폐 전이 분석 결과 사용 하 여 다리에 전이성 폐 식민지 공부에서 실용적인 고려 사항

Summary

이 기사의 목적은 폐 전이 분석 결과 (푸 마)에 대 한 프로토콜에 대 한 자세한 설명을 제공 하는 것입니다. 이 모델 widefield 형광 또는 confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 폐 조직에서 전이성 osteosarcoma (OS) 세포 성장 연구에 연구를 허용 합니다.

Abstract

폐 전이 분석 결과 (푸 마) 이며 폐 explant 비보 전 폐쇄 셀 문화 시스템 형광 현미경 검사 법에 의해 폐 식민 osteosarcoma (OS)에서 생물학을 공부 하는 연구원입니다. 이 문서는 프로토콜에 대 한 자세한 설명을 제공 하 고 전이성 성장 widefield 또는 공초점 형광 현미경 플랫폼을 사용 하 여 이미지 데이터를 얻는 예에 설명 합니다. 푸 마 모델의 유연성 허용 연구원 폐 microenvironment에서 운영 체제 셀의 성장 뿐만 아니라 공부 뿐만 아니라 시간이 지남에 안티 전이성 치료제의 효과 평가 합니다. Confocal 현미경 검사 법은 폐 실질과 OS 세포 상호 작용의 전례 없는, 고해상도 이미징에 대 한 수 있습니다. 또한, 푸 마 모델은 형광 염료 나 형광 단백질 유전자 기자와 함께, 연구팀은 폐 microenvironment, 세포 및 subcellular 구조, 유전자 기능 및 전이성 OS 셀에 발기인 활동 공부할 수 있습니다. 푸 마 모델 다리 연구자 새로운 전이 생물학 발견 하 고 새로운 안티 전이성, 타겟 요법의 활동을 평가에 대 한 새로운 도구를 제공 합니다.

Introduction

전이성 osteosarcoma (OS)와 소아 환자에 대 한 향상 된 결과 여전히 중요 한 충족된 임상 필요 ¹남아 있습니다. 이 새로운 분자로-타겟 요법 개발의 중요성을 밑줄. 대상 종양 세포 증식 하지 전이성 질병, 그리고 이렇게 새로운 전략을 치료에 효과가 입증 된 기존의 chemotherapeutics ²전이성 과정 자체를 타겟으로 해야 합니다. 현재 문서에서는 상대적으로 새로운 유형의 비보 전 폐 전이 모델, 폐 전이 분석 결과 (푸 마) 멘도사와 동료³, 새로운 발견에 유용한 도구를 제공 하 여 개발의 실용적인 측면을 설명 합니다. OS ^4,5에서 폐 전이 진행에서 분자 드라이버. 그러나 계속 하기 전에, 그것은 간단히, 전이의 몇 가지 현재 모델에 따라 터치 것 하 고 어떻게 푸 마 모델은 기존의 시험관에 비해 여러 이점을 제공 분석 실험.

