생체 외에서 골 수 유래 세포에 의해 Myelin 파편 식 균 작용

골 수 유래 세포 (BMDMs) 타고 난 및 적응형 면역 시스템 사이의 중요 한 링크입니다. 항 원 제시 세포 (Apc), 그들은 모두 항 원 프레 젠 테이 션을 통해 세포와 통신할 수 있습니다 고 cytokine 릴리스^1,2,3. 그러나, 직업적인 식 세포로 그들의 주요 기능은 병원 균, 나이 든된 세포 및 세포질 파편^1,4입니다. 척수 상해 (SCI), 다음 myelin 파편의 대량은 CNS 축 삭 myelination⁵에 대 한 책임 셀 형식은 죽어가는 oligodendrocytes에서 생성 됩니다. 우리와 다른 myelin 파편의 침투 BMDMs^5,,67의 주로 책임은 나타났습니다. 그러나, 척수 상해 내 사이트 engulfment myelin 파편의 프로-염증 성 상태^5,,89로이 일반적으로 염증 세포 변화 제안 되었습니다. 부상된 척수에서 신경 염증의 주요 중재자, BMDMs로 중요 한 임상 대상입니다.

척수 부상된에서 BMDMs의 영향을 조사 하기 위해, 우리는 생체 외에서 모델을 직접 BMDMs myelin 파편에 대처 하는 방법을 연구를 개발 했습니다. 생물 학적 관련성을 높이기 위해 기본 murine BMDMs와 갓 고립 된 myelin 파편이이 조사에 사용 됩니다. 따라서, 여기에 제시 하는 방법 또한 자세히 분리와 기본 murine BMDMs의 문화 그리고 murine CNS를 격리 하는 데 사용 하는 수정 된 자당 그라데이션 기법 파생 myelin 파편^10,,1112. Myelin 파편 형광 염료, 트랙 BMDMs CFSE에 의해 그것의 국제화는이 응용 프로그램에 적합 잘-세포 독성 때문에 및 그것의 좁은 형광 스펙트럼 허가 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE), 쉽게 표시 될 수 있습니다. ^13,14프로브 다른 형광과 멀티플렉싱 합니다. 먹어서, 다음 myelin 파편 지질은 리소좀을 통해 수송 하 고 세포내 지질 방울⁵에 중립 지질으로 패키지. 이 세포내 지질 축적을 계량 하는 기름 빨간 O (오로) 양적 이미지 분석을 위해 최적화 하는 방법 얼룩 선물이. 이 간단한 얼룩 방법은 강력한 재현할 결과 및 정량화¹⁵를 생성합니다. 이러한 메서드는 제한 된 특수 장비로 myelin 파편 식 균 작용 및 지질 보존의 연구를 촉진 한다.

방법 여기에 설명 된 플로리다 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 제 2에서 고 관리 및 실험 동물의 사용, 8^번째 버전에 대 한 가이드에에서 제시 된 지침을 따릅니다. . 모든 동물 들이이 프로토콜에 사용 되는 전용된 실험실 동물 시설에는 집 사용 까지입니다. 아니 vivo에서 실험 수행된 전에 희생 했다. 동물 숫자를 사용 하 여 평균 셀 및 myelin 컬렉션 가이드로 사용을 최소화 하기 위해 실험 필요에 근거 했다.

참고: 골 수 유래 세포 (BMDMs) (제 1), 붙일 레이블된 두뇌 파생 된 myelin 파편 (제 2), myelin 파편 식 균 작용 (제 3), 분석 하기 위한 일반적인 절차의 준비의 생성이이 프로토콜에 설명 합니다 및 myelin 파편 지질 축적 (제 4)의 분석에 대 한 일반적인 절차. 시 약 준비, 셀 수확 및 조작, myelin 컬렉션 및 라벨, 성과 분석 결과 층 류 공기 biosafety 캐비닛에 완료 되어야 한다.

