여기 HDL-지질 과산화의 결정에 대 한 fluorometric 셀 무료 생화학 분석 결과 설명합니다. 이 신속 하 고 재현성 분석 결과 대규모 연구에서 HDL 함수를 확인 하는 데 사용 수 고 인간의 질병에 HDL 함수에 대 한 우리의 이해에 기여할 수 있다.
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방법 논문
고밀도 지단백에 지질 과산화의 높은 처리량 측정을 위한 생 화 확 적인 세포-무료 Fluorometric 효소 분석 결과
이 논문에서
요약
초록
낮은 고밀도 지 단백 콜레스테롤 (HDL-콜레스테롤) 수치는 동맥 경 화성 심혈 관 질환 (CVD)의 가장 강력한 독립적인 부정적인 예측 중 하나입니다. 구조와 기능 보다는 HDL-콜레스테롤 HDL의 동맥 경화를 예측 더 정확 하 게 수 있습니다. 몇 가지 HDL 단백질과 지질 구성 변경 사항을 HDL 기능 손상 동맥 경화 증 같은 염증 성 상태에 발생 합니다. HDL 함수 일반적으로 콜레스테롤 경과 분석 결과 이러한 분석 등 분석은 표준화의 수많은 단점 부족 세포 기반으로 의해 결정 됩니다. 셀 무료 분석 실험 세포 기반 분석 실험에 비해 HDL 함수의 보다 강력한 대책을 줄 수 있습니다. HDL 산화 HDL 기능을 손상 한다. HDL 지질 과산화 수소 수송에 있는 중요 한 역할 및 지질 과산화물의 높은 금액은 비정상적인 HDL 함수 관련. 지질 조사 상호 작용은 지질 산화 상태를 측정 하기 위한 분석 실험 비 효소 형광의 결과 해석 할 때 고려 되어야 한다. 이 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠 (HDLox) HDL 역 기능에 기여를 평가 하기 위해 셀 무료 생화학 효소 방법 개발 동기. 이 방법은 효소 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 및 HDL-C의 밀리 그램 당 지질 과산화 수소 콘텐츠 (없이 콜레스테롤 산화 효소) 계량 수 Amplex 레드 형광 색소에 따라 여기는 프로토콜은 형광 색소 시 약을 사용 하 여 HDL-지질 과산화의 describedfor 결정. 분석 결과 변화 실험 조건의 엄격한 표준화에 의해 줄일 수 있습니다. HDLox 값이 높을수록 감소 된 HDL 항 산화 기능으로 연결 됩니다. 이 분석 결과의 판독은 유효한 세포 기반 분석, 심혈 관 질환, 조직의 염증, 면역 부전, 및 관련된 심혈 관 및 대사 위험 고기 대리 측정의 판독에 연관 된다. 이 기술적인 접근 조직의 염증, 산화 스트레스와 산화 지질 (동맥 경화) 등 중요 한 역할을가지고 인간의 질병에 HDL 기능을 평가 하는 강력한 방법입니다.
서론
동맥 경 화성 심혈 관 질환 (CVD) 죽음 전세계1,2의 주요 원인입니다. 역학 연구 고밀도 지단백 (HDL) 콜레스테롤의 저급은 반대로 동맥 경화1,2의 개발에 대 한 위험과 연관 일반적으로 나타났습니다. 여러 연구는 HDL1,2atheroprotective 역할을 지원, 비록는 HDL 약하게 시작 및 동맥 경화의 진행 하는 메커니즘은 3,4입니다. 따라서, 그것은 복잡 한 구조와 기능 절대 수준 보다는 오히려 HDL의 아 테 롬 5,6,,78예측 더 정확 하 게 수 있습니다 제안 되었습니다. 몇 가지 HDL 단백질과 지질 구성 변경 사항을 HDL....
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프로토콜
캘리포니아 로스 앤젤레스, 로스 앤젤레스와 알프레드 병원 인간의 윤리 위원회, 멜버른의 대학에서 윤리 승인 인간의 생물 학적 샘플을 사용 하 여 모든 실험 수행.
참고: 형광 색소 HDL 기능 분석 결과 (참조 토론) 32의 많은 변이가 있다. 아래 우리는 가장 일관 되 고 재현 가능한 결과 제공 하는 프로토콜을 설명 합니다. 분석 결과 대 한 개요는 그림 2에 표시 됩니다.
1. 표본 처리
- 사용 신선한, hemolyzed 비 혈 (혈 청 분리기 관에 수집 될 수 있습니다) 또는 시트르산 플라즈마 12-14 시간 금식 후 얻은. Cryopreserved 샘플을 사용 하는 경우이 프로토콜에서 설명 된 대로 적절 한 컨트롤 포함.
2. 하루 0-분석 결과 대 한 준비
적절 한 컨트롤과 실험의- 준비 작업 레이아웃 샘플 및 복제. 적어도 triplicates에 각 샘플을 실행 합니다. 대표 96 잘 레이아웃 그림 3에 표시 됩니다. ....
