최소한의 직경이 큰 볼륨에 빛을 전달 하기 위한 조직 침투 조명 기 구축 프로토콜 제공 됩니다.
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최소한의 직경이 큰 볼륨에 빛을 전달 하기 위한 조직 침투 조명 기 구축 프로토콜 제공 됩니다.
이 프로토콜 비 인간 영장류 뇌에서 optogenetic 조작에 대 한 개발 된 대규모 조명 기를 설명 합니다. 조명 기는 에칭 팁, 수정 된 플라스틱 광섬유 발광 표면적은 > 100 종래의 섬유의 x. 큰 볼륨 조명 기의 건설을 설명, 뿐만 아니라이 프로토콜도 빛을 분배를 보장 하는 데 사용 하는 품질 관리 교정을 자세히 설명 합니다. 또한,이 프로토콜 삽입 하 고 제거 하는 큰 볼륨 조명에 대 한 기술을 설명 합니다. 표면 기도 하 고 깊은 구조를 조명 수 있습니다. 이 큰 볼륨 조명 기, 전극에 물리적으로 결합 될 필요는 없습니다 그리고 플라스틱, 유리 하지는 조명 때문에 그것은 것입니다 단순히 구 부 상황에서 전통적인 광학 섬유 깨지는 것 이다 때. 이 조명 기는 기존의 광섬유 보다 큰 침투 손상으로 행동-관련 조직 볼륨 (≈ 10 m m3) 빛을 제공 한다, 때문에 그것은 비 인간 영장류에서 optogenetics를 사용 하 여 행동 연구를 촉진 한다.
밀리초 정밀, 빛 기반 신경 제어를 허용 하는 Optogenetic 도구 기능 생리학 및 설치류 및 무척 추 동물 행동 연구에 널리 사용 됩니다. 그러나, 기술 과제는 설치류 뇌 1보다 큰 x 볼륨 ~ 100 비 인간 영장류 뇌에서 optogenetics의 사용을 제한 했다.
비 인간 영장류에서 optogenetics 연구를 촉진 하는 조명 기 두 경쟁 목표를 해결 하도록 설계 되었습니다: 큰 볼륨 조명 및 최소한의 침투 손상. 이러한 우려 중 하나는 주소 이전 하려고 다른 비싼에 왔습니다. 번들 섬유 조명 더 큰 볼륨의 하지만 증가 직경, 및, 따라서, 손상2,3. 테이퍼 유리 섬유 하지만 좁게 초점 빛을 발광 표면 침투 손상을 감소 < 100 µ m2 4,5. 외부 뇌 경질에 창문을 통해 침투 손상의 도전 circumvents 조명과 큰 볼륨 조명, 대 한 수 있지만 몇 가지 피상적인 뇌 분야6만 사용할 수 있습니다.
대규모, 작은 직경 조명 (그림 1a)를 만들려면 플라스틱 광 섬유 열 테이퍼 이며 코어와 클 래 딩의 팁 에칭 (그림 1bc). 좁은 지점에 빛을 집중 하는 다른 테이퍼 섬유, 달리는 에칭 팁, 따라서, (그림 1의 de) 큰 영역 빛을 광범위 하 게 배포 하는 방법의 측면에 밖으로 균등 하 게 탈출 하는 빛을 수 있습니다. 때문에 침투 손상을 침투 직경에 비례,이 조명 기는 기존의 섬유 보다 더 침투 손상 아직 그것은 > 발광 표면 영역 및 제공 빛 더 광범위 하 게 1 x 100/100 빛 전원 뇌 팬텀 (1.75 %agarose)의 밀도 (그림 1e). 몬테 카를로 모델 (그림 1 층) 그들은 그들의 발광 표면으로 동등한 빛 전원 밀도가지고 기존의 섬유와 대용량 조명 빛 확산에 차이 보여 줍니다. 각 조명 기는 개별적으로 (그림 2a, b) 팁 (그림 2c) 따라도 빛을 분배를 보장 하기 위해 통합 영역을 사용 하 여 보정 됩니다.