전이 공부 하는 데 사용 하는 가장 실험적인 모델 특정 단계 또는 전이성 캐스케이드의 여러 단계를 정리 하는 생체 외에서 그리고 vivo에서 시스템의 구성. 이러한 단계를 포함: 1) 종양 세포 주변 혈관 (혈액 또는 임 파 액) 및 교통 순환, 내 기본 종양, 2) intravasation에서 마이그레이션 3) 보조 사이트, 4) 넘쳐 흐름 및 보조 사이트, 5) 형성에 생존에서 체포 micrometastases, 및 6)의 vascularized 전이 (그림 1)로 성장. 전이의 생체 외에서 모델 2 차원 (2D) 마이그레이션을 포함할 수 있으며 3 차원 (3D) Matrigel 침공 분석 실험에서 검토는 자세히 다른 곳 ⁶. Vivo에서 모델에 대 한 두 가지 일반적으로 사용 되 모델 시스템 포함: 1) 자발적 전이 모델 은 종양 세포가 저절로 전이성 세포 나 지방 종양을 형성 하는 특정 조직 유형으로 주입 하는 orthotopically 먼 사이트; 2) 실험 전이 모델 은 종양 세포는 혈관 상류의 대상 기관에 주사 된다. 예를 들어 한 꼬리 정 맥 주입의 종양 세포 개발 폐 전이^5,,78. 다른 실험적인 전이 모델 비장 또는 간 전이^9,10의 개발에 결과 mesenteric 정 맥으로 종양 세포의 주입을 포함 됩니다. 이러한 비보에 모델의 실용적인 고려 사항 웰 치 ¹¹자세히 설명 되어 있습니다. 또 다른 vivo 모델 소아 sarcomas에 전이 공부 하는 데 사용 로컬 종양 형성 및 자연 스러운 전이 폐 ^12,13에 귀착되는 신장 신장 subcapsular 종양 이식 모델이입니다. Intravital videomicroscopy 수 같은 더 기술적으로 까다로운 기술을 직접 시각화에 전이성 암 세포와 전이성 사이트의 microvasculature 간의 실시간, 상호 작용 (예. 폐 또는 간) 맥도날드^{14에 의해 설명 된 대로} 및 Entenberg¹⁵또는 김 ¹⁶에 의해 설명 된 대로 chorioallantoic 막에 암 셀 넘쳐 흐름.

푸 마 모델은 폐 조직 explant 비보, ex , 닫힌된 문화 시스템 어디 형광 종양 세포의 성장을 관찰 될 수 있다 경도 형광 현미경 검사 법을 통해 한 달의 기간 동안 ( 그림 2A참조). 이 모델이 전이성 캐스케이드에서 폐 식민 (3 ~ 5 단계)의 초기 단계. 기존의 체 외에 모델을 통해 푸 마 모델의 주요 장점은: 1)에 경도 측정 폐 microenvironment 의 많은 기능을 유지 하는 3D microenvironment에 전이성 암 세포 성장 하는 기회 제공 vivo ³; 2) 푸 마 수 후보 유전자 또는 약물 치료의 최저 3D 폐 microenvironment;의 맥락에서 안티 전이성 활동을가지고 있는지를 평가 하는 연구원 3) 푸 마 모델은 유연한 형광 현미경 검사 법 (그림 2B)와 같은 플랫폼 widefield 형광 현미경 검사 법 또는 레이저 스캔 confocal 현미경 검사 법의 많은 유형으로, 각각의 예제 그림 2C & D에 표시 됩니다. 각각. 이 문서는 푸 마 모델의 향상 된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 전이성 성장에 경도 이미징 데이터를 얻기 위해 사용 하는 방법을 설명 합니다-표현, 인간의 높고 낮은 전이성 다리 셀 (MNNG와 호 셀, 각각)를 사용 하 여 낮은 확대 widefield의 형광 형광 성 염료는 폐 실질, 레이블 및 레이블 운영 체제에서 미토 콘 드리 아 유전자 기자 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 사용 하는 푸 마 모델에 셀 레드-형광 단백질 이미징의 예 또한 토론 된다.

Protocol

영상 데이터를 가져온 모든 동물 프로토콜 승인 동물 관리 및 사용 위원회 국립 암 연구소, 국립 보건원의 수행 했다. 모든 동물 프로토콜 설명 및 비디오 문서에서 브리티시 컬럼비아의 대학 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고.

1. 종양 세포 주입 및 푸 마 모델에 대 한 자료 준비

참고: 솔루션 및 셀의 양을 1 마우스에 대 한 충분 한 될 것입니다. 더 많은 생쥐 연구에 사용 되는 경우 필요에 따라 규모. 미디어 요리법을 표 1 과 표 2를 참조 하십시오.

