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방법 논문

고밀도 지단백에 지질 과산화의 높은 처리량 측정을 위한 생 화 확 적인 세포-무료 Fluorometric 효소 분석 결과

8.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56325

⸱

2017년 10월 12일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of California, Los Angeles, 2Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 3School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 4Department of Infectious Diseases, Monash University

이 논문에서

요약

여기 HDL-지질 과산화의 결정에 대 한 fluorometric 셀 무료 생화학 분석 결과 설명합니다. 이 신속 하 고 재현성 분석 결과 대규모 연구에서 HDL 함수를 확인 하는 데 사용 수 고 인간의 질병에 HDL 함수에 대 한 우리의 이해에 기여할 수 있다.

초록

낮은 고밀도 지 단백 콜레스테롤 (HDL-콜레스테롤) 수치는 동맥 경 화성 심혈 관 질환 (CVD)의 가장 강력한 독립적인 부정적인 예측 중 하나입니다. 구조와 기능 보다는 HDL-콜레스테롤 HDL의 동맥 경화를 예측 더 정확 하 게 수 있습니다. 몇 가지 HDL 단백질과 지질 구성 변경 사항을 HDL 기능 손상 동맥 경화 증 같은 염증 성 상태에 발생 합니다. HDL 함수 일반적으로 콜레스테롤 경과 분석 결과 이러한 분석 등 분석은 표준화의 수많은 단점 부족 세포 기반으로 의해 결정 됩니다. 셀 무료 분석 실험 세포 기반 분석 실험에 비해 HDL 함수의 보다 강력한 대책을 줄 수 있습니다. HDL 산화 HDL 기능을 손상 한다. HDL 지질 과산화 수소 수송에 있는 중요 한 역할 및 지질 과산화물의 높은 금액은 비정상적인 HDL 함수 관련. 지질 조사 상호 작용은 지질 산화 상태를 측정 하기 위한 분석 실험 비 효소 형광의 결과 해석 할 때 고려 되어야 한다. 이 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠 (HDLox) HDL 역 기능에 기여를 평가 하기 위해 셀 무료 생화학 효소 방법 개발 동기. 이 방법은 효소 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 및 HDL-C의 밀리 그램 당 지질 과산화 수소 콘텐츠 (없이 콜레스테롤 산화 효소) 계량 수 Amplex 레드 형광 색소에 따라 여기는 프로토콜은 형광 색소 시 약을 사용 하 여 HDL-지질 과산화의 describedfor 결정. 분석 결과 변화 실험 조건의 엄격한 표준화에 의해 줄일 수 있습니다. HDLox 값이 높을수록 감소 된 HDL 항 산화 기능으로 연결 됩니다. 이 분석 결과의 판독은 유효한 세포 기반 분석, 심혈 관 질환, 조직의 염증, 면역 부전, 및 관련된 심혈 관 및 대사 위험 고기 대리 측정의 판독에 연관 된다. 이 기술적인 접근 조직의 염증, 산화 스트레스와 산화 지질 (동맥 경화) 등 중요 한 역할을가지고 인간의 질병에 HDL 기능을 평가 하는 강력한 방법입니다.

서론

동맥 경 화성 심혈 관 질환 (CVD) 죽음 전세계1,2의 주요 원인입니다. 역학 연구 고밀도 지단백 (HDL) 콜레스테롤의 저급은 반대로 동맥 경화1,2의 개발에 대 한 위험과 연관 일반적으로 나타났습니다. 여러 연구는 HDL1,2atheroprotective 역할을 지원, 비록는 HDL 약하게 시작 및 동맥 경화의 진행 하는 메커니즘은 3,4입니다. 따라서, 그것은 복잡 한 구조와 기능 절대 수준 보다는 오히려 HDL의 아 테 롬 5,6,,78예측 더 정확 하 게 수 있습니다 제안 되었습니다. 몇 가지 HDL 단백질과 지질 구성 변경 사항을 HDL 기능 손상 동맥 경화 증 같은 염증 성 상태에 발생 합니다. 이러한 i) 감소는 콜레스테롤 경과 잠재적인 9, ii) 항 염증 및 증가 HDL 관련 된 프로-염증 성 단백질 6,7, iii) 감소 항 산화 요소 수준 및 활동 및 HDLs 감소 낮은 밀도 지 단 백 질 (LDLox)10 및 4의 산화를 억제 하는 기능) 지질 hydroperoxide 콘텐츠 및 산화 환 원 활동 (HDLox)9,11증가. 수 있습니다 (예: 콜레스테롤 경과, 항 산화 기능) HDL의 pleotropic 기능을 평가 하는 강력한 분석 HDL-HDL-콜레스테롤은 병원에서의 보완 하는 것입니다.