1. 기본 골 수 유래 세포의 생성

1. 완전 한 대 식 세포 배양 (CMCM)의 준비
   참고: 골에서 대 식 세포 생성 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (M-CSF) 사용 해야 합니다. 이 준비 M-CSF의 소스로 L929 murine 구와 조건 미디어를 활용합니다.
   1. 145 m m 요리 50 mL의 높은 포도 당 (4500 mg/L L-포도 당) Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 7 일 동안 5% 새로운 태어난된 송아지 혈 청 (NCS)와 페니실린/스 보충으로 자란 세포에 의해 L929 murine 구와 단련 미디어를 생성 합니다.
   2. 3500 x g, 4 ° c.에 30 분 동안 50 mL 원뿔 원심 분리기 및 원심 분리기로 문화에서 미디어를 수집
   3. 새로운 50 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 supernatants 0.2 µ m 주사기 필터를 통해 필터링. 바른된 미디어-80 ° C에서 최대 6 개월까지 저장할 수 있습니다.
   4. 높은 포도 당 DMEM, 추가 5 %vol / vol NCS, 15 %vol / vol L929 murine 구와 조절 된 DMEM, 및 1% 페니실린/스. 2-3 개월 동안 4 ° C에서 미디어를 저장할 수 있습니다. 사용 하기 전에 37 ° C에 따뜻한.
2. 기본 골 수 세포와 대 식 세포 유도의 컬렉션
   참고: 이 프로토콜 한 마우스를 사용 하 여 약 20 백만 골 수 유래 세포 (BMDMs)을 생성 합니다.
   1. 8 10 주 오래 된 마우스 표준 공동₂ 질 지침을 사용 하 여 다음 자 궁 경부 전위의 원하는 수 안락사
   2. 70% (vol/vol) 에탄올: h 조₂O를 사용 하 여, 포화 모피 동물을 청소.
   3. 복 부에 작은 오프닝 고 신중 하 게 다시 기본 조직을 공개 피부를 당겨. 복 막 구멍을 찌를 하지 주의 하십시오.
   4. 엉덩이에서 시작 하 고 발목에서 끝나는 두 뒷 다리를 제거 합니다. 장소 5-10 mL의 멸 균 인산 염을 포함 하는 100 mm 페 트리 접시에 수집 된 조직 버퍼링 식 염 수 (PBS) 보충 1% 페니실린/스.
      참고: 때 처리 하는 여러 동물 조직 저하를 제한 하는 얼음 요리 계속 있는지 확인 합니다.
   5. 메스를 사용 하 여 뼈에서 근육과 결합 조직을 제거 합니다. 대 퇴 골과 경골을 사용 하는 셀의 컬렉션에 대 한 비 골 삭제 될 수 있습니다.
   6. 메스와 각 끝에서 작은 부분을 트리밍에 의해 수집 된 뼈의 골 수 구멍을 노출 합니다.
   7. 25g 바늘을 사용 하 여, 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 CMCM와 골 수 구멍 플러시. 일단 그들은 충분히 플러시될 뼈 흰색 표시 됩니다.
   8. 컬렉션 완료 되 면 생성 된 단일 세포 현 탁 액을 30-90 s 18 g 바늘 aspirates 교 반 하십시오.
      참고: 선택적 적혈구 (RBC) 세포 단계는이 시점에서 수행할 수 있습니다. 그것은 최근에 세포내 철 macrophage 양극 화¹⁶시 myelin 파편의 효과 영향 수 있습니다 제안 되었습니다. RBC 세포 단계의 포함에 대 한 내용은 Trouplin 외를 참조 하십시오. ¹⁷.
   9. 새로운 50 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 70 µ m 살 균 셀 스 트레이너를 통해 정지를 필터링 합니다.
   10. 씨앗 145 mm 셀 문화 요리 15-20 mL CMCM에 균등 하 게 세포를 수집. 마우스 희생 당 약 3 개의 문화 요리를 사용 합니다. 37 ° C, 5% CO₂에서 문화를 품 어.
   11. 72 시간 한번 비 부착 한 세포를 제거 하 살 균 PBS 가진 접시 세척, 후 추가 15-20 mL 신선한 CMCM. 37 ° C, 5% CO₂에서 추가 4 일 문화를 품 어. 7 일 후 총 문화, 처음 고립 된 조 혈 골 수 세포 성숙 BMDMs (그림 1) 될 것입니다.