1. 전 37 ^oC 물 욕조에 15 mL 원뿔 튜브에 A-미디어의 5 mL 따뜻한.
2. 1.2% 낮은 녹는 agarose 솔루션을 (살 균 물)에 연구소 전자 레인지를 사용 하 여 녹 인 다.
3. 15 mL 원뿔 튜브에 녹은 agarose의 5 mL을 전송 하 고 37 ^oC 물 욕조에 따뜻한 유지. 37 ^oC 및 폐 insufflation 단계 전에 액체에서 녹은 agarose가 확인 합니다.
4. 미리 30 mL 세포 배양 학년 얼음 양동이에 1 X 펜/strep 보충 PBS의 진정.
5. 6 잘 플레이트의 한 잘, 미리 B-미디어의 1.5 mL에 젤라틴 스폰지를 적시 게. 스펀지 폐 조각에 대 한 지원 앵커 것입니다.
6. OS 셀은 약 70-90% 보장 절차의 날에 confluent. -합칠 경우 또는 미디어 오렌지 노란색 셀은 일반적으로 스트레스와 시점에서 생존 능력을 감소는 때문에 셀을 사용 하지 마십시오. 다리 셀 라인, MNNG와 호, 100 μ의 볼륨에서 5 x 10⁵ 1 마우스의 꼬리 정 맥에 주사에 사용 됩니다. 더 많은 생쥐 연구에 사용 하는 경우 그에 따라 고급.
7. 0.25 %trypsin-EDTA (3 mL T75 플라스 크 또는 10 cm 배양 접시에 2 mL)을 사용 하 여 종양 세포를 수확. 셀은 시작 하면 접시에서 해제, 완벽 한 미디어 트립 신-EDTA를 중화. 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 세포 배양 학년 PBS로 한 번 씻어. PBS의 5 mL에 펠 릿을 resuspend.
8. 표준 방법으로 세포 수를 수행 합니다. 그것은 최고의 세포 현 탁 액의 손실을 자주 바늘 그리기 중 발생 이후 주입 시도 실패 실제로 필요한 것 보다 더 많은 세포 현 탁 액을 확인 하는.
9. Trypan 블루 제외 분석 결과 세포의 생존 능력을 평가 하기 위해 세포 현 탁 액의 샘플에 수행 합니다. 셀 표시 90% 생존 하는 경우에 진행 또는 더 높은.
10. 5 x 10⁵ 셀 100 μ의 볼륨을 주입. 준비 하려면이 금액의 2 배를 초과, 1 x 10⁶ 셀 한다 스핀 다운 되며 HBSS 0.2 mL에 resuspended.
11. 주입을 위한 쥐를 준비 하는 동안 얼음 양동이에 세포 현 탁 액을 놓습니다.

2. 꼬리 정 맥 주입 및 폐 Insufflation

참고: 솔루션 및이이 섹션에 있는 셀 1 마우스에 대 한 충분 한 될 것입니다. 더 많은 생쥐 연구에 사용 되는 경우 필요에 따라 규모. 장비, 자료 및 다음 단계에서 사용 되는 수술 도구 목록에 대 한 표 3 및 표 4를 참조 하십시오.

