제조 및 통합된 전극 Transendothelial 전기 저항을 직접 측정 하는 기관-온-칩 시스템의 유효성 검사

장기에 칩 빠르게 새로운 급부상 하 고 유망한 생체 외에서 의 클래스 조직 모델. ¹ 이러한 모델에서 셀 교양 그들은 그 세포의 생리 적인 microenvironment을 모방 하는 방식으로 설계 하는 미세 장치 내부. ^{1 , 2} 결과 그 셀의 현실적 생리 적 또는 병 적인 동작 보다 기존의 생체 외에서 모델의 단순한 설계 및 기본적인 기능에서 예상 될 수 있다. ^{3 , 5 , 6} 또한, 장기에 칩 비보에 모델 보다 더 나은 제어 환경을 제공 하 고 인간의 생리와 병 리를 충실 하 게 복제 인간의 기원에서 모두 건강 하 고 병에 걸린 조직을 통합할 수 있습니다. 칩 (BBBs에 칩)에 혈액-뇌 장벽을 개발에 최근 요약된 발전 분야는 신속 하 게 이동 앞으로 보여줍니다. ⁷

장기에 칩의 또 다른 장점은 조직 현미경 검사 법, 온라인 생 화 확 적인 분석 그리고 통합된 센서 장치 내부에 교양의 실시간 연속 모니터링 수 있다는. ^{1 , 2} 예, 비 접촉 개발 모니터링을 위한 강력한 방법 이다 transendothelial 또는 transepithelial 전기 저항 (TEER) 측정 및 장벽 형성의 조직. ^{8 , 9 , 10} TEER 전기 저항 세포 장벽을 가로질러 이며 따라서 장벽 무결성 및 침투성을 나타내는 있습니다. ¹⁰ 장기에 칩, 세포 장벽 일반적으로 교양 두 대표는 꼭대기 유체 채널 및 그 장벽 조직의 basolateral 구획을 구분 하는 막에. 이러한 칩 TEER 측정 후미와 2 채널의 콘센트에 삽입 된 전극으로 편리 하 게 수행할 수 있습니다. ^{3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 그러나 15} , 수동 삽입 및 전극의 재 투입 될 수 있습니다 쉽게 배치 오류에 따라서 예를 들면 으로 측정 된 저항 변화에 microchannels 통해 긴 또는 짧은 경로 저항 차이 중요 한에 비해 셀 장벽 저항. ¹⁶ reinsertion 오류를 제거 하려면 통합된 전극 장치 제안 되었습니다. 그러나,이 통합 된 전극의 대부분 조직 문화^{17,,1819,20,21} 을 검사 하는 경우는 보기 차단 및 필요 전문 클린 룸 제작에 대 한 처리합니다. ^{17 , 22}

이전 간행물,¹⁶ 에 처음 적용 하는이 책에서 설명한 장기-온-칩 장치 측정된 셀 레이어 및 쉬운 제작에 시정 통합된 전극의 안정성을 결합 합니다. 설계 및이 칩의 제조는 그림 1에 묘사 된다. 즉,이 장치 부품 이루어져 있다 2입니다 (PDMS) 함께 결합 채널 인쇄물과 0.4와 폴 리 카보 네이트 막으로 누설 무료 µ m 모 공 사이. 4 개의 백 금 철사 전극 삽입 되 고는 photocurable와 함께 제자리에 고정 문화 영역 외부에 잘 접착. 모든 제작 단계 일반 실험실 장비, 클린 룸 환경에 대 한 필요 없이 수행할 수 있습니다. 또한, 6 임피던스 측정을 수행할 수 있습니다 microchannels 횡단면을 고의 영향을 최소화의 저항의 독립적인 측정된 TEER의 직접 격리 하므로 이러한 4 개의 전극를 사용 하 여 (재) 삽입 오류와 같은 시스템에서 비 생물 유사. ¹⁶

이 장치와 직접 TEER 측정의 적용을 보여, 혈액-뇌 장벽 (BBB)이이 칩에서 복제 되었다. 이 생물 학적 장벽이 전문된 내 피 세포의 구성 되어 있으며 혈액과 뇌 항상성 제공 하는 뇌 간의 전송 규제. ^{23 , 24} BBB 모방, 미세 소자의 맨 위 채널은 줄지어 (친절 하 게 제공 박사 P. o. hCMEC/D3 셀 라인에서 인간의 대뇌 microvascular 내 피 세포 Couraud, INSERM, 파리, 프랑스). ^{그러나 25} 제시 방법은,, 더 일반적으로 두 개의 구획 어떤 기관-온-칩을 적용, 직접 TEER 결정을 쉽게 사용 하 여 활성화 통합 전극.

