야 합니다.

샘플 크기에 따른 불확실성을 추정 하는 1 ~ 5 사이의 그룹 단계 11.1-11.2에서에서 정보를 다시 계산. 데이터의 80%의이 5 개의 독립적인 samplings에서 다양성 정보 추정에 샘플 크기의 영향을 반영 합니다.

계산 하는 단계를 사용 하 여 정보 샘플 크기 바이어스에 대 한 수정 (단계 5)에서 같이 데이터의 증가 이상의 11.1-11.2 (Jack-knife 메서드) ³³.

12. 중복, 잡음 및 신호 상관 관계의 계산

1. 사용 최적 입력된 분포 상호 정보를 계산을 최대한 정보 견적에서 얻은 N 각 뉴런의 입력 및 유전자 식 응답 사이. C + + 소스 파일 " GetMI1D.c " 정보를 얻기 위해 한계 상호 공동 확률 분포에서 샘플 프로그램입니다.
2. 위에서 얻은 각 뉴런에 대 한 상호 정보의 합계를 복용 함으로써 중복 계산 하 고 채널 용량을 뺍니다.
3. 계산에서 " 셔플 " 정보 용어 ^{13 , 34}. 템플릿 c + + 소스 파일에서 찾을 수 있습니다 " GetShuffle.c ".
4. 사용은 " 셔플 " 신호 및 잡음 상관 관계를 계산 하는 기간. 시그나에 대 한우리는 l 상관 관계 우리는 소음 상관 관계에 대 한 .
5. 중복에 불확실성 잡음 및 신호 데이터와 표준 편차의 80%의 여러 samplings에서 총 정보 (이전 섹션의 단계 11.3)에 관해서는 상관.

Results

야생 타입 N2 스트레인 함께 관심사의 유전자의 돌연변이 대 한 수명 실험을 실시 하 여 한이 유전자는 넓은-범위 박사 식품 응답에서 역할 여부를 설정할 수 있습니다. 야생 유형 응답 그림 1A에 묘사 된 것을 비교 해야 합니다. 돌연변이, 음식 조건, 비균일 효과로 반영이 응답의 어떤 변조는 이러한 유전자 올바르게 변화에에서 대응 하의 어느 지점 추가 조사에 음식 풍부 하는 벌레의 능력에 영향을 나타냅니다는 넓은 범위의 박사이 유전자의 식 응답 보증 된다. 그러나, 돌연변이의 장 수 응답 하지 않으면 크게 다른 야생 유전자는 적어도 평균 수명 수준에서 넓은 범위의 박사의 효과 시험 아무 역할이 있다. 변이 원인이 전체 수명 응답의 일정 한 변화 유전자 장 수에 음식에 관계 없이 영향을 미칠. 이 관심사의 유전자의 표정은 음식-응답, 정보가이 유전자에 의해 수행 하는 경우 수명에 전송 되지 않습니다 가능성 배제 하지 않습니다.

프로토콜의 다음 단계는 식 레벨 관심의 유전자에 대 한 광범위 한 범위의 박사에서 변경 하는 방법을 결정 하는. 그림 1B, 우리 daf-7, ASI 감각 신경에 있는 음식 수준에 변화에 대 한 응답을 보여주는의 transcriptional 기자의 식 레벨을 통해 이것을 설명 합니다. Daf-7(-) 돌연변이에 transcriptional 기자의 식 응답 변경 됩니다. 수명 수준에서의 유전자 정말 음식 반응 있다면 하나 그들의 식 음식으로도 변화할 것 이다 기대할 수 있습니다. 대응 하 게, 돌연변이 백그라운드로 transcriptional 기자 박사는 광범위 한 범위에 대 한 응답에서 변경된 식 프로필을 있어야 합니다. 그러나, 그것은 또한 가능한 야생 타입 백그라운드에서 관심사의 유전자의 transcriptional 기자 식에 어떤 음식 반응 변화를 표시 하지 않습니다. 이 상황에서이이 프로토콜의 범위를 벗어나는 post-transcriptional 규제 효과 나타낼 수 있습니다.