2. 붙일 레이블된 두뇌 파생 된 Myelin 파편의 생성

참고: 모든 시 약 4 ° C에서 1 개월까지 저장할 수 있습니다.

1. Myelin 파편 수집 시 약의 준비
   1. Tris· 준비 Cl 버퍼 솔루션입니다.
      1. 800 mL 증류수 이온된 H₂O (ddiH₂O) 추가 20 mL의 1 M Tris· Cl, 100 m m 나₂EDTA (2mm 최종 농도)의 pH는 7.45 (최종 농도 20 mM) 및 20 mL
      2. PH 7.45 조정 합니다. DdiH₂0.2 µ m 여과 장치를 통해 오 필터 솔루션 1000ml를 볼륨을 조정 합니다.
   2. 1 M 자당 솔루션을 준비 합니다.
      1. Tris·의 100 ml Cl 버퍼 솔루션, 자당의 68.46 g 추가. Tris·와 200 mL에 양을 맞추십시오 Cl 버퍼 솔루션입니다. 0.2 µ m 여과 장치를 통해 솔루션을 필터링 합니다.
   3. Tris·와 1 M 솔루션을 diluting 하 여 0.32 M 자당 솔루션 200ml를 준비 Cl 버퍼 솔루션 0.83:0.16 (vol/vol).
   4. Tris·와 1 M 솔루션을 diluting 하 여 0.83 M 자당 솔루션의 150 mL를 준비 Cl 버퍼 솔루션 0.83:0.16 (vol/vol).
2. 두뇌 파생 하는 원유 myelin 파편의 컬렉션
   참고: 여기에 설명 된 수집 방법 원유 myelin 파편의 격리입니다.
   1. 뒤에 자 궁 경부 전위 표준 공동₂ 질 지침을 사용 하 여 나이의 8-10 주 10-12 마우스를 안락사.
   2. 두뇌를 해 부 고 0.32 M 자당 솔루션의 10 mL를 포함 하는 100 mm 접시에 그들을 배치.

3. myelin 파편 식 균 작용 분석 결과

참고: 다음 붙일 레이블된 myelin 파편 식 균 작용을 관찰 하는 기본 방법입니다. 다른 트리 트 먼 트 및 실험 조건 추가 조사에 의해 최적화 될 필요 합니다.

1. 치료 접시의 준비
   1. 각 145 m m 플레이트 수집 성숙 BMDMs 10 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 5-6 mL를 사용 하 여 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (dPBS) (pH 7.4)에.
      참고: 로 셀¹⁸의 활성화 상태를 변경할 수 있습니다에 트립 신을 사용 하지 마십시오.
   2. 수집 된 세포의 각 튜브를 미리 데워 진된 CMCM의 동일한 볼륨을 추가 합니다.
   3. 20 ° c.에 8 분 180 x g에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.
   4. 다시 CMCM 셀 수를 일시 중단 합니다.
   5. 24 잘 셀 문화 판의 각 우물에 CMCM의 1 mL에 1 x 10⁵ 셀을 추가 합니다.
   6. 37 ° C, 5% CO₂ 24 h에서 품 어.
2. Myelin 파편 처리 및 분석
   1. 100 mg/mL CFSE의 10 µ L 표시 각 잘 (1 mg/mL 최종 농도)를 myelin 파편을 추가 합니다.
   2. 37 ° C, 5% CO₂에서 1-3 시간 동안 품 어.
   3. 3 회 비를 가득 채우고 myelin 파편 제거 하 살 균 PBS 가진 접시를 씻어.
   4. 각 우물에 4 %paraformaldehyde 400 µ L를 추가 합니다. 실시간에서 30 분 동안 품 어
   5. 2 번 살 균 PBS로 세척 접시입니다.
   6. 각 우물에 Hoechst 33258 솔루션의 400 µ L를 추가 합니다. 빛에서 보호 하는 RT에 5 분 동안 품 어.
   7. 2 번 살 균 PBS로 세척 접시입니다.
   8. Photobleaching를 줄이기 위해 각 잘에 Tris 버퍼와의 불 화-젤 200 µ L를 추가 합니다.
   9. 거꾸로 피 형광 수 있는 현미경을 사용 하 여 이미지 셀.
      참고: CFSE의 여기 및 방출 파장은 494 nm 및 521 nm, 각각.
   10. CFSE 긍정적인 셀 수 상대 myelin 파편 통풍 관을 결정 하는 핵의 수로 나눕니다.
   11. 이미징, 이전 빛에서 보호 하는 4 ° C에서 최대 7 일 동안 접시를 유지 합니다.