1. 더 눈에 띄게 명백한 그들의 꼬리 정 맥을 만들기 위하여 여성 마우스 (나이 6-8 주) 5 분 동안 열 램프 아래 따뜻한. Murine K7M2 또는 K12 셀 사용 Balb/c 마우스; 인간의 MG63.3, MG63, MNNG, 및 호 셀에 대 한 심한 결합 된 면역 결핍 쥐를 사용 합니다.
2. 셀 서 스 펜 션은 부드럽게 튜브를 떨고 하 여 균일 한 다는 것을 확인 하십시오. 신중 하 게 바늘 없이 1 mL 주사기로 세포 현 탁 액을 그립니다. 모자는 27와 주사기 바늘 게이지. 바늘 베벨은 바늘에 볼륨 표시와 같은 측면에 다는 것을 확인 하십시오.
3. Restrainer에 마우스를 놓고 면봉 알코올 지우기와 꼬리.
4. 꼬리 정 맥 주사를 수행 하 고 셀 서 스 펜 션의 100 μ 주사를 진행 합니다. 주입 후 5 분 CO₂ 챔버에 마우스 놓고 (기관 동물 관리 위원회 개요)으로 안락사 표준 운영 절차를 시작 합니다. 자 궁 경부 전위 이후 절차는 기관 손상 됩니다 안락사의 수단으로 사용할 수 없습니다.
5. 일단 마우스를 안락사 insufflation agarose/A-미디어 솔루션 마우스 폐의 층 류 후드의 준비를 시작 합니다. 층 류 흐름 후드 내에서 살 균 패드와 함께 작업 영역을 설정 합니다. 이 패드에 소독된 기기, 4 카 테 터, IV 확장 세트, 및 중력 관류 장치 ( 보충 그림 1참조)를 넣을 것입니다.
6. 지 recumbancy에 마우스를 놓습니다. 메 마른 작은 위, 신중 하 게 흉 폭로 흉 골 밖으로 해 부. Agarose/A-미디어 솔루션 폐를 insufflate 하는 데 사용 될 것입니다 폐를 찌를 하지 주의 하십시오.
7. 때 흉 골 밖으로 해 부 해 부 양쪽에 흉부 입구 과거 기도. 멀리 주변 부드러운 조직 해 부에 의해 기도 노출 합니다.
8. 20 게이지 4 카 테 터와 기관지 cannulate 느슨하게 cannulated 기관지 주위 살 균 다 봉합 사를 사용 하 여 수술 매듭 넥타이.
9. Catheterized 기도에서 중력 관류 장치의 10 mL 주사기로 설정 4 확장을 연결 합니다.
10. 1:1 혼합물으로 미리 데워 진된 37 ^oC agarose (5 mL) 및 A-미디어 (5 mL)을 결합. 중력 관류 장치의 10 mL 주사기로 액체 agarose/A-미디어 솔루션을 붓는 다. Insufflation agarose/A-미디어 솔루션으로 폐의, 이전 확장 집합의 전체 길이 agarose/A-미디어, 공기와 함께 폐 샘플의 실수로 insufflation 함으로써 negating와 준비 되어 있는지 확인 합니다.
11. 폐는 완전히 insufflated 때까지 폐 agarose/A-미디어 솔루션을 작성 합니다.
12. 일단 폐 insufflated 완벽 하 게는 정을 제거 하 고 기도 통해 agarase/A-미디어 솔루션의 누설을 방지 하기 위해 수술 매듭을 단단히 묶어.
13. 가슴 구멍에서 당기기 (기관, 심장, 폐)에 밖으로 부를 진행 합니다. 빵 꾸 하지 주의 또는 폐의 표면 손상.
14. 장소 미리 냉장된 30 mL PBS의에서 (아니 특정 방향)에서 뽑은 1 X 펜/strep, 보충 하 고 20 분을 강화 하기 위해 agarose/A 미디어 허용.
15. 좋은 위, 핀셋, 그림 1A와 같이 폐 (3 m m x 1.5 m m)의 작은 조각을 잘라 사용 합니다. 작은 폐 조각은 수 수 쉽게 몇 군데 2.5 X 목표를 사용 하 여. 여러 조각은 실험 조건, 당 그룹 당 4-10 조각 일반적으로 자를 수 있습니다.
    참고: 각 실험 그룹에 대 한 미리 B 미디어에 배어 2 x 2 cm 젤라틴 스폰지를 포함 된 별도 우물 (6 잘 플레이트)으로 폐 조각 놓습니다. 잘 당 미디어의 양을 1.5 mL 이어야 한다. 2-3 일 마다 미디어를 변경 합니다. 약물 연구에 대 한 미디어/약물 변화의 주파수 결정 하는 사용자입니다.