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결과
각 HDL 샘플의 50 µ L 단계 7.3에서 각 음에 추가 됩니다. 50 µ L HRP 솔루션 5 U/mL (0.25 U) 그런 다음 단계 7.5에서 각 음에 추가 됩니다. 샘플 단계 7.6에서 37 ° C에서 30 분 동안 알을 품는. 형광 색소 시 약의 50 µ L 다음 단계 7.7 (300 µ M의 최종 농도)에서 각 음에 추가 됩니다. (에서 어두운) 형광 판독입니다 다음 매 순간 형광 플레이트 리더 (530/590 nm 필터) 37 ° C에서 120 분 동안 평가 했다. 빈, 풀링된 컨트롤에 대 한 대표적인 형광 데이터, 알려진된 역 기능 HDL와 샘플 및 샘플 일반 HDL 그림 4에 표시 됩니다. 원시 대표적인 데이터와 프로토콜의 8에서에서 설명 하는 방정식을 사용 하 여 결과의 단계 분석 에서처럼 표 1. 이 예제에서는 신선한 HDL 샘플 사용 하 고 HDLox 값은 일반적.......
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토론
여기에 설명 된 프로토콜 동맥 경화 및 인간 질병에 HDL 함수의 역할에 관한 중요 한 연구 질문에 대답 하는 강력한 도구를 제공 합니다. 분석 결과 효소 증폭 (HRP)를 사용 하 여 HDL-콜레스테롤의 mg 당 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠 단정. 이 접근 방지 사용 하는 세포의 종류, 유형의 판독 보고, 표준화의 부족과 혼란 효과 관해서 중요 한이 포함 하 여 이전 HDL 기능 분석 (예: 콜레스테롤 경과 분석 결과)의 알려진된 제한 사항 트리 글리세라이드7,,1532. HDL의 생물 학적 속성 (예: 콜레스테롤 경과) 보다 생화학의 결정 더 재현할 수 있습니다. 간 분석 결과 실험 다양성 < 10% 호의 비교 하 여 HDL 함수, interassay 실험적인 다양성은 종종의 세포 기반 분석으로 > 15% (또는 보고 되지 않은). 또한,이 .......
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공개 사항
이 프로토콜 및 분석 결과 특허 PCT/US2015/018147와 관련이 있습니다.
감사의 글
저자는 기꺼이이 모델의 이전 반복의 개발에 그들의 중요 한 역할에 대 한 박사 모하마드 Navab, 앨런 Fogelman와 스리 니 바사 레디의 작품을 인정합니다. T.A.A.는 RMIT 대학 담당-장관의 박사 장학금에 의해 지원 됩니다. AJ와 아 NHMRC 프로젝트 그랜트 1108792에 의해 지원 됩니다. TK에 의해 지원 됩니다 NIH 부여 NIH K08AI08272, NIH/NCATS 그랜트 # µL1TR000124.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Experimental Reagents | |||
| HDL PEG(폴리에틸렌 글리콜) 침전 시약 | Pointe Scientific | H7511 | |
| Amplex Red 시약. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트. • ≤ – 20° C &황소; 건조제 • 가벼운 DMSO로부터 보호하십시오 |
| . | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트. • ≤ – 20° C &황소; 건조제 • 가벼운 |
| 말 무 퍼옥시다제 (HRP) | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트로부터 보호하십시오. • ≤ – 20° C &황소; 건조제 • 가벼운 |
| 콜레스테롤 에스테라아제 | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트. • ≤ – 20° C &황소; 건조제 • 빛으로부터 보호 |
| 콜레스테롤 참조 표준 | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트. • ≤ – 20° C &황소; 건조제 • 빛으로부터 보호 |
| Resorufin 형광 참조 표준 | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트. • ≤ – 20° C &황소; 건조제 • 빛으로부터 보호5x |
| 반응 버퍼. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트. • ≤ – 20° C &황소; 건조제 • 가벼운 |
| HDL 콜레스테롤 자동화 시약 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | TR39601 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| >Plasticware | |||
| 96-well plates (폴리프로필렌, 평평한 바닥, 투명). | Sigma Aldrich | M0687 | |
| 96웰 플레이트(폴리프로필렌, 평평한 바닥, 검정색). | Sigma Aldrich | M9936 | |
| 1.5 mL Eppendorf 튜브 | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| ClipTip 200, sterile | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-488-058 | |
| Thermo Scientific 멀티채널 피펫, 8-채널, 125 | ThermoFisher Scientific Co., 미국 캘리포니아주 산호세. | 14-387--955 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Software | |||
| Gen5 2.01 소프트웨어 | Biotek, 버몬트, 미국 | NA | |
| strong>Name | 회사 | 카탈로그 번호 | Comments |
| Equipment | |||
| Gen5 Plate reader | Biotek, 버몬트, 미국 | NA |
참고문헌
- Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
- Rubins, H. B., et al.
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재인쇄 및 허가
