생체 외에서 골 수 유래 세포에 의해 Myelin 파편 식 균 작용

요약

선물이 phagocytic 용량의 기본 murine 골 수 유래 세포 붙일 레이블된 myelin 파편과 세포내 지질 작은 물방울 얼룩을 사용 하 여 평가 하는 방법.

초록

골 수 유래 세포 (BMDMs)는 수 입자의 다양 한 비운의 직업적인 식 세포로 서 중요 한 생리 적인 역할을 봉사 하는 성숙한 백혈구. 일반적으로, 중앙 신경 시스템 (CNS)에서 BMDMs 제한 됩니다 하지만 부상, 다음 그들은 쉽게 침투 수 있습니다. 일단 부상된 CNS 조직 내의 BMDMs 부상 파생 세포 부스러기, 지질 풍부한 myelin 파편의 다량을 포함 하 여의 허가 대 한 책임 1 차 셀 유형입니다. BMDM 침투 및 myelin 파편 식 균 작용 CNS 내의 neuropathological 파급 효과 복잡 하 고 잘 이해 있습니다. 여기서 설명 하는 프로토콜 연구에 대 한 직접적인 생체 외에서 BMDMs의 CNS 상해의 컨텍스트에서 허용. 우리는 murine BMDM 절연 및 문화, myelin 파편 준비 및 분석 실험 BMDM myelin 파편 식 균 작용을 평가 하기 위해 커버. 이 기술은 중요 한 전문된 장비 또는 자료에 대 한 필요 없이 강력한 같지는 결과 아직 연구자의 요구에 맞게 쉽게 사용자 지정할 수 있습니다.

서론

골 수 유래 세포 (BMDMs) 타고 난 및 적응형 면역 시스템 사이의 중요 한 링크입니다. 항 원 제시 세포 (Apc), 그들은 모두 항 원 프레 젠 테이 션을 통해 세포와 통신할 수 있습니다 고 cytokine 릴리스^1,2,3. 그러나, 직업적인 식 세포로 그들의 주요 기능은 병원 균, 나이 든된 세포 및 세포질 파편^1,4입니다. 척수 상해 (SCI), 다음 myelin 파편의 대량은 CNS 축 삭 myelination⁵에 대 한 책임 셀 형식은 죽어가는 oligodendrocytes에서 생성 됩니다. 우리와 다른 myelin 파편의 침투 BMDMs^5,,67의 주로 책임은 나타났습니다. 그러나, 척수 상해 내 사이트 engulfment myelin 파편의 프로-염증 성 상태⁵

프로토콜

방법 여기에 설명 된 플로리다 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 제 2에서 고 관리 및 실험 동물의 사용, 8^번째 버전에 대 한 가이드에에서 제시 된 지침을 따릅니다. . 모든 동물 들이이 프로토콜에 사용 되는 전용된 실험실 동물 시설에는 집 사용 까지입니다. 아니 vivo에서 실험 수행된 전에 희생 했다. 동물 숫자를 사용 하 여 평균 셀 및 myelin 컬렉션 가이드로 사용을 최소화 하기 위해 실험 필요에 근거 했다.

참고: 골 수 유래 세포 (BMDMs) (제 1), 붙일 레이블된 두뇌 파생 된 myelin 파편 (제 2), myelin 파편 식 균 작용 (제 3), 분석 하기 위한 일반적인 절차의 준비의 생성이이 프로토콜에 설명 합니다 및 myelin 파편 지질 축적 (제 4)의 분석에 대 한 일반적인 절차. 시 약 준비, 셀 수확 및 조작, myelin 컬렉션 및 라벨, 성과 분석 결과 층 류 공기 biosafety 캐비닛에 완료 되어야 한다.

1. 기본 골 수 유래 세포의 생성

1. 완전 한 대 식 세포 배양 (CMCM)의 준비

결과

CFSE myelin 파편 분류와 BMDMs의 치료 분명 국제화 (그림 2) 항복 한다. 3-시간 상호 작용 시간 강력한 다운스트림 검출을 위한 충분 한 추가 myelin 파편 phagocytose에 BMDMs에 대 한 충분 한 동안, 상호 작용의 1 시간 만큼 적게와 세포내 축적을 관찰할 수 있습니다. 그러나, 일부 myelin 파편 여전히 존재할 수 있습니다 세포 표면에 세척 후. 이 부족 한 세척 또는 입자 안 먹어서의 초기 단계 동안 내 면 완벽 하 게 되 고 있을 수 있습니다.

BMDMs 빠르게 myelin 파편을 internalize 수 있다, 하는 동안 lysosomal 처리 오로 stainable 지질 작은 물방울 형태로 하기 전에 필요 합니다. 설명 하기 위해, BMDMs myelin 파편으로 90 분 동안 incubated, 세척, 되었고 이전에 고정 하 고 (그림 3

토론

여기에 설명 된 절차 활용 갓 고립 된 원유 CNS myelin 파편과 기본 골 수 유래 세포. 동물 비용을 줄이기 위해,이 좋습니다 모두 두뇌 및 희생의 때에 각 마우스에서 골 수 세포 수확. 두 연구원 협력 동시에 두 재료를 준비할 수 있습니다. 또는, 두뇌 myelin 파편 격리 전에 항생제로 보충 하는 PBS에-80 ° C에 저장할 수 있습니다. 그것은 우리의 경험을 머리 최대 1 개월 myelin 파편 생성 잠재력의 손실 없이 감지할 수 이러한 조건에서 유지 될 수 있었습니다.

CFSE는 형광 강도 및 사용의 용이성 때문에 myelin 파편을 분류 하는 데 사용 됩니다. 휴대 전화 esterases 분자¹⁴에 아세테이트 그룹을 쪼개까지 염료 침묵과 남아 있습니다. 해제 된 succinimidyl 에스테 르 그룹 다음 세포질 단백질¹⁴공유 첨부 파일에 결과 기본 amides로 반응 수 있.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM	GE Healthcare Life Sciences	SH30243.01	L-글루타민, 피루브산 나트륨이 함유된 고포도당
페니실린-스트렙토마이신 용액	Corning	30-002-CI	100X 용액
New Born Calf Serum (NCS)	Rocky Mountain Biologics	NBS-BBT-5XM	United States Origin
NCTC clone 929 [L cell, L-929, strain L의 유도체]	ATCC	CCL-1	L929 컨디셔닝 배지 준비
24웰 세포 배양 플레이트	VWR	10062-896
세포 배양 접시	Greiner Bio-One	639960	폴리스티린, 145/20mm
CFSE 세포 증식 키트	Thermo Fisher	C34570	DMSO 화해를 위한
Fluoro-gel with Tris Buffer	전자 현미경 과학	17985-11
오일 레드 O	시그마 알드리치	O0625
Equipment
Materials	Company	카탈로그 번호	Comments
Ultracentrifuge Tubes	Beckman Coulter	326823	Thinwall, 폴리프로필렌, 38.5 mL, 25 x 89 mm
SW 32 Ti 초원심분리기 로터	Beckman Coulter	369650	SW 32 Ti 로터, 스윙 버킷, 티타늄
휴대용 로터리 균질화기	Fisher Science	08-451-71

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