이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

생체 외에서 골 수 유래 세포에 의해 Myelin 파편 식 균 작용

13.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56322

⸱

2017년 12월 30일

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

이 논문에서

요약

선물이 phagocytic 용량의 기본 murine 골 수 유래 세포 붙일 레이블된 myelin 파편과 세포내 지질 작은 물방울 얼룩을 사용 하 여 평가 하는 방법.

초록

골 수 유래 세포 (BMDMs)는 수 입자의 다양 한 비운의 직업적인 식 세포로 서 중요 한 생리 적인 역할을 봉사 하는 성숙한 백혈구. 일반적으로, 중앙 신경 시스템 (CNS)에서 BMDMs 제한 됩니다 하지만 부상, 다음 그들은 쉽게 침투 수 있습니다. 일단 부상된 CNS 조직 내의 BMDMs 부상 파생 세포 부스러기, 지질 풍부한 myelin 파편의 다량을 포함 하 여의 허가 대 한 책임 1 차 셀 유형입니다. BMDM 침투 및 myelin 파편 식 균 작용 CNS 내의 neuropathological 파급 효과 복잡 하 고 잘 이해 있습니다. 여기서 설명 하는 프로토콜 연구에 대 한 직접적인 생체 외에서 BMDMs의 CNS 상해의 컨텍스트에서 허용. 우리는 murine BMDM 절연 및 문화, myelin 파편 준비 및 분석 실험 BMDM myelin 파편 식 균 작용을 평가 하기 위해 커버. 이 기술은 중요 한 전문된 장비 또는 자료에 대 한 필요 없이 강력한 같지는 결과 아직 연구자의 요구에 맞게 쉽게 사용자 지정할 수 있습니다.

서론

골 수 유래 세포 (BMDMs) 타고 난 및 적응형 면역 시스템 사이의 중요 한 링크입니다. 항 원 제시 세포 (Apc), 그들은 모두 항 원 프레 젠 테이 션을 통해 세포와 통신할 수 있습니다 고 cytokine 릴리스1,2,3. 그러나, 직업적인 식 세포로 그들의 주요 기능은 병원 균, 나이 든된 세포 및 세포질 파편1,4입니다. 척수 상해 (SCI), 다음 myelin 파편의 대량은 CNS 축 삭 myelination5에 대 한 책임 셀 형식은 죽어가는 oligodendrocytes에서 생성 됩니다. 우리와 다른 myelin 파편의 침투 BMDMs5,,67의 주로 책임은 나타났습니다. 그러나, 척수 상해 내 사이트 engulfment myelin 파편의 프로-염증 성 상태5,,89로이 일반적으로 염증 세포 변화 제안 되었습니다. 부상된 척수에서 신경 염증의 주요 중재자, BMDMs로 중요 한 임상 대상입니다.

척수 부상된에서 BMDMs의 영향을 조사 하기 위해, 우리는 생체 외에서 모델을 직접 BMDMs myelin 파편에 대처 하는 방법을 연구를 개발 했습니다. 생물 학적 관련성을 높이기 위해 기본 murine BMDMs와 갓 고립 된 myelin 파편이이 조사에 사용 됩니다. 따라서, 여기에 제시 하는 방법 또한 자세히 분리와 기본 murine BMDMs의 문화 그리고 murine CNS를 격리 하는 데 사용 하는 수정 된 자당 그라데이션 기법 파생 myelin 파편10,,1112. Myelin 파편 형광 염료, 트랙 BMDMs CFSE에 의해 그것의 국제화는이 응용 프로그램에 적합 잘-세포 독성 때문에 및 그것의 좁은 형광 스펙트럼 허가 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE), 쉽게 표시 될 수 있습니다. 13,14프로브 다른 형광과 멀티플렉싱 합니다. 먹어서, 다음 myelin 파편 지질은 리소좀을 통해 수송 하 고 세포내 지질 방울5에 중립 지질으로 패키지. 이 세포내 지질 축적을 계량 하는 기름 빨간 O (오로) 양적 이미지 분석을 위해 최적화 하는 방법 얼룩 선물이. 이 간단한 얼룩 방법은 강력한 재현할 결과 및 정량화15를 생성합니다. 이러한 메서드는 제한 된 특수 장비로 myelin 파편 식 균 작용 및 지질 보존의 연구를 촉진 한다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