3. Widefield 형광 이미징 폐 슬라이스 및 분석의

참고: widefield 형광에 대 한 이미징, 작은 조각 폐 섹션 2.5 X 목표를 사용 하 여 1 이미지에 맞추기 위해 (1.5 m m x 1 m m x 3)를 절단 됩니다.

Widefield 형광 현미경에서 이미지 수집:

1. 폐 슬라이스는 일반적으로 0, 3, 7, 14 일 후 주입에서 몇 군데. 생물 캐비닛의 메 마른 환경에서 신중 하 게 폐 분할 영역 전송에서 젤라틴 스폰지 살 균 35 m m 유리 하단에 라운드 접시. 폐 조각에서 초과 하는 액체에서 소량으로 초과 하는 액체는 거울으로 서 행동 하 고 종양 세포에서 나오는 형광 빛을 반영 하는 것을 주의.
2. 그림 1A에서 묘사 된 비슷한 방식으로 폐 분할 영역을 정렬. 각 열은 다른 실험 상태를 나타내는 것 이다. 교차-오염 하지 폐는 핀셋으로 알아서. 70% 에탄올과 린스를 폐 다른 실험적인 그룹에서 분할 영역을 처리 하기 전에 건조 합니다.
3. 이미지 매개 변수를 최적화 (즉. 이득, 오프셋, 노출 시간, binning) 형광 종양 세포와 배경 폐 조직 제어 (치료 되지 않는 차량)에 사이 좋은 대조를 제공 하 그룹. 컨트롤 그룹에서 동일한 매개 변수를 사용 하 여 실험적인 그룹 이미지. Tiff 이미지 형식으로 저장 합니다.
4. 에 대 한 규모, 동일한 목표에는 마이크로미터의 디지털 사진을 찍을.
5. 이후 폐 자동 형광 시간이 지남에 따라, 이미징 매개 변수 해야 합니다 조정 제어 폐 각 이미징 세션. 한 세션에 대 한 이미징 매개 변수 않을 수 있습니다 반드시 최적의 후속 이미징 세션에 대 한.

이미지 분석:
참고: 다음 이미지 처리 단계 ImageJ 1.51 h 소프트웨어 패키지 ¹⁷할 수 있습니다.