이 원고에서 먼저 통합된 전극 가진 기관-온-칩 소자의 제조 과정은 설명 되어 있습니다. 온 칩 TEER 측정 뿐만 아니라 다음, 시드 절차와 장치 내부에 뇌 내 피 세포의 문화 설명 된다. 결과 섹션에서 대표 TEER 측정 표시 하 고 데이터 처리를 명확히. 마지막으로,는 BBB-온-칩, 3 일 동안 모니터링의 장벽 기능 제공 됩니다, 표시 장치 및 TEER 모니터링 하는 방법의 적용을 보여주는.

1. 기관-온-칩 소자의 제조

1. 채널 디자인, 표준 포토 리소 그래피 기술을 사용 하 여 조작 형의 PDMS 복제를 확인 하 고 미세 칩의 PDMS 부분을 얻을.
   1. 무게 약 27 g PDMS 기본 에이전트 및 2.7 g 경화제; 대량 비율 10: 1을 해야 합니다. 이것은 3 m m 두꺼운 PDMS 슬 래 브 형 130 m m (5 인치) 직경에 대 한 좋은입니다. 이러한 구성 요소를 철저 하 게 혼합.
   2. 기포를 제거 하는 약 45 분 동안 desiccator에 섞어 드.
   3. 한편, 금형 주위에 명확한 테이프 여 액체 PDMS 혼합물에 대 한 금형을 준비 하거나 금형에 적합 한 웨이퍼 홀더.
   4. 금형에 degassed PDMS 혼합물을 붓는 다. 만약 거품이 남아 PDMS 혼합물 또는 금형 표면에 공기 드 그것은 다시 약 30 분에 대 한
   5. 오븐 4 헤를 허용에 대 한 60 ° C에서 PDMS 혼합물을 치료.
   6. 교류 후드에서 형에서 치료 PDMS를 당겨, 금형 더 PDMS 복제본을 즉시 다시 사용할 수 있습니다.
   7. 별도 상단 및 하단 칩 부품은 PDMS에 절단 라인을 사용 하 여 잘라 PDMS 복제.
   8. 양식 인 레트와 출구를 1 m m 직경을 가진 날카로운 생 검 펀치를 사용 하 여 상단 부분에 4 개의 구멍을 펀치. 내부에서 펀치를 칩에 수집에서 PDMS 파편을 방지 하기 위해 외부. 먼지에 대하여 그들을 보호 하기 위해 명확한 테이프와 칩 부분을 커버.
   9. Transwell 삽입에서 폴 리카 보 네이트 막 약 3 × 3 m m의 사각형으로 잘라 ².
2. 다공성 막 2 층 장치를 조립 하기 위해서는 두 PDMS 부분 사이 누설 없는 인터페이스는 다공성 막으로 어셈블.
   참고:이 프로토콜은 Griep 외에서 적응. ¹⁹ 그리고 Chueh 외. ²⁶
   1. 준비 PDMS/톨루엔 박격포 PDMS 기본 에이전트, 경화제의 0.07 g과 톨루엔의 540 µ L의 0.7 g을 사용 하 여 결과 5:3 무게 비율에. 소용돌이 박격포 철저 하 게.
   2. 60 1500 rpm에서 유리 coverslip에 박격포의 스핀 코트 200 µ L s (1000 rpm/s에서 ramped) 박격포의 얇은, 유니폼 레이어를 얻으려고.
   3. 하단 부분 그리고 잉크 롤러 칩의 상단 부분에 coverslip에서 박격포의 얇은 층을 전송합니다. 맨 아래 부분 오븐 안전 접시에 넣어.
   4. 핀셋, 집합으로 스핀 코팅 박격포에 막의 가장자리와 하단 부분에 중간에 신중 하 게 배치
   5. 신중 하 게 배치 상단 부분 아래쪽에 정렬에 신경을 쓰는 동안.
      참고: 칩에 압력을가 하지 마십시오 그리고 박격포는 채널을 입력 하 고 막 막힘을 방지 하기 위해 아래 부분 상단 부분을 슬라이드 할.
   6. 명확한 테이프 칩 입력에서 먼지를 방지 하 고 60 ° C 3 h.에서 그들을 구워와 칩 후미를 커버
3. 전극 측 채널로 통합.
   참고:이 프로토콜은 Griep 외에서 적응. ¹⁹와 Douville 외. ¹⁸
   1. 30 분 린스 물과 에탄올에 아세톤에 그들을 잠수 하 여 조각의 약 2 cm. 클린으로 백 금 철사를 잘라 건조 허용.
   2. 교류 후드, 플라스틱 접시에 칩을 넣어. 핀셋의 쌍을 사용 하 여 칩의 전극 채널에 4 개의 백 금 철사를 삽입 하 고 단계에서 접시에 고정 수 있도록 플라스틱 접시에 그들을 구 부. T-모양의 채널 접합 과거 문화 채널에 m m 0.7-1 전선 삽입.
   3. 전극 채널 입구에서 UV 경화 접착제의 방울을 적용 하 고 모 세관 힘에 의해 전극 주위 채널을 채우기 위해 접착제 허용.
   4. 전극 채널의 끝에 도달 하면 자외선 치료 접착제에 전환.
      주의: 보이지 않는 UV 광원으로로이 당신의 눈을 손상 할 수 있다.
   5. 흥분 2 분 에폭시 접착제와 플라스틱 접시를 4 개의 통합 된 전극. 이로써 전극의 전극 칩에서 당기의 위험 없이 측정 하는 동안 쉽게 처리.
   6. 명확한 테이프와 칩을 커버 하 고 2 h. 진정 하 고 먼지 무료 사용까지 저장 허용에 대 한 60 ° C에서 구워. 이 방법으로 그들은 수는 달에 대 한 안전 하 게 저장.

