Mitophagy, 개간 손상 된 미토 콘 드리 아의 과정은 미토 콘 드 리아 항상성 및 건강 유지 관리를 위해 필요 합니다. 이 문서는 최신 mitophagy의 일부 인간 세포, 꼬마 선 충, 및 마우스 감지 방법을 선물 한다.
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이 논문에서
요약
초록
미토 콘 드리 아 셀의 강국입니다 그리고 ATP의 형태로 세포 에너지를 생산. 미토 콘 드 리아 기능 장애는 생물학적 노화 및 질환 대사 질환, 조기 노화 증후군, Alzheimer의 질병 (광고) 및 파 킨 슨 병 (PD)와 같은 신경 퇴행 성 질환 등의 다양 한에 기여 한다. 미토 콘 드리 아 건강의 유지 보수는 미토 콘 드리 아 속 mitophagy 통해 역 기능 mitochondria의 효율적 허가에 따라 다릅니다. 정확 하 게 감지 하 autophagy/mitophagy, 특히 동물 모델 실험 방법 개발에 도전 있다. Mitophagy의 분자 메커니즘의 이해로 최근 진행은 소설 mitophagy 탐지 기술 개발을 활성화 하 고 있다. 여기, 인간의 세포, 꼬마 선 충 mitophagy 모니터 여러 다양 한 기법 소개 (예를 들어, 윈저 DCT-1 / 하는지 1 긴장), 마우스 (mt Keima). 간 종 평가 포함 하 여 이러한 mitophagy 탐지 기술의 조합 mitophagy 측정의 정확도 개선 하 고 mitophagy 건강과 질병에서의 역할의 더 나은 이해로 이어질.
서론
Mitophagy은 미토 콘 드리 아 유지 보수를 위해 필수적 이다. 미토 콘 드리 아 여러 세포 신호 경로 교차 하 고 보편적인 하위 세포 세포 세포 에너지 생산과 세포 물질 대사, 칼슘 항상성1,2,3, 에 대 한 책임은 4. 미토 콘 드리 아 끊임없이 경험 반응성 산소 종 (선생님)와 미토 콘 드리 아 이용과 같은 내 인 성 및 외 인 근원에서 과제 각각, "세"와 역 기능 mitochondria의 세대 이끌어 내는. 손상 된 미토 콘 드리 아의 축적 유해한 ROS의 양을 증가 하는 동안 ATP 생산의 효율성을 감소 하 고 대사 질환, 광고, 같은 나이 관련 된 질병에 연결 되었다 PD1,5,6 . 유도 미토 콘 드리 아 세포 역 기능을 방지 하기 위해 셀 필요가 특히 미토 콘 드리 아를 손상 인식 하 고 효율적으로 세포 과정을 통해 그들을 제거 미토 콘 드 리아 autophagy를 (mitop....
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프로토콜
동물 (남성 및 여성 쥐)는 태어나 고 NIH 동물 관리 및 사용 위원회의 승인에 따라 공인된 동물 시설에서 사육 했다. 안락사 메서드는 모든 국가 및 기관의 규정에 일치 해야 합니다.
1입니다. 인간의 세포에 Mitophagy의 탐지
- Mt Keima 플라스 미드를 사용 하 여 mitophagy의 검출
참고: mt-Keima, 서 간체 미토 콘 드리 아 대상 신호 융합 Keima 단백질 mitophagy 검색 비보에 유용한 입증 했다. mt Keima 녹색 형광 (여기 458 nm) 기본 또는 중립 조건 및 산 성 조건에서 빨간색 형광 (여기 561 nm) 전시 비율 pH에 민감한 형광 단백질 이다. 건강 한 미토 콘 드리 아 기본 또는 중립 조건 (pH 7-8)에 번 창 하 고 산 Keima와 페 때 녹색 형광으로 표시 됩니다. 미토 콘 드리 아 mitophagy 받을 때 산 성 리소좀과 융합, pH 4.5 고 산 Keima를 포함 하는 미토 콘 드리 아 전시회 빨간 형광6,,1314. 중요 한 것은, 산 ....
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결과
인간 세포에 Mitophagy의 검출:
여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 인간 헬러 세포 mt Keima 플라스 미드와 페 했다. 건강 한 세포는 잘 조직 된 미토 콘 드 리아 네트워크 시연 (GFP, 488 nm)와 mitophagy의 몇 가지 부각 (RFP, 561 nm). 그러나, 세포는 미토 콘 드리 아 uncoupler FCCP와 청소용 (3 h 30 µ M) mitophagy 발생 (그림 1A)에서 깊은 증가 전시. Mitophagy는 LAMP2와 COXII (그림 1B) 사이 공동 지역화를 사용 하 여 측정 했다.
C. 선 충 에.......
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토론
Mitophagy의 정확한 측정은 기술적으로 요구 하 고 있다. 여기, 우리는 mitophagy의 질적 모두 검출 및 정량화의 가장 일반적인 실험실 실험 모델 mitophagy 수준에 대 한 허용 하는 여러 가지 강력한 기법 제시.