1. ImageJ (그림 3A)에서 이미지 파일을 엽니다.
2. 배경 빼기: 과정 > 배경 빼기 > 롤링 볼 반경 50 픽셀 (시작), 선택을 취소 "빛 배경" (그림 3B).
3. 8 비트 형식으로 이미지 변환: 이미지 > 형식 > 8-비트 (그림 3C).
4. 단위를 픽셀로 설정: 이미지 > Enter "픽셀" 단위의 길이에 "픽셀 너비", "픽셀 높이", "복 깊이"에 1을 입력. "Global" 확인란을 다음 이미지에 적용 합니다.
5. 다각형 선택 도구를 사용 하 여 전체 폐 조각의 윤곽 고 총 폐 조각의 영역 (픽셀²)을 결정 합니다. 이 값은 폐의 백분율 종양 부담을 계산 하기 위해 사용 됩니다.
6. 임계값 이미지: 이미지 > 조정 > 임계값 > "기본" 및 "B & W" 강조 > 종양 세포의 대부분은 정확 하 게 강조 표시 되도록 임계값 이미지 슬라이더를 사용. 폐는 모든 검정, 및 형광 성 병 변은 흰색 흑인과 백인 이미지를 귀 착될 것 이다 "적용"을 누르면 (그림 3D). 두 번째 시간 "적용"을 누르면 모든 형광 구조는 지금 검은 모양 (그림 3E) 이미지를 반전 됩니다.
7. 병 변의 모양과 수의 정량화:
   분석 > 측정 설정 > "지역"를 확인 하십시오. 다른 모든 상자를 선택 취소 합니다.
   입자 분석 > 크기 (픽셀²): 0-무한 ImageJ 열거 하는 도형 범위를 나타냅니다. 경험적으로 하루 0 차량 이미지에는 단일 종양 셀 것으로 판단 되는 작은 병 변을 확인 합니다. 하한값으로이 단일 종양 세포의 영역을 사용 하 여 데이터 집합에는 나머지 이미지에 대 한. 이 문서에 소개 된 작품에 대 한 11 픽셀² 하한값으로 설정 됩니다. 비디오 예제에 제시 하는 작품에 대 한 24 픽셀² 하한값으로 설정 됩니다. "순환" 범위를 0-1로 둡니다. "표시"로 설정할 수 있습니다 "아무것도". 또는, "표시" 및 "설명"을 선택 하는 경우 모든 개요 도형 드로잉 생성 됩니다. 팝업 측정의 별도 창에 대 한 "표시 결과"를 확인 합니다. 필요한 경우, "관리자 추가" 상자를 체크 하는 데 나중에 참조할 저장 될 수 있다 투자 수익 관리자를 측정할 모든 셰이프 저장 됩니다. 확인을 누른 후 "결과" 창 포함 하는 모든 열거 모양 및 면적 측정 (그림 3 층) 나타납니다.
8. 복사 하는 스프레드시트에 "결과" 창에서 데이터를 붙여 넣습니다. Excel에서 SUM 수학 함수를 사용 하 여 해당 특정 폐 슬라이스에 대 한 전이성 병 변의 모든 분야를 요약. 폐 조각의 백분율 폐 종양 부담 평가, 폐 조각의 전체 면적에 의해 전이성 병 변의 영역의 합계를 나눕니다. 이 매개 변수는 일컬어 지역 일부 (_A)는 언더우드 ¹⁸여 더.
   폐 종양 부담 = 폐 슬라이스의 전이성 병 변 지역/총 면적의 합
9. 제어 그룹 및 그룹 남은 폐 섹션의 나머지 부분에 대 한 폐 종양 부담을 계산 합니다. 0, 3, 7, 14 일 동안 그룹당 평균 폐 종양 부담을 플롯 합니다. 진보적인 시간 포인트에서 푸 마 모델에 성장 및 로우 전이성 인간 OS 셀의 대표 widefield 형광 사진 (그림 4A) 표시 됩니다. 시간이 지남에 따라 백분율 전이성 종양 부담에 배 변경 (0으로 정규화)을 보여주는 선 그래프 (그림 4B) 표시 됩니다.

4. 푸 마 모델의 confocal 형광 이미징

참고: confocal 이미징, 조직 처리가 비슷합니다 그 이전 섹션에서 제외 하 고는 큰 폐 슬라이스 이미지 수를 더 ROIs 있도록 (완전 한 횡 근 섹션, 1-2 m m 두께) 잘립니다.

DAR4M와 폐 실질의 라벨:

1. 폐 조각 10 μμM에서 DAR4M (HBSS)에서 37 ° c.에 45 분 동안 담가 DAR4M 라벨 폐의 세포 내에서 반응성 질소 종.
2. 외피의 45 분, 후 폐 조각 신선한 HBSS로 린스.
3. 요리, 그리고 confocal 현미경 이미지 라운드 35 m m 유리 하단에 폐 슬라이스를 놓습니다.
4. 그림 5 에 표시 된 예제에서는 이미지에 대 한 이미징 매개 변수는 표 5에 나열 됩니다.
5. 관심 영역에 대 한 Z-스택 취득. 나이 키스 트 샘플링에 대 한 제안된 Z 슬라이스 두께 사용 합니다. 3D 스택 DAR4M 표시 된 폐 조직에서 녹색 형광 OS 셀을 보여주는 대표 영화 영화 1 과 보충 영화 1에 제공 됩니다.