이 큰 볼륨 조명 기는 optogenetic 조작 동작 및 비 인간 영장류에 신경 발포의 유효성이 검증 되었습니다. 어떤 뇌 영역을 각 동물의 개별 수용 필드 지도 섬유 팁 길이 사용자 지정할 수 있습니다. 조명 조명의 길이 걸쳐 있는 신경 녹음에 대 한 관통 전극와 쌍 수 있습니다. 또한, 섬유는 가시 광선의 색상을 가져올 수 있다, 때문에 그것은 사용할 수 사용 가능한 optogenetic 분자의와 결합 될 수 있습니다.
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참고: 모든 동물 절차 NIH 지침에 따라 했다 고 하 여 매사 추세 츠 연구소의 기술 위원회 동물 관리에 승인 했다.
1. 조명 제조
2. 조명 보정 및 품질 관리
참고: 교정에 대 한 이러한 방법을 평가 광 섬유의 끝에서 다른 거리에 비선형 출력. 고르지 못한 광 분포에서 일반적으로 결과 “ 울 퉁 불 퉁 ” 또는 “ 물결 모양 ” 테이퍼.
통합 영역을 사용 하 여 호 ( 그림 2)를 흡수 하는 빛의 상단에 대 한3. Vivo에서 조명
참고: 여기, 이러한 방법은 비 인간 영장류 보다는 플라스틱 모델을 사용 하 여 표시 됩니다.
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비 인간 영장류에서 큰 두뇌 볼륨의 조명 행동-관련 optogenetic 조작 가능합니다. 애 커 외. 레드 이동 Halorhodopsin, 턱 7 두 붉은 털 원숭이에 메모리 기반 saccades 정면 눈 분야 (들)의 임시 기여 공부 하 (2016) 사용이 큰 볼륨 조명 기. 특히, 들 신경 턱을 포함 하는 바이러스 성 벡터와 주입 되었고 대상 프레 젠 테이 션, 지연 기간 또는 메모리 기반 saccade 작업의 모터 준비 기간 동안 큰 볼륨 조명 기를 사용 하 여 붉은 빛으로 조명 8. 그림 3 은 실험 조건. (예를 들어, 적절 한 대상 위치로 saccades 메모리 기반 실행 실패) 오류 요금 크게 조명 주입된 받아들이는 필드에 대상에 대 한 하지만 하지 비활성화의 사이트에 반대는 목표에 대 한 증가 / 조명 (그...
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Optogenetic 도구는 널리 질병 및 설치류에서 생리학을 공부 하는 데 사용 됩니다, 하지만 계몽 큰 두뇌 볼륨의 기술적 도전 비 인간 영장류에서 optogenetics의 사용을 제한 했다. 아마도 작은 볼륨을 밝히는 큰 빛 전원 밀도 (~ 100 mW/m m2 ~ 20 W/m m2)를 사용 하는 원숭이 연구 개척 < 1 m m3, 그리고 피4, 흥분 성의 opsins 겸손 한 행동 효과 보고 9,,1011 과 우량한 colliculus12금지 opsin.
따라서, 대규모 조명 빛 배달 큰 조직 볼륨에 수 있도록 개발 되었다. 이 조명 기...