다이아나 외. (2017)¹³, 우리는 ASI에 daf-7 및 ADF 및 NSM tph-1 식 값 추출. 그림 2A, 우리는 주어진된 음식 수준 ASI와 ADF에 식 분포의 추정을 보여 줍니다. 단일 벌레 이미지에서 여러 해독 하는 데 뿐만 아니라 양의 전체 신경 회로 (그림 2B-2 C)의 조합 정보 뿐만 아니라 각 신경에 의해 독립적으로 인코딩 정보를 분석할 수 있습니다. 결합이 두 가지 정보 이론적 측정 음식에 대 한 정보를 전달 하는 뉴런에 의해 고용 하는 인코딩 전략 측면에서 시스템의 특성을 수 있습니다. 회로에서 중복의 금액 합계의 각 뉴런에 대 한 상호 정보 공동 상호 정보 (채널 용량) 회로의 조합 해독을 고려 하 여 얻은 빼서 여 얻어질 수 있다. 이러한 차이의 양수 값 부품 중 누적 정보는 실제 정보 전체 회로 의해 보다 큰 때문에 인코딩 전략의 중복 문자를 나타냅니다. 진정한 정보 인코딩 구성 요소 (그림 2B)의 합 보다 더 큰 때문에 반대로 음수 값 시너지 전략을 반영 합니다. 정보 및 중복 다이아나 외 에 예를 들어 유전자 규칙의 가능한 더 높은 순서 역할을 탐험 다른 genotypes에서 비교 될 수 있다 (2017) ¹³ daf-7 돌연변이의 효과 상승 (그림 2C-2D)를 중복에서 인코딩 전략을 전환합니다.

그림 1 : 넓은 범위 박사에서 수명 및 유전자 표현의 응답 야생 타입 N2 스트레인 (검은 선)의 (A) 평균 수명 박사는 광범위 한 범위에 대 한 복잡 한 응답을 표시 합니다. 이 응답의 크기는 daf-7 진 (레드 라인)의 null 돌연변이에 감쇠입니다. 오차 막대를 나타내는 평균, Entchev 그 외 여러분 에서 풀링된 데이터의 표준 오차 (2015) ¹². 야생 타입 배경 (검은 선)에 daf-7 유전자에 대 한 transcriptional 기자 (B) 평균 식 수준 또한 광범위 한 범위 박사에 대 한 복잡 한 단조 비 응답 표시. Daf-7(-) 유전 배경에서이 transcriptional 기자의 식 높은 감쇠 하 고 음식 수준에 작은 변화에 대응을 보여줍니다. 오차 막대를 나타내는 평균, Entchev 그 외 여러분 에서 단일 재판에서 데이터의 표준 오차 (2015) ¹². 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 계산 방법론. ASI로 그리드 차원 30 x 30을 사용 하 여 'ks' R 패키지에 ADF와 daf-7 식에서 tph-1 식의 2 차원 밀도 추정의 (A) 그림. Tph-1 및 daf-7 (전체)의 공동 식으로 인코딩된 정보 (B) 시각화 개별적으로 (부품의 합계) ADF, ASI 및 NSM 뉴런에 대 한. 중복 및 시너지 문자 인코딩의 오른쪽에 누적 세로 막대의 높이 전체 회로 의해 인코딩된 정보 사이 다름에 의해 표시 됩니다. (C) 식품 정보 야생 유형 동물 및 daf-7(-) 돌연변이 의해 사이 비교. (D) 상호 정보 돌연변이에서 관찰의 감소는 시너지 인코딩 쪽으로 스위치를 동반 된다. 패널 B-D는 다이아나 외. 에서 적응 (2017) ¹³. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

세균성 농도 (셀/ml)	광학 밀도 (600nm)	(이전)에서 희석 요인
1.12E + 10 일	56.000	0.00
2.00E + 일 09	10.000	5.60
6.32E + 08 년	3.160	3.16
6.32E + 07 년	0.316	10.00
2.00E + 07 년	0.100	3.16
0 (S 기초)	0.000	NA

표 1: 음식 수준 및 넓은 범위 박사에 사용 되는 희석 요인 박테리아l 농도 (셀/mL) 그들의 각각 OD₆₀₀ 측정 및 이전에서 각 농도 달성 하는 데 필요한 희석 요소는 광범위 한 범위 박사 프로토콜 사용.