방법 여기에 설명 된 플로리다 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 제 2에서 고 관리 및 실험 동물의 사용, 8번째 버전에 대 한 가이드에에서 제시 된 지침을 따릅니다. . 모든 동물 들이이 프로토콜에 사용 되는 전용된 실험실 동물 시설에는 집 사용 까지입니다. 아니 vivo에서 실험 수행된 전에 희생 했다. 동물 숫자를 사용 하 여 평균 셀 및 myelin 컬렉션 가이드로 사용을 최소화 하기 위해 실험 필요에 근거 했다.

참고: 골 수 유래 세포 (BMDMs) (제 1), 붙일 레이블된 두뇌 파생 된 myelin 파편 (제 2), myelin 파편 식 균 작용 (제 3), 분석 하기 위한 일반적인 절차의 준비의 생성이이 프로토콜에 설명 합니다 및 myelin 파편 지질 축적 (제 4)의 분석에 대 한 일반적인 절차. 시 약 준비, 셀 수확 및 조작, myelin 컬렉션 및 라벨, 성과 분석 결과 층 류 공기 biosafety 캐비닛에 완료 되어야 한다.

1. 기본 골 수 유래 세포의 생성

  1. 완전 한 대 식 세포 배양 (CMCM)의 준비
    참고:     골에서 대 식 세포 생성 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (M-CSF) 사용 해야 합니다. 이 준비 M-CSF의 소스로 L929 murine 구와 조건 미디어를 활용합니다.
    1. 145 m m 요리 50 mL의 높은 포도 당 (4500 mg/L L-포도 당) Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 7 일 동안 5% 새로운 태어난된 송아지 혈 청 (NCS)와 페니실린/스 보충으로 자란 세포에 의해 L929 murine 구와 단련 미디어를 생성 합니다.
    2. 3500 x g, 4 ° c.에 30 분 동안 50 mL 원뿔 원심 분리기 및 원심 분리기로 문화에서 미디어를 수집
    3. 새로운 50 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 supernatants 0.2 µ m 주사기 필터를 통해 필터링. 바른된 미디어-80 ° C에서 최대 6 개월까지 저장할 수 있습니다.
    4. 높은 포도 당 DMEM, 추가 5 %vol / vol NCS, 15 %vol / vol L929 murine 구와 조절 된 DMEM, 및 1% 페니실린/스. 2-3 개월 동안 4 ° C에서 미디어를 저장할 수 있습니다. 사용 하기 전에 37 ° C에 따뜻한.
  2. 기본 골 수 세포와 대 식 세포 유도의 컬렉션
    참고: 이 프로토콜 한 마우스를 사용 하 여 약 20 백만 골 수 유래 세포 (BMDMs)을 생성 합니다.
    1. 8 10 주 오래 된 마우스 표준 공동2 질 지침을 사용 하 여 다음 자 궁 경부 전위의 원하는 수 안락사
    2. 70% (vol/vol) 에탄올: h 조2O를 사용 하 여, 포화 모피 동물을 청소.
    3. 복 부에 작은 오프닝 고 신중 하 게 다시 기본 조직을 공개 피부를 당겨. 복 막 구멍을 찌를 하지 주의 하십시오.
    4. 엉덩이에서 시작 하 고 발목에서 끝나는 두 뒷 다리를 제거 합니다. 장소 5-10 mL의 멸 균 인산 염을 포함 하는 100 mm 페 트리 접시에 수집 된 조직 버퍼링 식 염 수 (PBS) 보충 1% 페니실린/스.
      참고: 때 처리 하는 여러 동물 조직 저하를 제한 하는 얼음 요리 계속 있는지 확인 합니다.
    5. 메스를 사용 하 여 뼈에서 근육과 결합 조직을 제거 합니다. 대 퇴 골과 경골을 사용 하는 셀의 컬렉션에 대 한 비 골 삭제 될 수 있습니다.
    6. 메스와 각 끝에서 작은 부분을 트리밍에 의해 수집 된 뼈의 골 수 구멍을 노출 합니다.
    7. 25g 바늘을 사용 하 여, 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 CMCM와 골 수 구멍 플러시. 일단 그들은 충분히 플러시될 뼈 흰색 표시 됩니다.
    8. 컬렉션 완료 되 면 생성 된 단일 세포 현 탁 액을 30-90 s 18 g 바늘 aspirates 교 반 하십시오.
      참고: 선택적 적혈구 (RBC) 세포 단계는이 시점에서 수행할 수 있습니다. 그것은 최근에 세포내 철 macrophage 양극 화16시 myelin 파편의 효과 영향 수 있습니다 제안 되었습니다. RBC 세포 단계의 포함에 대 한 내용은 Trouplin 외를 참조 하십시오. 17.
    9. 새로운 50 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 70 µ m 살 균 셀 스 트레이너를 통해 정지를 필터링 합니다.
    10. 씨앗 145 mm 셀 문화 요리 15-20 mL CMCM에 균등 하 게 세포를 수집. 마우스 희생 당 약 3 개의 문화 요리를 사용 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 문화를 품 어.
    11. 72 시간 한번 비 부착 한 세포를 제거 하 살 균 PBS 가진 접시 세척, 후 추가 15-20 mL 신선한 CMCM. 37 ° C, 5% CO2에서 추가 4 일 문화를 품 어. 7 일 후 총 문화, 처음 고립 된 조 혈 골 수 세포 성숙 BMDMs (그림 1) 될 것입니다.