HDL 함수는 일반적으로 콜레스테롤 경과 분석 결과8,12,,1314같은 셀 기반 방법으로 평가 됩니다. 이러한 방법을 사용 하는 세포의 종류, 유형의 판독 보고, 표준화의 부족 및 트리 글리세라이드 7,15의 혼란 효과 관해서 중요 한이 포함 한 주요 제한이. 이러한 단점이 큰 임상 연구16어려움 포즈. 셀 무료 분석 실험 세포 기반 분석 실험에 비해 HDL 함수의 보다 강력한 대책을 줄 수 있습니다. 콜레스테롤 경과 HDL의 가장 중요 한 기능 중 하나 이지만 그것은 세포 기반 분석 실험에 의해 결정 수 있습니다. Proteomics17,18,19,20,,2122,23, 같은 HDL 함수를 확인 하는 다른 접근 24 및 HDL 함수 17,,2225 의 셀 기반 monocyte chemotaxis 분석 실험 표준화 되지 대규모 인간 연구에 사용할 수 없습니다.

HDL는 중요 한 항 산화 atheroprotective 효과5,6,,78. HDL의 항 산화 기능 이전 셀 무료 fluorometric 분석 실험 26에 LDL의 존재 결정 했다. 이러한 생화학 fluorometric 방식의 HDL 항 산화 기능 모하마드 Navab과 앨런 Fogelman26그들의 동료 의해 원래 개발 되었다. 비록 많은 인간 연구 HDL 함수 17,18,19,20,,2122,23 결정 하기 위해 이러한 방법을 사용 ,24, 지질 (HDL)-지질 (LDL) 및 지질-형광 색소 상호 작용의 이러한 셀 무료 비 효소 생 화 확 적인 분석 실험 HDL 기능27,28의 재현성을 제한할 수 있습니다.

최근 관심은 지질과 HDL 27,,2930단백질의 산화 결과 HDL 산화의 기능적 결과에 집중 했다. 사전 연구 HDL의 그 산화 손상 HDL 기능 27,,2930. HDL 지질 과산화 수소 수송에 있는 중요 한 역할 및 지질 과산화물의 높은 금액은 비정상적인 HDL 함수 관련. 따라서 HDL 지질 과산화 수소 수 수 HDL 함수 9,17,,2031 을 결정 하는 데 사용 내용과 주어진 HDL 기능7의 이전 분석 실험의 알려진된 제한 사항 15,,2732, 우리 개발 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠 (HDLox) 32단정 대체 fluorometric 메서드입니다. 이 방법은 효소 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 및 HDL-C 32의 mg 당 지질 과산화 수소 콘텐츠 (없이 콜레스테롤 산화 효소) 계량 수 Amplex 레드 형광 색소를 기반으로 합니다. 분석 결과의 생 화 확 적인 원리는 그림 1에 표시 됩니다. 우리는이 형광 기반 접근 이전 HDL 기능 분석 실험27,28의 한계는 없습니다 나타났습니다. 이 분석 결과 더 세련 되 고도 cryopreserved 플라즈마 32,,3334, 와 함께 대규모 인간 연구에서 안정적으로 사용할 수 있도록 우리의 실험실에서 표준화 되어 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42.이 분석 결과의 판독은 판독 검증된 세포 기반 분석, 심혈 관 질환, 조직 염증, 면역 부전 및 관련된 심혈 관 및 대사 위험 고기 대리 조치의 연관 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. 여기, 우리이 간단 하면서도 강력한 방법을 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠 (HDLox)를 측정 하는 설명. 이 분석 결과 사용할 수 있습니다 도구 HDL 함수 인간의 질병에서의 역할에 관한 중요 한 연구 질문에 대답 하 조직의 염증, 산화 스트레스와 산화 지질32(동맥 경화) 등 중요 한 역할가지고.