4. 기름 빨간 O 얼룩 통해 세포내 지질의 정량화

참고: 다음 세포내 myelin 파편 파생 지질을 관찰 하는 기본 방법입니다.CFSE myelin 파편을 표시를 사용 하 여 오로의 형광 정량화에 대 한 권장 하지 않습니다 스펙트럼 오버랩 때문에 얼룩. 다른 트리 트 먼 트 및 실험 조건 추가 조사에 의해 최적화 될 필요 합니다.

1. 얼룩이 솔루션의 준비
   1. 0.5% 기름 빨간 O (오로) 얼룩 솔루션을 준비 합니다.
      1. 천천히 오 (교 반 하면서 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol)로 0.5 g을 100 mL 100% 프로필 렌 글리콜 (1, 2-Propanediol)의 추가.
      2. 또는 모든 큰 입자는 해산 될 때까지 15 분 동안 95 ° C에 솔루션을 열.
         참고: 이상의 100 ° c.가 열 하지 마십시오
      3. 새 컨테이너로 아직 따뜻한 반면 필터 종이 통해 해결책을 필터링 합니다.
      4. 실시간 솔루션에서 멋진 하룻밤 솔루션 실시간에서 1 년까지 저장 될 수 있도록
   2. 85% 프로필 렌 글리콜 솔루션을 준비 합니다.
      1. DdiH₂오 볶음까지 혼합의 15 mL를 100% 프로필 렌 글리콜의 85 mL를 추가 합니다. 솔루션은 실시간에서 1 년까지 저장 될 수 있다
2. 치료 접시의 준비
   1. 섹션 3에서 설명 하는 방법을 24-잘 접시를 준비 합니다.
   2. 37 ° C, 5% CO₂ 24 h에서 품 어.
3. Myelin 파편 치료
   1. 각 잘 (1 mg/mL 최종 농도)를 100 mg/mL myelin 파편의 10 µ L를 추가 합니다.
   2. 1-3 h 37 ° C, 5% CO₂에서 품 어.
   3. 3 번 비 소화 myelin 파편 제거 살 균 PBS 가진 접시를 씻어.
      참고:이 시점에서 접시도 즉시 고정 받을 수 있습니다 또는 신선한 CMCM 추가 될 수 있다, 고 셀 반환 추가 시간 포인트에 대 한 보육.
   4. 각 우물에 4 %paraformaldehyde 400 µ L를 추가 합니다. 실시간에서 30 분 동안 품 어
   5. 세척 접시 2 번 살 균 PBS 다음 얼룩을 진행할.
4. 오로 얼룩이 지 고 분석
   1. 워시 ddiH₂오 3 번 플레이트를 고정
   2. 각 잘을 100% 프로필 렌 글리콜의 400 µ L을 추가 하 고 실시간에 5 분 동안 품 어
      참고:이 ddiH₂o.의 carryover 줄어
   3. 프로필 렌 글리콜을 발음 하 고 각 잘 하 오로 솔루션의 400 µ L를 추가 합니다.
   4. 60 ° c.에 8 분 동안 품 어
   5. 오로 솔루션 발음 다음, 각 잘을 85% 프로필 렌 글리콜의 400 µ L을 추가 하 고 실시간에 5 minumintes에 대 한 품 어
   6. 세척 접시 3 번 ddiH₂o.
   7. 각 우물에 Hoechst 33258 솔루션의 400 µ L를 추가 합니다. RT, 빛에서 보호에서 5 분 동안 품 어.
   8. 2 번 살 균 PBS로 세척 접시입니다.
   9. 각 우물에 Tris 버퍼와의 불 화-젤 200 µ L를 추가 합니다.
   10. 거꾸로 피 형광 수 있는 현미경을 사용 하 여 이미지 셀. 오로 표준 텍사스 레드 또는 DsRed 필터 세트를 사용 하 여 몇 군데 있습니다.
   11. 각 이미지 필드에 오로 긍정적인 영역을 결정 하 고 핵의 수로 분할 하 여 상대 지질 보존을 계량.
   12. 4 ° C에서 7 일에 대 한 번호판 빛 으로부터 보호 유지.