2. 붙일 레이블된 두뇌 파생 된 Myelin 파편의 생성

참고: 모든 시 약 4 ° C에서 1 개월까지 저장할 수 있습니다.

  1. Myelin 파편 수집 시 약의 준비
    1. Tris· 준비 Cl 버퍼 솔루션입니다.
      1. 800 mL 증류수 이온된 H2O (ddiH2O) 추가 20 mL의 1 M Tris· Cl, 100 m m 나2EDTA (2mm 최종 농도)의 pH는 7.45 (최종 농도 20 mM) 및 20 mL
      2. PH 7.45 조정 합니다. DdiH20.2 µ m 여과 장치를 통해 오 필터 솔루션 1000ml를 볼륨을 조정 합니다.
    2. 1 M 자당 솔루션을 준비 합니다.
      1. Tris·의 100 ml Cl 버퍼 솔루션, 자당의 68.46 g 추가. Tris·와 200 mL에 양을 맞추십시오 Cl 버퍼 솔루션입니다. 0.2 µ m 여과 장치를 통해 솔루션을 필터링 합니다.
    3. Tris·와 1 M 솔루션을 diluting 하 여 0.32 M 자당 솔루션 200ml를 준비 Cl 버퍼 솔루션 0.83:0.16 (vol/vol).
    4. Tris·와 1 M 솔루션을 diluting 하 여 0.83 M 자당 솔루션의 150 mL를 준비 Cl 버퍼 솔루션 0.83:0.16 (vol/vol).
  2. 두뇌 파생 하는 원유 myelin 파편의 컬렉션
    참고: 여기에 설명 된 수집 방법 원유 myelin 파편의 격리입니다.
    1. 뒤에 자 궁 경부 전위 표준 공동2 질 지침을 사용 하 여 나이의 8-10 주 10-12 마우스를 안락사.
    2. 두뇌를 해 부 고 0.32 M 자당 솔루션의 10 mL를 포함 하는 100 mm 접시에 그들을 배치.
얼음에 접시를 유지.
  • 로 머리를 잘라 불 임 수술가 위를 사용 하 여 약 5 m m3 크기에 조각.
  • 조직 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 전송 하 고 0.32 M 자당 솔루션의 약 30 mL를 추가 합니다.
  • 부드러운 솔루션 달성 될 때까지 무 균 휴대용 로타리 균질 화기와 균질.
  • 0.32 M 자당 솔루션 90 mL의 최종 볼륨을 무 균된 두뇌를 희석.
  • 6 38.5 mL 얇은 벽 폴 리 프로필 렌 ultracentrifuge 튜브, 0.83 M 자당 솔루션의 20 mL를 추가 합니다.
  • 부드럽게 두 레이어를 혼합 하지 않도록 주의 복용 0.83 M 자당 솔루션의 상단에 무 균된 뇌 솔루션을 추가 합니다.
  • 0.32 M 자당 솔루션 각 튜브의 균형.
  • 적절 한 사용 하 여 4 ° C에서 45 분 100000 x g에서 원심 분리기는 미리 ultracentrifuge로 터를 냉각. 로 터 가속 및 감속 myelin 파편 손실을 줄이기 위해 최소 값으로 설정 합니다.
  • 두 자당 밀도의 인터페이스에서 myelin 파편을 수집 합니다.
    참고: 파편 튜브의 중심을 향해 백색 악대로 나타납니다.
  • 50 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 원유 myelin 파편을 결합 하 고 대략 35 ml Tris·를 사용 하 여 볼륨 조정 Cl 버퍼 솔루션입니다.
  • 30-60 s에 대 한 살 균 휴대용 로타리 균질 화기와 원유 myelin 파편을 균질.
  • 6 깨끗 한 ultracentrifuge 튜브와 Tris·의 적절 한 양으로 균형 사이 정지를 균등 하 게 분하시오 Cl 버퍼 솔루션입니다.
  • 적절 한 사용 하 여 4 ° C에서 45 분 100000 x g에서 원심 분리기는 미리 ultracentrifuge로 터를 냉각. 그들의 최대 값으로 회전자 가속 및 감속을 설정.