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프로토콜

캘리포니아 로스 앤젤레스, 로스 앤젤레스와 알프레드 병원 인간의 윤리 위원회, 멜버른의 대학에서 윤리 승인 인간의 생물 학적 샘플을 사용 하 여 모든 실험 수행.

참고: 형광 색소 HDL 기능 분석 결과 (참조 토론) 32의 많은 변이가 있다. 아래 우리는 가장 일관 되 고 재현 가능한 결과 제공 하는 프로토콜을 설명 합니다. 분석 결과 대 한 개요는 그림 2에 표시 됩니다.

1. 표본 처리

  1. 사용 신선한, hemolyzed 비 혈 (혈 청 분리기 관에 수집 될 수 있습니다) 또는 시트르산 플라즈마 12-14 시간 금식 후 얻은. Cryopreserved 샘플을 사용 하는 경우이 프로토콜에서 설명 된 대로 적절 한 컨트롤 포함.

2. 하루 0-분석 결과 대 한 준비

적절 한 컨트롤과 실험의
  1. 준비 작업 레이아웃 샘플 및 복제. 적어도 triplicates에 각 샘플을 실행 합니다. 대표 96 잘 레이아웃 그림 3에 표시 됩니다.
  2. 계산 샘플 및 복제의 수에 따라 분석 결과 대 한 사용 될 시 약의 모든 볼륨.
    참고: 각 작업 재고 특정 실험에 대 한 각 시 약에 대 한 충분 한 볼륨 있는지 확인 하는 추가 10% 볼륨 포함.
  3. 예: HDL, HDL-콜레스테롤 (선택 사항)의 측정은 fluorochromeassay의 분리에 대 한 분석 결과의 모든 다른 단계에 대 한 모든 필요한 튜브 라벨.

3. 컨트롤의 하루 1-준비

  1. 모든 연구의 연구 관련 풀링된 제어의 준비
    1. 만들기 풀링된 플라스마 또는 혈 청에서 컨트롤 샘플 샘플. 3 중에 각 접시에 20 샘플을 실행 하는 경우 200 µ L 풀링된 컨트롤에 각 샘플에서 10 µ L를 결합. 이 컨트롤의 HDL-콜레스테롤 값을 결정 하기 위해 임상 실험실에 게이 풀된 컨트롤의 별도 약 수.
      참고:이 풀링된 컨트롤을 사용 하 여 분석 결과 표준화 하 여 가능한 모든 알려진 계정 (예: 플라즈마, freeze-thaw 주기, cryopreservation 매트릭스 세럼의 유형) 및 실험적인 다양성에 영향을 미칠 수 있습니다 알 수 없는 confounders 27 , 28.
  2. 실험실 관련 품질 관리 (QCs)의 준비
    1. 각 실험실 (예: 10 건강 한 기증자 로부터 플라즈마의 5 mL에서 고립 된 HDL)에 HDL의 큰 재고를 준비 하 고이의 여러 aliquots cryopreserve freeze-thaw 주기를 최소화 하기 위해 주식.
    2. 사용 적어도 10 다른 HDLox의 평균 값을 확인 하려면이 주식에서 복제 합니다. 측정 된 HDLox의 허용 범위 내에서 각 분석 결과에 포함 된 각 QC 샘플은 값 <이 평균 값의 변동 계수의 15%.
    3. 가이 컨트롤 (예: 40 mg/dL) HDL-콜레스테롤 값을 결정 하기 위해 임상 연구소에 게이 풀된 컨트롤의 별도 약 수.
      참고: 자세한 방법은 이러한 컨트롤을 만들 혈액 은행에서 혈액을 사용 하는 방법을 이전 되었습니다 설명된 27 , , 28 32. 필요에 따라 추가 QCs 사용 (예: 정상적인 HDL 기능과 크게 비정상적인 HDL 함수 알려진 기증자에서 하는 건강 한 기증자에 게 서 한.
  3. 최적화 배경 신호 및 빈 값 (옵션)
    1. 백그라운드를 최소화 하기 위해 형성된 된 H 2 O를 빠르게 제거 하 인큐베이션 매체에 catalase (1-4 U/mL)의 적절 한 금액을 추가 2 버퍼의 자발적인 공기 산화 때문.
      참고: 이후 빈 우물 (HDL)에서 값 HDL 샘플의 값에서 뺀 되 고 결과 풀링된 컨트롤 (같은 96 잘 접시에 포함)를 기준으로 보고 우리가 찾은이 단계는 실제적으로 하지 affec t는 결과. 따라서, catalase로 배경 신호 최적화 생략할 수 있습니다, 필요한 경우.