그림 5에 표시 된 예제에서는 confocal 이미지 이미징 세션 터미널 이었다. 경도 화상 진 찰이 필요한 경우 2 광자 또는 다 광자 갖춘된 confocal LSM 현미경 이미징의 사용 때문에 생활에 더 적은 photodamage 좋습니다 조직^19,20.
푸 마 모델에서 미토 RFP 표현 MG63 세포 이미징:

1. 1 단계와 2 미토 RFP 구조를 표현 하는 MG63 세포를 사용 하 여 윤곽선으로 푸 마 프로토콜을 수행 합니다.
2. 요리, 그리고 confocal 현미경 이미지 라운드 35 m m 유리 하단에 폐 슬라이스를 놓습니다.
3. 그림 6 에 표시 된 예제에서는 이미지에 대 한 이미징 매개 변수는 표 6에 나열 됩니다. 영화 2 에 추가 영화 2형광 미토 콘 드리 아를 제공 하는 빨간색과 녹색 형광 OS 셀을 보여주는 3 차원 스택의 대표적인 영화.

Results

낮은 확대 widefield 형광 현미경 검사 법

푸 마 폐 조각의 widefield 형광 현미경, 대표 이미지와 부 량 데이터 그림 2C및 그림 4A 와 B에 표시 됩니다. 높고 낮은 전이성 세포 라인에 대 한 전이성 경향은 시각적으로 명백한 진보적인 시간 포인트. 호 셀 전혀 성장할 수 없다 반면 MNNG 세포 폐 조직 식민지 화 효율적으로 수 있습니다. 이미지 분석, 그림 4B의 그래프와 같이 시간이 지남에 성장 평가를 양적 데이터를 얻을 수 있습니다. 낮은 확대율 (2.5 X)에서 획득 한 이미지에 전체 폐 슬라이스를 캡처...

Discussion

다음 기술 문서에서는 운영 체제에서 폐 식민지 공부에서 푸 마 모델의 몇 가지 실용적인 측면을 설명 합니다. 어디 연구 해야 합니다 여분의 처리 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계는 다음과 같습니다.

a) cannulation 기도 의입니다. 기도 주변 근육 및 결합 조직 해 부 동안 쉽게 손상 될 수 있습니다. 또한, 카 테 터의 바늘 기도 통해 쉽게 밀어 수 있습니다. 바늘의 경사는 캐 뉼 러를 삽입 하는 경우 기도 입력 하는 방법에 세심 한 관심을 지불 합니다.