  • 단단한 흰색 알 약 표시 됩니다 이제,는 상쾌한 삭제 하 고 다시 Tris·의 10-15 mL에 알 약을 중단 Cl 버퍼 솔루션입니다.
  • 2 깨끗 한 ultracentrifuge 튜브와 Tris·의 적절 한 양으로 균형 사이 정지를 균등 하 게 분하시오 Cl 버퍼 솔루션입니다.
  • 원심 분리기 다시는 적절 한 사용 하 여 4 ° C에서 45 분 100000 x g에서 미리 냉각 ultracentrifuge로 터. 그들의 최대 값으로 회전자 가속 및 감속을 설정.
  • 삭제는 상쾌한 하 고 살 균 PBS의 5-6 mL에 산 탄을 resuspend 미리 무게 1.5 mL 마이크로 원심 튜브의 적절 한 수 사이 정지를 나눕니다.
  • 4 ° c.에서 10 분 동안 22000 x g에서 원심 분리기
  • 삭제는 상쾌한 고 myelin 파편 알갱이의 무게를 결정 합니다.
  • 다시 일시 중단 알 약 PBS에서 100 mg/mL의 최종 농도에.
    참고: 10 ~ 12 두뇌 100 mg/mL myelin 파편의 10-15 mL을 생산 하기 위해 충분 하다. Myelin 파편 6 개월-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
  • Myelin 파편 형광 라벨
    1. 즉시 사용 하기 전에 50 µ M carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 솔루션을 준비 합니다.
      1. 살 균 PBS를 사용 하 여, CFSE 50 µ M의 최종 작업 농도를 100% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)와 준비의 5 m m 재고 솔루션을 희석.
      2. 0.2 µ m 주사기 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.
    2. 100 mg/mL myelin 파편의 원하는 금액을 해 동 하 고 다시 무 균 29 g 바늘으로 일시 중단.
      참고: 그것은 사용 하기 전에 물의 resuspension 필요한 솔루션 중 퇴 하면 myelin 파편을 동결.
    3. 미리 무게 1.5 mL 마이크로 원심 튜브를 myelin 파편을 전송 합니다.
    4. 4 ° c.에서 10 분 동안 14800 x g에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.
    5. 100 µ L myelin 파편 일지도 당 CFSE 솔루션의 200 µ L에 myelin 파편을 resuspend.
    6. 실 온 (RT) 빛에서 보호에서 30 분 동안 품 어.
    7. 4 ° c.에서 10 분 동안 14800 x g에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.
    8. 워시 버퍼의 600-800 µ L에 펠 릿을 resuspend (0.2 µ m 필터 소독 PBS에 100mm 글리신).
    9. 4 ° c.에서 10 분 동안 14800 x g에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.
    10. 단계 2.3.8-2.3.9 두 번 더 반복 합니다.
    11. 최종 세척 후 myelin 파편 펠 릿의 무게를 확인 하 고 다시 살 균 PBS 가진 100 mg/mL를 일시 중단 합니다.
      참고: 레이블이 myelin 파편 최대 6 개월까지-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다.