4. 하루 1-HDL 콜레스테롤 HDL 강 수를 사용 하 여 분리

참고: 상업적으로 사용 가능한 표준화 된 HDL 콜레스테롤 계기 시 제조 업체에 따라 고갈 apoB 혈 청을 사용 하 여 ' s 지침입니다. 이 시 약 HDL 콜레스테롤 수치를 결정 하기 위해 색도계 분석 실험에서 널리 이용 된다.

  1. 신선한 사용 (해 동) 플라스마 또는 혈 청 샘플.
  2. 같은 볼륨 (예: 80 µ L) 플라스마와 HDL 콜레스테롤 계기 시 약 (20 %w / v 폴 리 에틸렌 글리콜 글리신 버퍼 pH 10.0 (25 ° C))의 혼합.
  3. 아래로 pipetting으로 잘 믹스.
  4. 원심에서 1000-2000 x 10 분에 대 한 g
  5. 상쾌한 (HDL 분수) 발음.
  6. 는 이상적으로 사용 하 여 즉시 격리 HDL HDL 지질 과산화의 fluorochromeassay에 대 한. 그러나, 여러 샘플은 같은 날에 실행 하는 경우 HDL-콜레스테롤 농도의 측정은 또한 완료와 같은 다른 단계 4 ° C에서 고립 된 HDL 저장 그리고 fluorochromeHDL 기능 분석 결과 대 한 다음 날 사용.

5. 격리 된 HDL에 HDL-콜레스테롤의 날 1-결정

참고: 이것은 임상 실험에서 HDL-콜레스테롤의 값은 HDLox을 정상화 하 HDL-콜레스테롤 양을 사용 하는 경우.

  • 계량 HDL-콜레스테롤 플라즈마에서
      , 27 분석 실험 표준 색도계를 사용 하 여. 각 잘에서 콜레스테롤 약의 50 µ L을 추가 하 고 콜레스테롤 농도 색도계 플레이트 리더와 콜레스테롤 표준 각 키트에 제공 된 사용 하 여 결정.

    • 6. 하루 2-시 약의 준비

    1. HRP 5 U/mL 해결책 (범위 1-10 U/mL)의 준비 HRP와 콜레스테롤 솔루션.
    2. 준비 20 m m 형광 색소 (예: Amplex 레드) 솔루션: 실내 온도에 형광 색소 시 약 및 DMSO의 유리병을 녹여. 사용 전에 분해 DMSO의 200 µ L에 형광 색소 시 약 (1 mg). 재고 솔루션에 냉동 저장 ≤-20 ° C, 빛 으로부터 보호.
    3. 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 준비: 사용 1 X ' 반응 버퍼 ' 콜레스테롤 및 20 m m H 2 O 2 없이 작업 솔루션 부정적이 고 긍정적인 컨트롤로 각각.