2. 온 칩 두뇌 파생 된 내 피 세포의 문화

1. 코트 셀 첨부 파일 홍보 칩. 와 성
   1. 채우기 두 채널 버퍼링 식 염 수 (PBS) 시 약을 도입 하기 전에 젖은. 확인 현미경 경우 채널에 모든 공기 거품. 그렇다면, 여분의 PBS를 가진 홍 조 하 여 그들을 제거.
   2. 두 채널의 PBS에서 20 µ g/mL 인간의 fibronectin 30 µ L 입력합니다. 3 시간 동안 37 ° C에서 품 어. 공기 방울에 대 한 확인 하 고, 필요한 경우 플러시 PBS 가진 채널 및 fibronectin 솔루션 리필.
   3. 내 피 성장 매체와 칩을 제거 하 고 37 ° C와 5% CO ₂ 2 헤 대 한 인큐베이터에 그들을 품 어
   4. 채널에 유체와 직접 접촉에 있는 전극의 모든 보장 하기 위해 3 단계에 설명 된 대로 빈 칩의 TEER를 측정 합니다. 빈 칩, 일반적인 TEER 값은 0-1 Ω cm ².
2. 셀 맨 위 채널에 씨앗.
   1. 인간의 대뇌 microvascular 내 피 세포 (hCMEC/D3)의 confluent 단층으로 문화 플라스 크 (75 cm ² 문화 영역)에서 문화 매체를 제거.
   2. 는 PBS로 세포 세척. 0.05% 트립 신-EDTA의 2 개 mL를 추가 하 고 셀 문화 플라스 크에서 분리가 될 때까지 2-5 분 동안 37 ° C, 5% CO ₂에서 품 어.
   3. 20% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충 하는 문화 매체는 트립 신을 비활성화 합니다. 계산 셀과 셀 서 스 펜 션의 총 수를 계산.
   4. 한편, 원심 390 x g 5 분에서 hCMEC/D3 셀 하 고 상쾌한 제거.
   5. 적절 한 양의 내 피 성장 매체 (EGM-2) 5 x 10 ⁶ 셀/mL의 농도에 도착에 셀 펠 릿을 resuspend. 이 칩에 2 x 10 ⁵ 셀/c m ²의 시드 밀도 결과.
   6. 천천히 맨 위 채널에 잘 혼합된 세포 현 탁 액의 30 µ L 플라스틱 하 고 여전히 압력을 발휘 하면서 유창 모션에 입구에서 피펫으로 제거.
   7. 현미경 시드 밀도 확인합니다. 맨 위 채널에 걸쳐 세포의 균일 한 분포를 달성 해야 합니다.
   8. 적어도 1 h. 위해 37 ° C, 5% CO ₂ 칩 내 피 문화 매체와 연결 되지 않은 셀 밖으로 플러시 품.
3. 칩에 내 피 문화를 유지.
   1. 두 번, 하루는 후미에서 저수지로 문화 매체 가득 피 펫 팁을 삽입 하 고 중력 기반 흐름에 의해 칩 내부 매체를 대체.
      참고:는 microchannels 입력 하 고 셀 계층 파괴에서 공기 방울을 피하기 위해, 입력부에 끝을 삽입 하기 전에 피 펫 팁과 칩 위에 액체 액체-액체 접촉 하 게 있는지 확인 합니다. 이에 작은 방울을 추가 하 여 촉진 될 수 있다는에 / 피 펫 삽입 전에 콘센트.
   2. 채널 건조 하지 않도록 매장에서 피 펫 팁 저수지를 추가할 수도.
   3. 37 ° C, 5% CO ₂ 칩을 품 어.