b) puncturing 또는 폐의 표면에 손상을 입히기. 폐는 쉽게 구멍이 나 흉 골을 제거 하 고 흉 노출 동안가 위를 해 부 손상 될 수 있습니다. 가슴 구멍에서 당기기에 밖으로 해 부 할 때 주의 해야 합니다. Puncturing 또는 폐의 표면에 손상을 입히기를 발생 합니다 미디어 밖으로 누출 agarose/A는-액체는 폐의 공기를 빼는 것입니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
표 2
A-media, B-media, and complete media용 세포 배양 시약
MNNG-HOS	ATCC	CRL-1547	고전이성 OS 세포주
HOS	ATCC	CRL-1543	전이가 심한 OS 세포주
MG63.3	Amy LeBlanc Laboratory(NCI)	N/A	고전이성 OS 세포주
MG63	ATCC	CRL-1427	전이가 잘 되지 않는 OS 세포주
10X M199 배지	Thermofisher	11825015	A-배지 및 B-배지용 기본 배지
증류수(멸균)	Thermofisher	15230-147	A-배지 및 A-배지의 구성 요소 & B-미디어
7.5% 중탄산나트륨 용액	Thermofisher	25080094	A-미디어 구성 요소 & B 매체
Hydrocortizone	시그마 Alrich	H6909	A 매체의 분대 & B-미디어
레티놀 아세테이트-수용성	시그마-알리치	R0635-5MG	A-미디어 구성 요소 & B-배지
페니실린/스트렙토마이신 10X 농축(10000 U/ml) 용액	Thermofisher	15140122	A-배지 및 성분 B-미디어, 완전한 미디어.
둔감한 인슐린 해결책 (10mg/ml)	Sigma-Alrich	I0516-5ML	성분 & B-media
DMEM, 고포도	Thermofisher	11965092	Complete Media
L-Glutamine (200 mM)	Thermofisher	25030081	Complete Media
Fetal bovine Serum	Thermofisher	16000044	Complete Media
Dulbecco' 구성 요소 s Phosphate Buffered Saline	Thermofisher	14190144	세포 배양에 사용됩니다.
행크' s 완충염 용액, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드	Thermofisher	14175095	전 세포 펠릿을 재현탁하는 데 사용됩니다
			.
DAR4M	Enzo	ALX-620-069-M001	폐 실질을 표시하는 데 사용됩니다.
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Table 3
Materials for PuMA
Zeiss 710 Confocal	LSM Zeiss	N/A	Upright LSM Confocal 현미경
Zeiss 780 컨포칼 LSM	Zeiss	N/A	도립 LSM 컨포칼 현미경
SCID 마우스	Charles River	N/A	NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, 여성, 6-8주
GelFoam	Harvard Apparatus	59-9863	폐 조직 절편을 지지하는 데 사용됩니다.
SeaPlaque Agarose	Lonza	50100	폐 팽창 중에 사용됩니다.
27 게이지 바늘이 있는 1ml 주사기	Fisherscientific	14-826-87	꼬리 정맥 주사에 사용됩니다.
10ml 주사기	BD	309604	폐의 흡입에 사용됩니다.
20 게이지 카테터	Terumo	SR-OX2032CA	폐의 흡입 중에 사용됩니다.
Abbott IV 확장 세트(30", 멸균)	Medisca	8342	폐 흡입 시 사용.
알코올 면봉	BD	326895	주사 전 꼬리 정맥 닦기 무
균 수술 장갑	Fisherscientific	크기에 따라 다름	마우스 폐의 셉틱 핸드링
30cm 눈금자	스테이플		폐의 흡입에 사용됩니다.
ruler Pipette.com HS29022A 대한 지지대			폐의 흡입에 사용됩니다.
35mm 유리 바닥 배양 접시	Ibidi	81158	폐 슬라이스 이미징 시 사용
방수 수분 장벽이 있는 흡수성 언더패드	VWR	56617-014	생물학적 후드의 멸균 작업 영역을 라이닝하는 데 사용됩니다.
Catgut Plain Absorbable Suture	Braun	N/A	캐뉼레이트 기관을 묶는 데 사용됩니다.
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Table 4
Surgical instrument for PuMA
Micro Dissecting Scissors 3.5" 스트레이트 샤프/샤프	Roboz	RS-5910	폐 단면 절단용
4" (10cm) 긴 톱니 모양 직선 매우 섬세한 0.5mm 팁	Roboz	RS-5132	폐 단면을 조작/유지하기 위해.
4인치 (10cm) 긴 톱니 모양의 약간의 곡선 0.8mm 팁	Roboz	RS5135	폐 단면을 조작/유지하기 위해.
엄지 드레싱 겸자; 톱니 모양의; 민감한; 4.5" 길이; 1.3mm 팁 너비	Roboz	RS-8120	일반 해부용.
엄지 드레싱 집게 4.5" 톱니 모양 2.2mm 팁 너비	Roboz	RS-8100	일반 해부용.
초미세 마이크로 해부 가위 3.5" 스트레이트 샤프/샤프, 20mm 블레이드	Roboz	RS-5880	일반 해부용.
냅 가위; 곧장; 날카롭고 무딘; 27mm 블레이드 길이; 4" 전체 길이	Roboz	RS-5960	일반 해부용.