    7. 하루 2-형광 색소 분석 결과

    1. 빈 (부정적인 제어)으로 반응 버퍼 x 1의 추가 50 µ L.
    2. 옵션: 각 접시에 긍정적인 컨트롤로 20 m m H 2 O 2의 작업 솔루션 추가.
    3. 실험적인 변화를 최소화 하는 추가 시 약 및 샘플의 지속적으로 행해진다 고 적절 한 시기에는 별도 96 잘 라운드-하단, 분명, 폴리스 티 렌 또는 폴 리 프로필 렌 플레이트 (접시 1) 샘플의 모든 추가 수행 합니다. 다음 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 특정 볼륨 3 96 잘 접시에 전송 (2-4 격판덮개: 폴 리 프로필 렌, 봇톰, 블랙) (있는 동일한 레이아웃) ( 그림 2, 그림 3).
      1. 예를 들어 처음에 격판덮개 1의 각 잘/샘플으로 고립 된 HDL의 160 µ L를 추가 하 고 멀티 채널 피 펫의 사용과 HDL-콜레스테롤의 50 µ L에서에서 전송할 각 잘/샘플 검은 96 잘 접시. 팁 각 행/열 사이 변경 하 고 필터링 되지 않은 팁을 사용 하 여 모든 전송.
    4. 우물에서 샘플을 두고. 버리지 마십시오. 시 약의 추가 사이 아무 세척 단계에 있다.
    5. HRP 솔루션 5의 추가 50 µ L U/mL (0.25 U) 각 잘.
      참고: 사용 하 여 형광 색소 시 약의 추가 하기 전에 HRP.
    6. 37 ° c.에 30 분 동안 품 어 인큐베이션 (시 약의 추가 사이 세척 단계) 후에 샘플을 버리지 마십시오.
    7. 추가 50 µ L 300의 최종 농도 대 한 fluorochromereagent의 µ M. 이 시점에서, 총 반응 볼륨은 150 µ L. 잘 섞어 그리고 빛에서 보호.
    8. 평가 (어둠)에 형광 판독 형광 플레이트 리더 (530/590 nm 필터) 37 ° C에서 120 분 이상 모든 분.
      참고: 짧은 60 분 간격을 사용 하 여 신선한 샘플. 우리는 120 분 분석 결과 cryopreserved 샘플의 사용으로 더 많은 재현할 수 데이터를 제공 것으로 나타났습니다.
    9. 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 기록.