3. 온 칩 TEER 측정

1. 일 설정e TEER 측정 장치, 잠금 증폭기 및 프로브 케이블 회로 반 데르 조 타 외에 지정 된 구성. ¹⁶ 또는 potentiostats 또는 임피던스 분석기는 또한 이러한 임피던스 기반 TEER 측정에 적합.
2. 인큐베이터에서 칩을가지고 고 어떤 액체 전극 칩의 외부 연결을 방지 하기 위해 전극 주위 플라스틱 접시에서 적어도 10 분 제거에 대 한 실내 온도 도달 하도록.
3. 200 Hz에서 임피던스 스펙트럼 예상된 크기와 모양의 TEER 측정으로 유효성을 검사 하는 경우만 5-10 분 확인에에서 칩 당 6 임피던스 스펙트럼의 결과로 2 개의 전극의 각 조합에 대 한 1 MHz 임피던스 스펙트럼을 걸릴 결과 섹션에 설명 된.
4. 측정을 완료 한 후 37 ° C, 5% CO ₂ 배양 기에 다시 칩을 넣어.
5. 정규화 TEER 값을 얻은 임피던스 스펙트럼 처리 합니다.
   1. Get은 측정된 저항 전극 사이 와 , 그림 2B에서 D, 해당 임피던스 스펙트럼에 10 kHz에서 저항 원에서 표시.
   2. 계산 사용 하 여 한 번에 하나의 칩에 해당 하는 6 측정된 저항 TEER 그림 2G ¹⁶의 방정식을 사용 하 여 포인트:
      
      이 방정식에서 는 저항 측정, 문화 영역 < img alt = " 방정식 5"src="/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg "/ >은 세포 벽과 멤브레인, 저항 , , 및 는 저항 세포 장벽을 통해 값 측정 및 및 저항 값 측정 되는 스트레이트 채널입니다. ¹⁶ 방정식에서에서 파생 된 등가 회로 그림 2C에.
6. 는 TEER의 개발 시간에서을 얻기 위해 모든 시간 포인트에서 TEER에서 빈 TEER 빼기.