CFSE myelin 파편 분류와 BMDMs의 치료 분명 국제화 (그림 2) 항복 한다. 3-시간 상호 작용 시간 강력한 다운스트림 검출을 위한 충분 한 추가 myelin 파편 phagocytose에 BMDMs에 대 한 충분 한 동안, 상호 작용의 1 시간 만큼 적게와 세포내 축적을 관찰할 수 있습니다. 그러나, 일부 myelin 파편 여전히 존재할 수 있습니다 세포 표면에 세척 후. 이 부족 한 세척 또는 입자 안 먹어서의 초기 단계 동안 내 면 완벽 하 게 되 고 있을 수 있습니다.

BMDMs 빠르게 myelin 파편을 internalize 수 있다, 하는 동안 lysosomal 처리 오로 stainable 지질 작은 물방울 형태로 하기 전에 필요 합니다. 설명 하기 위해, BMDMs myelin 파편으로 90 분 동안 incubated, 세척, 되었고 이전에 고정 하 고 (그림 3) 얼룩 시간의 추가 금액에 대 한 교양. 그림 4 는 치료 시작 및 중립 지질 외관 사이 지연이 있다. 그것은 지질 보존은 문화 중 안정 하지 주목 해야한다. BMDMs는 물방울 형성 후 곧 축적 된 지질 대사를 시작 합니다. 이와 같이, 세척 떨어져 비를 가득 채우고 myelin 파편과 고정 사이 24 시간 보다 더 긴 대기를 좋습니다.

오로 스테인드 영역의 정량화 myelin 지질 대사 BMDMs (그림 5)에서 속도 보여 줍니다. 90 분 상호 작용 기간에 따라 세포는 신선한 CMCM에 외피에 반환 했다. 신선한 매체에 이른 추적 기간 동안에 BMDMs phagocytosed myelin 파편 지질 구성 요소 중립 오로 stainable 지질에 대사. 오로 긍정적인 지역에 있는 꾸준한 증가 시간 상호 작용에서에서 일반적입니다. 그러나 24 시간 후,에 BMDMs 것 이다 effluxed 또는 세포내 지질의 상당 부분을 물질 대사로 변화.

그림 1 : 대표 BMDM 문화. 몇 가지 부착 세포 처음 관찰 될 것 이다. 3 일에 모든 비 부착 한 세포 제거 됩니다. 하루 7, 성숙한 골 수 유래 세포 관찰 된다. 규모 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : BMDM Myelin 파편 식 균 작용의 대표 이미지 분석. 셀 1 mg/mL CFSE myelin 파편 1 시간 전에 세척 및 4% 고정에 대 한 분류로 치료 했다 PFA. 내 면된 myelin 파편 피 형광 수 현미경에 표준 GFP 필터 세트를 사용 하 여 구상 될 수 있다. 규모 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : 기름 빨간 O (오로) 실험 디자인의 다이어그램. BMDM 세척 및 문화 정착 이전 신선한 매체에 90 분, 1 mg/mL myelin 파편 (1: 100 희석)으로 처리 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 : 오로 Myelin 파편 식 균 작용에 따라 BMDM의 얼룩. 4 %PFA 표시 시간 포인트, BMDMs에 오로와 Hoechst 33258 스테인드 했다 다음 고정. 각 시간 지점에 대 한 대표적인 이미지 표시 됩니다. 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5 : 오로 얼룩의 양적 이미지 분석. 오로 얼룩의 정량화에 대 한 3 웰 스 잘 당 5 이미지 20 X에 몇 군데 있었다. 모든 이미지 수집 설정을 동일 했다. 오차 막대 SEM. = (n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

저자 아무 공개 있다.