    8. 하루 3-데이터 분석

    1. 빈 우물을 포함 하 여 모든 샘플에 대 한 형광 색소 시 약의 추가 후 120 분에 형광 단위 (임의의 단위)을 기록 하 고 모든 컨트롤.
    2. 형광 단위의 평균 값을 계산 (에 따라 적어도 triplicates) (HDL ox_sample). 이상 값에는 영향을 받지 않습니다 (> 2 평균 값에서 SDs) 고려.
    3. 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 배경 형광 빼기:
      figure-protocol-1
    4. 정규화 동안 HDL 콜레스테롤 (HDL-콜레스테롤): HDL-콜레스테롤에 의해 (를 포함 하 여 풀링된 제어) 각 샘플에 대 한 HDLox 지질 과산화 값 정상화) (mg/dl). 결과 섹션에 걸쳐 HDL 황소 n HDL-c.에 대 한 조정을 반영 (HDL-콜레스테롤) HDLox 측정으로 제시 다음과 같은 방정식을 사용 하 여:
      figure-protocol-2
    5. 풀링된 컨트롤의 값에 대 한 각 샘플의 HDLox 지질 과산화 값 표현의 표준화. N (HDL-콜레스테롤) HDLox 지질 과산화 풀링된 컨트롤의 값에 의해 n (HDL-콜레스테롤) HDLox 지질 과산화 (HDL-콜레스테롤에 대 한 조정) 각 샘플에 대 한 값을 정상화. 결과 섹션에 걸쳐 HDL 황소 실험적인 다양성와 HDL-C에 대 한 조정을 반영 하기 위해 nHDL 황소 측정으로 제시 다음과 같은 방정식을 사용 하 여:
      figure-protocol-3
      참고:이 방법은 같은 측정의 실험적인 다양성을 줄이기 위해 다른 설립된 실험적인 접근 비슷합니다 국제 정상화 비율 (INR) 44 , 45. 이 방법은 임상 연구 32 , 33 , , 34 35 , 36에서 검증 되었습니다. , 37 , 38 , 39.
    6. 표준 품질 관리 샘플을 사용 하 여 실험 결과의 품질 관리를 수행. 각 연구소는 그들의 자신의 품질 컨트롤 (QCs)를 설정 해야 합니다. 이상적으로 있다 알려진된 역 기능 HDL과 샘플에서 nHDLox에 대 한 품질 관리와 건강 한 기증자 [예: 사용 풀링된에서 샘플을 설립된 혈액 은행 기증자 알려진된 comorbidity 없고 위험 요소에 대 한 젊은 성인에서에서 샘플에서 nHDLox에 대 한 품질 관리 심장 혈관 질병 흡연 포함]입니다. 후자의 제어 다른 실험실 간의 결과 표준화합니다. 이러한 QCs의 평균 값 (일반적으로 우리가 사용 10 복제가 중요 한 단계에 대 한) 설립된에 따라 적어도 5 복제 됩니다.
      1. 확인 값의 예상된 범위 내 값 여부 측정된 QCs 각 분석 결과에 있다. 15%의 허용 최대 실험적인 변화를 가정, 모든 측정된 실험 값 한다 설립된 QC의 알려진된 평균 값의 15%가. 다음과 같은 방정식을 사용 하 여:
        figure-protocol-4
        figure-protocol-5
        참고: 포함 된 품질 관리 중 (샘플링 하는 경우 역 기능 HDL 대 정상) HDLox 값 예상된 범위 (각 연구실에 설립) 밖에 제공 다음 반복 실험.
    7. 실험적인 변화를 계량 편차 (CV)의 계수를 사용 하 여 실험 결과의 품질 관리를 수행: CV %와 함께 모든 샘플 반복 > 15%. 다음과 같은 방정식을 사용 하 여:
      figure-protocol-6
      참고: (이내 같은 접시) 일반적인 내부 분석 결과 (다른 접시) 가운데 간 분석 결과 실험 다양성은 < 15%. 2)는 일반적인 내부 분석 결과 이력서는 1-7% ~ 이력서 3-10% 사이 전형적인 interassay.

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    결과

    각 HDL 샘플의 50 µ L 단계 7.3에서 각 음에 추가 됩니다. 50 µ L HRP 솔루션 5 U/mL (0.25 U) 그런 다음 단계 7.5에서 각 음에 추가 됩니다. 샘플 단계 7.6에서 37 ° C에서 30 분 동안 알을 품는. 형광 색소 시 약의 50 µ L 다음 단계 7.7 (300 µ M의 최종 농도)에서 각 음에 추가 됩니다. (에서 어두운) 형광 판독입니다 다음 매 순간 형광 플레이트 리더 (530/590 nm 필터) 37 ° C에서 120 분 동안 평가 했다. 빈, 풀링된 컨트롤에 대 한 대표적인 형광 데이터, 알려진된 역 기능 HDL와 샘플 및 샘플 일반 HDL 그림 4에 표시 됩니다. 원시 대표적인 데이터와 프로토콜의 8에서에서 설명 하는 방정식을 사용 하 여 결과의 단계 분석 에서처럼 표 1. 이 예제에서는 신선한 HDL 샘플 사용 하 고 HDLox 값은 일반적...