	수명 실험 온도
하루	12.5 ° C	15 ° C	17.5 ° C	20 ° C	22.5 ° C	25 ° C	27.5 ° C
-12	신선한 NGM 접시에 모든 종자를 청크와 20 ° C에서 유지
-11
-10	Daf-7(-) 긴장의 P0 세대를 설정 하 고 (접시 당 1 L4, 5 접시) 20 ° C에서 유지
-9	강포한 유형 긴장의 P0 세대를 설정 하 고 (접시 당 1 L4, 5 접시) 20 ° C에서 유지
-8
-7
-6
-5	Daf-7(-) 종자의 f 1 세대를 설정 하 고 (접시 당 1 L4, 90 접시) 20 ° C에서 유지
-4	강포한 유형 긴장의 F1 세대를 설정 하 고 (접시 당 1 L4, 30 접시) 20 ° C에서 유지
-3
-2
-1
0	F2 L4 애벌레를 선택 > 계란 5 RNAi 플레이트 및 20 ° c (접시, 24 접시 당 15 L4) 유지
1	NSC 판 2.0 e + 9 셀/ml 음식 수준 시드 1 일 오래 된 성인을 이동 하 고 20 ° C에서 유지
2	NSC 접시 실험 음식 조건 시드 실험 온도 2 일 오래 된 성인 이동
3	전송	전송	전송	전송	전송	전송	전송
4
5	전송	전송	전송	전송	전송	전송	전송
6
7	전송	전송	전송	전송	전송	전송	전송
8
9	전송	전송	전송	전송	전송	전송	전송
10
11	전송	전송	전송	전송	전송	전송
12
13
14	전송	전송	전송	전송
15
16
17
18	전송	전송
19
20
21
22	전송

표 2: 다른 온도에서 실시 하는 수명에 대 한 일정. 예제로 daf-7(-) 및 야생 유형 긴장을 사용 하 여 서로 다른 온도에서 넓은 범위의 박사 수명 실험 설정 하는 데 필요한 단계의 개요 개요. 각 실험 식품 수준의 신선한 번호판 전송 수 온도 증가 함께 감소 합니다. 이것은 높은 온도에서 동물 더 빠르게 노화 사실과 그래서 더에 대 한 계정에 전송 물리적 손상 하는 경향이 있다.

일

Ima

깅 파이프라인 -14 Daf(-) 배경에서 청크 기자 변종입니다. 20 ° c.에 유지 -13 야생 타입 백그라운드에서 청크 기자 변종입니다. 20 ° c.에 유지 -12 Daf-7(-) 기자 긴장의 P0 세대를 설정 합니다. 10 cm NGM 접시 당 3 L4 애벌레를 사용 합니다. 2 접시를 사용 하 고 20 ° c.에 유지 -11 -10 야생 타입 기자 긴장의 P0 세대를 설정 합니다. 10 cm NGM 접시 당 3 L4 애벌레를 사용 합니다. 2 접시를 사용 하 고 20 ° c.에 유지 -9 -8 Daf-7(-) 기자 종자의 f 1 세대를 설정 합니다. 10 cm NGM 접시 당 3 L4 애벌레를 사용 합니다. 12 접시를 사용 하 고 20 ° c.에 유지 -7 -6 야생 타입 기자 종자의 f 1 세대를 설정 합니다. 10 cm NGM 접시 당 3 L4 애벌레를 사용 합니다. 4 접시를 사용 하 고 20 ° c.에 유지 -5 -4 -3 오후에 daf-7(-) 기자 긴장을 표 백제 (~ 5 분) 3 10 cm NGM 접시에 달걀을 입금 하 고 20 ° c.에 유지 -2 표 백제 야생 타입 기자 (~ 10) 오전 아침에 예금 NGM 접시 3 10 cm에 계란 긴장과 20 ° c.에 유지 -1 0 L4 10 cm 달걀 5 RNAi 접시를 씻는 다. 스트레인 당 3 접시를 사용 하 고 20 ° c.에 유지 1 NSC 판 2.0 e + 9 셀 시드 1 일 성인 세척/ml. 스트레인 당 3 접시를 사용 하 여 그리고 20 ° c.에 유지 2 NSC 판 워시 2 일 성인 실험적인 음식 수준으로 시드. 긴장과 변화 당 3 접시를 사용 하 여 실험 온도. 3 신선한 NSC 접시에 전송. 스트레인 당 3 접시를 사용 하 고 실험 온도에서 유지. 4 5 신선한 NSC 접시에 전송. 스트레인 당 3 접시를 사용 하 고 실험 온도에서 유지. 6 접시에서 동물을 선택 하 고 이미지에 대 한 준비.