    • 3. myelin 파편 식 균 작용 분석 결과

    참고: 다음 붙일 레이블된 myelin 파편 식 균 작용을 관찰 하는 기본 방법입니다. 다른 트리 트 먼 트 및 실험 조건 추가 조사에 의해 최적화 될 필요 합니다.

    1. 치료 접시의 준비
      1. 각 145 m m 플레이트 수집 성숙 BMDMs 10 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 5-6 mL를 사용 하 여 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (dPBS) (pH 7.4)에.
        참고: 로 셀18의 활성화 상태를 변경할 수 있습니다에 트립 신을 사용 하지 마십시오.
      2. 수집 된 세포의 각 튜브를 미리 데워 진된 CMCM의 동일한 볼륨을 추가 합니다.
      3. 20 ° c.에 8 분 180 x g에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.
      4. 다시 CMCM 셀 수를 일시 중단 합니다.
      5. 24 잘 셀 문화 판의 각 우물에 CMCM의 1 mL에 1 x 105 셀을 추가 합니다.
      6. 37 ° C, 5% CO2 24 h에서 품 어.
    2. Myelin 파편 처리 및 분석
      1. 100 mg/mL CFSE의 10 µ L 표시 각 잘 (1 mg/mL 최종 농도)를 myelin 파편을 추가 합니다.
      2. 37 ° C, 5% CO2에서 1-3 시간 동안 품 어.
      3. 3 회 비를 가득 채우고 myelin 파편 제거 하 살 균 PBS 가진 접시를 씻어.
      4. 각 우물에 4 %paraformaldehyde 400 µ L를 추가 합니다. 실시간에서 30 분 동안 품 어
      5. 2 번 살 균 PBS로 세척 접시입니다.
      6. 각 우물에 Hoechst 33258 솔루션의 400 µ L를 추가 합니다. 빛에서 보호 하는 RT에 5 분 동안 품 어.
      7. 2 번 살 균 PBS로 세척 접시입니다.
      8. Photobleaching를 줄이기 위해 각 잘에 Tris 버퍼와의 불 화-젤 200 µ L를 추가 합니다.
      9. 거꾸로 피 형광 수 있는 현미경을 사용 하 여 이미지 셀.
        참고: CFSE의 여기 및 방출 파장은 494 nm 및 521 nm, 각각.
      10. CFSE 긍정적인 셀 수 상대 myelin 파편 통풍 관을 결정 하는 핵의 수로 나눕니다.
      11. 이미징, 이전 빛에서 보호 하는 4 ° C에서 최대 7 일 동안 접시를 유지 합니다.

    4. 기름 빨간 O 얼룩 통해 세포내 지질의 정량화

    참고: 다음 세포내 myelin 파편 파생 지질을 관찰 하는 기본 방법입니다.CFSE myelin 파편을 표시를 사용 하 여 오로의 형광 정량화에 대 한 권장 하지 않습니다 스펙트럼 오버랩 때문에 얼룩. 다른 트리 트 먼 트 및 실험 조건 추가 조사에 의해 최적화 될 필요 합니다.