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LCA는 NDSEG 친교, NSF GRFP과 맥 거 번 연구소의 친구 로부터 자금을 인정 합니다. EP는 해리와 유 니스 Nohara UROP 기금, 1995 UROP 기금의 MIT 클래스와 MIT UROP 기금 자금 인정 합니다. ESB는 NIH 2R44NS070453-03A1, IET 하 비 수상 및 뉴욕 줄기 세포 재단-로버트 슨 상 자금 인정 합니다. RD는 NIH EY017292에서 자금을 인정 합니다. 마이클 윌리엄스는 정리 하 고 촬영 전에 공급 수집 팀을도 왔다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 플라스틱 광섬유 | 산업용 광섬유 | SK-10 | 250 미크론 직경, Super Eska 라인 |
| 와이어 스트리퍼 | Klein Tools | 11047 | 22 게이지 |
| 바이스 클램프 | Wilton | 11104 | 일반 테이블 마운트 바이스 클램프 |
| 이중 온도 히트 건 | Milwaukee | 8975-6 | 570 / 1,000 ° F |
| Lab marker | VWR | 52877 | |
| 해부 현미경 | VistaVision | 82027-156 | 실체 현미경 w/ 이중 백열등, 2X/4X 배율, VWR |
| Lab 테이프 | VWR | 89097-972 | 보라색 4팩 그러나, 테이프 색상은 중요하지 않습니다 |
| . 실리콘 카바이드 래핑 시트 | ThorLabs | LF5P | 5 마이크론 그릿, 10팩 |
| 알루미늄 산화물 래핑 시트 | ThorLabs | LF3P | 3 미크론 그릿, 10 팩 |
| 알루미늄 산화물 랩핑 시트 | ThorLabs | LF1P | 1 미크론 그릿, 10 팩 |
| 소성 알루미나 래핑 시트 | ThorLabs | LF03P | 0.3 미크론 그릿, 10 팩 |
| 핫 나이프 | 산업용 광섬유 | IF370012 | 60 와트, 헤비 듀티 |
| 섬유 검사 범위 | ThorLabs | FS201 | 옵션 |
| 스테인레스 스틸 페룰 | 정밀 광섬유 | MM-FER2003SS-265 | 265 미크론 내경 |
| 1 mL 주사기 | BD | 14-823-30 | Luer-lok 팁은 누출 위험을 줄이기 위해 바람직하지만 반드시 필요한 것은 아닙니다 |
| 플라스틱 에폭시 | 산업용 광섬유 | 40 0005 | |
| 18 게이지 무딘 바늘 | BD | 305180 | 1.5 인치 길이 |
| 린트없는 닦음 (KimWipe) | ThorLabs | KW32 | 많은 공급업체에서 사용 가능합니다 |
| 빛 흡수 호일 | ThorLabs | BKF12 | |
| 전기 테이프 | 3M | Temflex 1700 | 선택 사항, 다른 브랜드 / 모델을 대체할 수 있습니다 |
| 26 게이지 날카로운 바늘 | BD | 305111 | 0.5 인치 길이 |
| Micromanipulator | Siskiyou | 70750000E | 다른 브랜드/모델로 대체될 수 있습니다 |
| Steretactic arm | Kopf | 1460 | 다른 브랜드/모델로 대체될 수 있습니다 |
| 레이저 보안경 | KenTeK | KCM-6012 | 는 사용된 레이저의 색상에 따라 선택해야 합니다. 여기에 주어진 예시 |
| 레이저 또는 기타 광원 | vortran | Stradus 473-50 | 블루 레이저의 예 |
| 통합 구 | ThorLabs | S142C | 첨부 파워 미터, ThorLabs에서도 사용 가능, 항목 |
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| Blunt 집게 | FischerScientific | 08-875-8A | 일반 스테인리스 스틸 무딘 집게 |
| 디지털 캘리퍼스 | Neiko | 01407A | amazon.com 에서 사용할 수 있습니다. 보다 정확한 측정을 위해 더 미세한 해상도의 캘리퍼를 선택할 수 있습니다. |
| 패치 케이블 | ThorLabs | FG200LCC-custom | 이것은 가능한 많은 패치 케이블 중 하나의 예입니다. 광섬유 직경이 대용량 조명기의 광섬유 직경보다 작거나 같고 커넥터가 인터페이스하는 한, 모든 패치 케이블(유리 또는 플라스틱, 공급업체에서 구매 또는 실험실에서 제작)은 이 애플리케이션에 적합합니다. |
| 투명 플라스틱 더스트 캡 | ThorLabs | CAPF | 패키지 25 |
| 세라믹 분할 결합 슬리브 | Precision Fiber Products, Inc. | 에스엠-CS1140S |
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