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    토론

    여기에 설명 된 프로토콜 동맥 경화 및 인간 질병에 HDL 함수의 역할에 관한 중요 한 연구 질문에 대답 하는 강력한 도구를 제공 합니다. 분석 결과 효소 증폭 (HRP)를 사용 하 여 HDL-콜레스테롤의 mg 당 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠 단정. 이 접근 방지 사용 하는 세포의 종류, 유형의 판독 보고, 표준화의 부족과 혼란 효과 관해서 중요 한이 포함 하 여 이전 HDL 기능 분석 (예: 콜레스테롤 경과 분석 결과)의 알려진된 제한 사항 트리 글리세라이드7,,1532. HDL의 생물 학적 속성 (예: 콜레스테롤 경과) 보다 생화학의 결정 더 재현할 수 있습니다. 간 분석 결과 실험 다양성 < 10% 호의 비교 하 여 HDL 함수, interassay 실험적인 다양성은 종종의 세포 기반 분석으로 > 15% (또는 보고 되지 않은). 또한,이 ...

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    공개 사항

    이 프로토콜 및 분석 결과 특허 PCT/US2015/018147와 관련이 있습니다.

    감사의 글

    저자는 기꺼이이 모델의 이전 반복의 개발에 그들의 중요 한 역할에 대 한 박사 모하마드 Navab, 앨런 Fogelman와 스리 니 바사 레디의 작품을 인정합니다. T.A.A.는 RMIT 대학 담당-장관의 박사 장학금에 의해 지원 됩니다. AJ와 아 NHMRC 프로젝트 그랜트 1108792에 의해 지원 됩니다. TK에 의해 지원 됩니다 NIH 부여 NIH K08AI08272, NIH/NCATS 그랜트 # µL1TR000124.

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    재료

    이 논문에 사용된 재료 목록
    이름회사카탈로그 번호댓글
    Experimental Reagents
    HDL PEG(폴리에틸렌 글리콜) 침전 시약Pointe ScientificH7511
    Amplex Red 시약.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트.
    • ≤ – 20° C &황소; 건조제
    • 가벼운 DMSO로부터 보호하십시오
    .Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트.
    • ≤ – 20° C &황소; 건조제
    • 가벼운
    말 무 퍼옥시다제 (HRP)Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트로부터 보호하십시오.
    • ≤ – 20° C &황소; 건조제
    • 가벼운
    콜레스테롤 에스테라아제Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트.
    • ≤ – 20° C &황소; 건조제
    • 빛으로부터 보호
    콜레스테롤 참조 표준Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트.
    • ≤ – 20° C &황소; 건조제
    • 빛으로부터 보호
    Resorufin 형광 참조 표준Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트.
    • ≤ – 20° C &황소; 건조제
    • 빛으로부터 보호5x
    반응 버퍼.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트.
    • ≤ – 20° C &황소; 건조제
    • 가벼운
    HDL 콜레스테롤 자동화 시약ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.TR39601
    NameCompany카탈로그 번호Comments
    >Plasticware
    96-well plates (폴리프로필렌, 평평한 바닥, 투명).Sigma AldrichM0687
    96웰 플레이트(폴리프로필렌, 평평한 바닥, 검정색).Sigma AldrichM9936
    1.5 mL Eppendorf 튜브Eppendorf0030 125.150
    ClipTip 200, sterileThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.14-488-058
    Thermo Scientific 멀티채널 피펫, 8-채널, 125 ThermoFisher Scientific Co., 미국 캘리포니아주 산호세.  14-387--955
    NameCompany카탈로그 번호Comments
    Software
    Gen5 2.01 소프트웨어Biotek, 버몬트, 미국NA
    strong>Name 회사카탈로그 번호Comments
    Equipment
    Gen5 Plate readerBiotek, 버몬트, 미국NA
    로부터 보호하십시오.으로부터 보호 <

    참고문헌

    1. Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
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