    1. 얼룩이 솔루션의 준비
      1. 0.5% 기름 빨간 O (오로) 얼룩 솔루션을 준비 합니다.
        1. 천천히 오 (교 반 하면서 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol)로 0.5 g을 100 mL 100% 프로필 렌 글리콜 (1, 2-Propanediol)의 추가.
        2. 또는 모든 큰 입자는 해산 될 때까지 15 분 동안 95 ° C에 솔루션을 열.
          참고: 이상의 100 ° c.가 열 하지 마십시오
        3. 새 컨테이너로 아직 따뜻한 반면 필터 종이 통해 해결책을 필터링 합니다.
        4. 실시간 솔루션에서 멋진 하룻밤 솔루션 실시간에서 1 년까지 저장 될 수 있도록
      2. 85% 프로필 렌 글리콜 솔루션을 준비 합니다.
        1. DdiH2오 볶음까지 혼합의 15 mL를 100% 프로필 렌 글리콜의 85 mL를 추가 합니다. 솔루션은 실시간에서 1 년까지 저장 될 수 있다
    2. 치료 접시의 준비
      1. 섹션 3에서 설명 하는 방법을 24-잘 접시를 준비 합니다.
      2. 37 ° C, 5% CO2 24 h에서 품 어.
    3. Myelin 파편 치료
      1. 각 잘 (1 mg/mL 최종 농도)를 100 mg/mL myelin 파편의 10 µ L를 추가 합니다.
      2. 1-3 h 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.
      3. 3 번 비 소화 myelin 파편 제거 살 균 PBS 가진 접시를 씻어.
        참고:이 시점에서 접시도 즉시 고정 받을 수 있습니다 또는 신선한 CMCM 추가 될 수 있다, 고 셀 반환 추가 시간 포인트에 대 한 보육.
      4. 각 우물에 4 %paraformaldehyde 400 µ L를 추가 합니다. 실시간에서 30 분 동안 품 어
      5. 세척 접시 2 번 살 균 PBS 다음 얼룩을 진행할.
    4. 오로 얼룩이 지 고 분석
      1. 워시 ddiH2오 3 번 플레이트를 고정
      2. 각 잘을 100% 프로필 렌 글리콜의 400 µ L을 추가 하 고 실시간에 5 분 동안 품 어
        참고:이 ddiH2o.의 carryover 줄어
      3. 프로필 렌 글리콜을 발음 하 고 각 잘 하 오로 솔루션의 400 µ L를 추가 합니다.
      4. 60 ° c.에 8 분 동안 품 어
      5. 오로 솔루션 발음 다음, 각 잘을 85% 프로필 렌 글리콜의 400 µ L을 추가 하 고 실시간에 5 minumintes에 대 한 품 어
      6. 세척 접시 3 번 ddiH2o.
      7. 각 우물에 Hoechst 33258 솔루션의 400 µ L를 추가 합니다. RT, 빛에서 보호에서 5 분 동안 품 어.
      8. 2 번 살 균 PBS로 세척 접시입니다.
      9. 각 우물에 Tris 버퍼와의 불 화-젤 200 µ L를 추가 합니다.
      10. 거꾸로 피 형광 수 있는 현미경을 사용 하 여 이미지 셀. 오로 표준 텍사스 레드 또는 DsRed 필터 세트를 사용 하 여 몇 군데 있습니다.
      11. 각 이미지 필드에 오로 긍정적인 영역을 결정 하 고 핵의 수로 분할 하 여 상대 지질 보존을 계량.
      12. 4 ° C에서 7 일에 대 한 번호판 빛 으로부터 보호 유지.

    액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

    결과

    CFSE myelin 파편 분류와 BMDMs의 치료 분명 국제화 (그림 2) 항복 한다. 3-시간 상호 작용 시간 강력한 다운스트림 검출을 위한 충분 한 추가 myelin 파편 phagocytose에 BMDMs에 대 한 충분 한 동안, 상호 작용의 1 시간 만큼 적게와 세포내 축적을 관찰할 수 있습니다. 그러나, 일부 myelin 파편 여전히 존재할 수 있습니다 세포 표면에 세척 후. 이 부족 한 세척 또는 입자 안 먹어서의 초기 단계 동안 내 면 완벽 하 게 되 고 있을 수 있습니다.

    BMDMs 빠르게 myelin 파편을 internalize 수 있다, 하는 동안 lysosomal 처리 오로 stainable 지질 작은 물방울 형태로 하기 전에 필요 합니다. 설명 하기 위해, BMDMs myelin 파편으로 90 분 동안 incubated, 세척, 되었고 이전에 고정 하 고 (그림 3

    액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

    토론

    여기에 설명 된 절차 활용 갓 고립 된 원유 CNS myelin 파편과 기본 골 수 유래 세포. 동물 비용을 줄이기 위해,이 좋습니다 모두 두뇌 및 희생의 때에 각 마우스에서 골 수 세포 수확. 두 연구원 협력 동시에 두 재료를 준비할 수 있습니다. 또는, 두뇌 myelin 파편 격리 전에 항생제로 보충 하는 PBS에-80 ° C에 저장할 수 있습니다. 그것은 우리의 경험을 머리 최대 1 개월 myelin 파편 생성 잠재력의 손실 없이 감지할 수 이러한 조건에서 유지 될 수 있었습니다.