표 3: 이미징 파이프라인에 대 한 일정. 넓은 범위의 박사 이미징 실험 다른 온도에 daf-7(-) 및 야생 유형 배경 예제로 형광 transcriptional 기자 종자를 사용 하 여 설정 하는 데 필요한 단계의 개요 개요.

Discussion

여기, 우리는 훨씬 광범위 한 식품 농도 보다 이전에 게시 프로토콜을 캡슐화 하는 식이 제한에 대 한 새로운 방법을 제시. 이 방법은 링크 C. 선 충 박사 문학에서 본 두 이전 별도 현상, 세균성 부족과 수 두 식이 효과 수 있도록 클래식 식이 제한 연구 한 프로토콜. 새로운 확장 범위 박사 패러다임을 사용 하 여, 특정 환경 큐에 응답에 단일 세포 유전자 발현을 검토 하 고이 셀 정보를 인코딩 하는 방법에 대 한 일반적인 프레임 워크 선물이. 우리의 프레임 워크 수명 및 양적 이미지를 각각 수행 하는 방법을 보여 주는 두 개의 실험 프로토콜을 광범위 한 범위에서 이러한 실험 프로토콜에서 박사 데이터 다음 시험 될 수 있다에서 제공 하는 전산 분석 다른 음식 조건에서 변화 유전자 식 수준이 나 수명에 의해 인코딩된 정보를 계량 하이 프레임 워크.

넓은 범위의 박사 패러다임을 사용 하 여 수명 실험 포함 6 가지 음식 수준 (표 1). 이 적은 음식 수준, 규정식 부족^10,11 등에서 장 수 검사 또는 먹고 2 유전 배경³⁵를 사용 하 여 보다 더 많은 접근을 필요로 합니다. 그러나, 단일 조건 하에서 수명에서 검토 박사에서 유전자의 역할의 해석을 제한할 수 있습니다. 예를 들어 우리는 최근에 daf-7 돌연변이 야생 타입 동물¹² (그림 1A)에 비해 음식 농도에 대 한 응답의 양방향 감쇠는 보여주었다. 식품의 부재, daf-7 돌연변이 야생 타입 동물에 비해 그들의 수명 단축을 표시 합니다. 우리만 식이 부족을 고려 했다, 만약 우리 것 이라고 해석 하는 daf-7 유전자, 만 수명 확장에 필요한 사실 daf-7 역할은 더 복잡 한 되 고. 따라서, 프로토콜의이 부분의 중요 한 결과 여부 관심사의 유전자를 설정 하는 음식에는 전체 수명의 변화에 대응을 변조에 관여입니다.

다른 방법에 비해이 프로토콜의 주요 장점 중 하나 자손 생산 수명 분석을 진행 하는 동물에서을 제거 하는 새로운 방법을 사용 한다는 것입니다. 대부분 연구 약물 FuDR를 사용 하 여 그들을 렌더링 하는 살 균 성인 생식의 확산을 억제. 그러나, 최근 학문 보여주었다 FuDR 치료 수명^{17,,1819,20,21}, 호출 상태 및 유전자 특정 효과 가질 수 있습니다. 그것의 일반적인 적용을 질문입니다. 이 프로토콜에서 자손 생산의 24 시간을 통해 달성 된다 RNAi의 틴 달걀 껍질의 형성을 억제, 계란-5 유전자를 대상으로 동물의 치료 결과에 선 충 C. oocytes 수정 된 그들의 죽음의^22,23. 이 방법의 장점은 매우 늦은 연기 고 그래서 C. 선 충에서 장 수의 주요 레 귤 레이 터는 생식 방해 하지 않습니다.