복제할 데이터를 얻기 위해 적어도 3 개의 생물 학적 반복 된 실험 설계는 필요 하다. 실험 및 분석에 관련 된 모든 연구 실험 그룹 id에 멀게 합니다. 또한, 필드 이미징 선택 되어야 한다 무작위로 이미지 중. 세포 배양 및 C. 선 충 연구, 적어도 3 개의 생물 학적 반복 수행 되어야 한다. Mt Keima 마우스 연구, 쥐의 충분 한 번호를 사용 하 여 통계적 의미를 달성 하는 것이 좋습니다. 포유류 세포에 대 한 각 실험에 대 한 30-100 셀을 분석 하 고 적어도 3 다른 실험을 실행 합니다. 이 단계에서 품질 관리 결과를 복제할 수 있습니다. 효 모에 mitophagy의 감지 되었습니다 최근
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공개 사항
보어 연구소 ChromaDex와 GlaxoSmithKline CRADA 준비 하고있다.
감사의 글
우리 박사 아츠 시 미 야와 키와 박사 리처드 J. Youle mt Keima 플라스 미드를 공유 하기 위한 감사 및 mt Keima 통합 Hela 세포. 우리는 원고의 중요 한 독서에 대 한 Raghavendra A. Shamanna와 박사 데보라 L. Croteau 감사합니다. 이 연구는 NIH (VAB)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다, 노화, 2014-2015 년에 국립 연구소와 NIA 2016-2017 내부 실험실 (EFF, VAB) 부여 합니다. EFF HELSE 대단히 OST RHF에 의해 지원 되었다 (프로젝트 No: 2017056)와 노르웨이의 연구 위원회 (프로젝트 No: 262175).
작가 기부:
EFF는 원고를 설계 하 고 준비 초안; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH, 그리고에 드 쓴 다른 부분의 종이; NT, JP, HN, VAB 개정 원고와 전문성을 제공.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| mt-Keima mouse | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 DNA transfection 시약 | Thermofisher | #11668027 | |
| Opti-MEM medium (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | 무혈청 배지 |
| mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| COXII 항체 (마우스) | abcam | #ab110258 | |
| LAMP2 항체 (토끼) | NOVUS | ||
| 적색 형광 단백질(RFP) 파장 568 nm의 염소-안티-토끼Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 염료 | |
| 염소-안티-마우스(파장 488 nm의 녹색 형광 단백질(GFP) | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 염료 |
| Invitrogen | 으로 금 퇴색 방지를 연장합니다 | #P36931 | |
| 6웰 플레이트 | SIGMA , Corning Costar | #CLS3516 | |
| 4웰 챔버 슬라이드 | , THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F, 96웰 플레이트 | , Thermofisher | #152038 | |
| LC3B 항체, 토끼 | NOVUS | #NB100-2220 | |
| DNA 항체 | Progen Biotechnik | #anti-DNA 마우스 단클론, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | 가 있는 퇴색 방지 장착 매체 |
| Healthcare Life Sciences | #IN 세포 분석기 2200 | ||
| Eclipse TE-2000e 컨포칼 현미경 | Nikon | #TE-2000e | |
| 공동 현지화 소프트웨어 | Volocity | #Volocity 6.3 | 대안 Zeiss ZEN 2012 소프트웨어 |
| IN 세포 조사자 소프트웨어 | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| 세포 배양 매체 | Thermofisher | #DMEM– Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| 세포 배양 인큐베이터 | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator | |
| epifluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| 카메라 | 올림푸스 | 올림푸스 DP71 | |
| 컨포칼 현미경 | 자이스 | 자이스 Axio Observer Z1 | |
| 컨포칼 소프트웨어 | Zeiss | ZEN 2012 | |
| 이미지 분석 소프트웨어 | Image J | 공동 국소화 분석 등 | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| 통계 분석 소프트웨어 | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism 소프트웨어 패키지 | |
| 재료는 웜 픽을 만들기 위해 Surepure | Chemetals | #4655 | 픽은 30 게이지 90% 백금 10% 이리듐 와이어 |
| IR: N2로 만들어집니다. Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | Tavernarakis Nektarios | 형질 전환 동물을 20 °로 유지하십시오. C | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed에게 재료 문의 :: LGG-1 | Tavernarakis Nektarios | ||
| 파라콰트 용액 | 준비 | ||
| 에 대한 추가 데이터 참조 | |||
| 준비 M9-레바미솔 버퍼 | 준비 | ||
| 유리 현미경 슬라이드 및 커버슬립 | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| 수술용 집게 | STERIS 동물 건강 | 19개 개 중성화 수술 팩 경제 | |
| 수술용 가위 | STERIS 동물 건강 | 19개 개 중성화 수술 팩 경제 | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS는 ddH2O 쉐이커를 사용하여 1x PBS로 희석해야 |
| Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP 테이블탑 오비탈 소형 오픈 에어 플랫폼 쉐이커 패키지 A | |
| 2% 아가로스 패드 | 준비를 | ||
| Vibroslice 블레이드 | 세계 정밀 기기 | #BLADES-2 | 싱글 엣지 |
| 블레이드 메탈 플레이트 | MSC | #78803988 | 0.012 인치 두께 x 6 인치 너비 x 12 인치 길이, 430 스테인리스 스틸 시트 |
| Triton X-100 | 세제 | ||
| : 메틸 바이올로겐 이염화물 수화물 | : Sigma-Aldrich | #856177 | 파라콰트 |
| 인큐베이터 | AQUALYTIC | 인큐베이터; C | |
| 해부 실체 현미경 | Olympus | SMZ645 | |
| 컨포칼 현미경 | Zeiss | AxioObserver Z1 | 선충 (2 단계) |
| epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z2 | 선충 (2 단계) |
| UV crosslinker | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 | UV 광원, 356nm |
참고문헌
- Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3)....
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재인쇄 및 허가