    CFSE는 형광 강도 및 사용의 용이성 때문에 myelin 파편을 분류 하는 데 사용 됩니다. 휴대 전화 esterases 분자14에 아세테이트 그룹을 쪼개까지 염료 침묵과 남아 있습니다. 해제 된 succinimidyl 에스테 르 그룹 다음 세포질 단백질14공유 첨부 파일에 결과 기본 amides로 반응 수 있...

    액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

    공개 사항

    저자 아무 공개 있다.

    감사의 글

    저자는 글렌 생어 Hodgson, 비디오 제작, 편집, 및 음성에 그의 모든 작품에 대 한 의학의 FSU 대학에 미디어 전문가 감사 하 고 싶습니다.

    이 작품은 국립 보건원 (R01GM100474 및 R01GM072611)에 의해 지원 되었다.

    액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

    재료

    이 논문에 사용된 재료 목록
    이름회사카탈로그 번호댓글
    DMEMGE Healthcare Life SciencesSH30243.01L-글루타민, 피루브산 나트륨이 함유된 고포도당
    페니실린-스트렙토마이신 용액Corning30-002-CI100X 용액
    New Born Calf Serum (NCS)Rocky Mountain BiologicsNBS-BBT-5XMUnited States Origin
    NCTC clone 929 [L cell, L-929, strain L의 유도체] ATCCCCL-1L929 컨디셔닝 배지 준비
    24웰 세포 배양 플레이트VWR10062-896 
    세포 배양 접시Greiner Bio-One639960폴리스티린, 145/20mm
    CFSE 세포 증식 키트Thermo FisherC34570DMSO 화해를 위한
    Fluoro-gel with Tris Buffer 전자 현미경 과학17985-11
    오일 레드 O시그마 알드리치O0625
    Equipment
    MaterialsCompany카탈로그 번호Comments
    Ultracentrifuge TubesBeckman Coulter326823Thinwall, 폴리프로필렌, 38.5 mL, 25 x 89 mm
    SW 32 Ti 초원심분리기 로터Beckman Coulter369650SW 32 Ti 로터, 스윙 버킷, 티타늄
    휴대용 로터리 균질화기Fisher Science08-451-71
    의 세포주

    참고문헌

    1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
    2. Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
    3. Cavaillon, J. M. Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).
    4. Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).
    5. Wang, X., et al. Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris. Glia. 63 (4), 635-651 (2015).
    6. Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study. J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).
    7. Greenhalgh, A. D., David, S. Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death. J Neurosci. 34 (18), 6316(2014).
    8. Sun, X., et al. Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system. PLoS One. 5 (2), e9380(2010).
    9. Gensel, J. C., Zhang, B. Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res. , 1-11 (2015).
    10. Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants. Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).
    11. Larocca, J. N., Norton, W. T. Current Protocols in Cell Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
    12. Norton, W. T., Poduslo, S. E. Myelination in rat brain: method of myelin isolation. J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).
    13. Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).
    14. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
    15. Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells. Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).
    16. Kroner, A., et al. TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord. Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).
    17. Trouplin, V., et al. Marrow-derived Macrophage Production. J Vis Exp. (81), e50966(2013).
    18. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).
    19. Guo, L., et al. Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media. Mol Brain. 9 (1), 48(2016).
    20. Bosco, D. B., et al. A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis. PLOS ONE. 12 (2), e0172925(2017).
    21. Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O. Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).
    22. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).
    23. Fang, H., et al. Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP. J Immunol. 173 (1), (2004).
    24. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, (2008).
    25. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).

    액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

    재인쇄 및 허가

    태그

    수초 파편 포식 작용수크로스 밀도 구배 초원심분리CFSE 표지Oil Red-O 염색골수 분리대식세포 배양수초 파편 준비포식 작용 분석형광 현미경 관찰
    생체 외에서 골 수 유래 세포에 의해 Myelin 파편 식 균 작용
    문의하기
    도서관에 추천하기

    개인정보 처리방침

    이용 약관

    정책

    저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.