넓은 범위의 박사 프로토콜의 한 잠재적인 경고는 세균성 농도의 꽉 제어 되도록 세균 확산을 제어 하는 항생제의 사용에 대 한 의존도. 벌레의 용기 내의 세균 확산 C. 선 충¹⁶에서 죽음의 주요 원인이 될 알려져 있다. 따라서, NGM agar에 carbenicillin 같은 bacteriostatic 항생제를 사용 하 여 세균 확산을 방지 하 고 비 항생제 컨트롤¹⁶에 비해 벌레의 수명을 증가. 항생제, 리 팜 피신^{36 38}항생물질 가족^37,멤버 등 특정 유형의 박테리아에 미치는 영향에 관계 없이 C. 선 충 에서 수명 연장 표시 되었습니다. 확산입니다. 그러나, carbenicillin 또는 스 세균성 확산에 미치는 영향에 관계 없이 장 수를 증가할 수 있다 문학에서 증거가 있다.

수명 환경 정보, 신경 네트워크, 유전자 발현에 의해 라우팅 생리학에 전송 되는 복잡 한 계산의 출력으로 볼 수 있습니다. 어떻게 특정 유전자를 이해 하는 방법론을 제공 하는 우리의 프로토콜 환경 정보의이 흐름에 영향을 미칠. 이 문제를 해결 하려면 우리는 신뢰할 수 있는 이미지 처리를 단일 세포 수준에서 유전자 식 응답 분포를 결정 해야 합니다. 뿐만 아니라 음식 풍부에서에 유전자 발현의 평균 응답 변경 하지만 또한 큰 인구에서 전체 통계 분포 나타냅니다 우리의 방법의 적용에 대 한 중요 한 요구를 추정 수 있는. 음식 풍부한 유전자 식 응답의 정확한 설명을 특정 뉴런에 의해 정보 뿐만 아니라 신경 회로 의해 고용 된 코딩 전략 계량 정보 이론의 응용 프로그램 수 있습니다.

이 프로토콜에서 설명 하는 방법의 이미징 및 계산 측면 생물 학적 상황의 큰 집합에 적용 됩니다. 그러나 우리의 작업에서 우리 음식에 관련 된 작은 신경 네트워크에 감지,, 정보 처리 기능 분석에 국한 되지 않습니다 특정 셀 형식이 나 특정 환경 신호 집중. 미래에 이러한 방법론 큰 다양 한 생리 적인 출력에 영향을 미치는 입력된 변수를 잠재적으로 확장할 수 있습니다. 이러한 방식을 어떻게 유전자 규제 네트워크 부호화, 프로세스의 더 큰 이해에 기여 하 고 정보 전송 것입니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
카르베니실린 디소듐 염	시그마-알드리치	C1389-5G	항생제
스트렙토마이신 황산염 시	그마-알드리치	S6501-50G	항생제
; 이소 프로필 β -D-1- 티오 갈락 토피라 노시드 (IPTG)	RNAi 플레이트 용	시그마-알드리치	I6758-10G
염화나트륨 (NaCl)	시그마 알드리치	71380-1KG-M	및 NGM 한천
디 칼륨 인산염 (K2HPO 4)	Sigma-Aldrich	1.05104.1000	S 기저 및 NGM 한천
이수소 인산염 칼륨(KH2PO4 )	Sigma-Aldrich	P9791-1KG	S 기저에 사용되며 NGM 한천
황산 마그네슘 (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M2643-1KG	NGM 한천
에 사용됩니다.염화칼슘 (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670-500G	NGM에 사용
한천 수산화나트륨(NaOH)시	그마-알드리치	71687-500G
Pluronic-F127	Sigma-Aldrich	P2443-1KG
차아염소산나트륨(NaClO)	Sigma-Aldrich	1.05614.2500
LB Broth	Invitrogen	표	12780052 박테리아 성장에 사용
Adavanced TC 6cm 조직 배양 플레이트	Greiner Bio-One	628960	수명 플레이트
CellStar 10cm 조직 배양 플레이트	Greiner Bio-One	664160	이미징 용 플레이트
Low Retention P200 팁	Brandt	732832	액체
한천	BD	214510	NGM, RNAi 및 NSC 플레이트용 Agar
토 펩톤	BD	211820	NGM, RNAi 및 NSC 플레이트용 펩톤