셀 (실선) 없이 칩을 통해와 세포 장벽 (파선)을 통해 전기 임피던스 분광학의 도식 결과 그림 2A에 표시 됩니다. 4 개의 주요 영역을 확인할 수 있습니다, 그리고 각각 특정 전기 구성 요소에 의해 지배. 약 1khz 아래 전극 문화 매체 인터페이스에서 더블 레이어 커패시턴스 지배, 임피던스 크기와 접근 하는-90 ° 위상 변화에 대 한 부정적인 사면이 특징. 주파수는 더블 레이어 커패시턴스 지배, 문화 매체에 노출 전극 영역에 따라 달라 집니다. 미세 채널의 채널 길이 및 단면적, 내부에 따라 내부 문화 매체의 저항에 해당 하는 0 °에 가까운 위상 변화를 1khz (셀) 없이 또는 100 kHz (셀)와 위에 저항 고원은 막, 다공성 및 두께 따라 세포 장벽을 통해 측정, 1, 10 kHz 사이 여분 저항 고원 단계 다이어그램에서 현지 최대 뿐만 아니라 볼 수 있다. 이 때 임피던스 결과에 명확한 증가 TEER의 결정에 대 한 중요 한 중요성의 셀 측정된 경로에 존재 하 고 따라서 "관심 영역" 이라고 불린다. 10, 100 kHz 사이 추가 슬로프 셀 장벽 커패시턴스는 전기적으로 절연 지질 bilayer 막에서 발생 하 고 셀 층의 총 면적에 따라 달라 집니다에 해당 합니다. 27 임피던스 크기 뿐 아니라 이러한 지역 경계 공부 되 고 시스템에 의존 하 고, 채널 차원, 문화 매체 전도성, 전극 위치 및 셀 형식, 변경. 장벽 형성에 전기 임피던스 분광학의 연습과 이론에 대 한 추가 읽기를 위해 조직 벤슨 외. 여 검토 문서 것이 좋습니다. 28

TEER 측정의 대표적인 데이터 빈 칩과 칩 그림 2E 와 2F, hCMEC/D3 뇌 내 피 세포 층으로 각각 표시 됩니다. 즉, 임피던스 분광학 4 개의 전극을 가진 6 측정을 사용 하 여 수행 되었다: 세포 배양 매체 가득 채널 (실선)을 통해 두 측정 및 4 개의 측정 채널 막 통해 및--존재 하는 경우는 세포 장벽 (파선) 했다입니다. 6 측정 경로 그림 2B, 도식 단면도 (그림 2C) 및 평면도 (그림 2D)에서 파생 되는 등가 저항 회로에서 확인할 수 있습니다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이 빈 칩 측정 (그림 2E) 셀 없이 임피던스 스펙트럼의 전형적인 형태를 보여. 세포 벽 ( 그림 2F에 파선)을 통해 측정 닮은 그림 2A에 셀 일반적인 임피던스 스펙트럼. 참고 임피던스 크기와 위상 이동 증가 1 MHz로. 높은 주파수에서 측정 설정의 전형적인 응답 이며 실험적인 근원의 아니다.

확인 하려면 TEER 이러한 실험 임피던스 스펙트럼을 사용 하 여, 먼저 측정된 칩 저항 결정 됩니다, 셀 레이어, 채널 및 막의 총 저항입니다. 이 위해, 관심 영역에 적합 한 판독 주파수 선정 되었다, 세포와 세포 없이 0 ° 위상 변화에 가까운 단계 음모에 현지 최대에: 10 kHz. 10 kHz에서 6 측정된 저항, 함께 4 개의 전극 사이 측정으로 TEER 직접 계산 됩니다 그림 2 층에 방정식을 사용 하 여.

제시 장치 기관에 칩 TEER 결정 적합 표시, BBB는 칩 내부 복제 했다 하 고 그 TEER 문화의 3 일 동안 모니터링 했습니다. 그림 3A 평균 TEER ± 표준 오차 (SEM) 의미의 칩에 대 한 4 개의 BBBs-에-, 표시는 22 ± 1.3 Ω c m2의 대 지에 결과에 있는 문학에서 보고 된이 세포 선의 TEER 비교입니다. 29 또한, 실험 종료 후 형광 핵의 얼룩, 그것은 볼 수 있습니다 두뇌 endothelium 장치 (그림 3B) 내부 연속 단층을 형성. 면역 형광 염색 꽉 접합 단백질 Zonula Occludens-1 (조로-1)의 뇌 내 피 세포의 BBB-특정 표현 형을 유지 하 고 꽉 접합 복합물을 형성 했다.

그림 1: 디자인 및 통합 된 전극 가진 기관-온-칩 소자의 조립.
최고 채널 (TC), 막 (M)와 아래쪽 하단 채널 (BC) PDMS 부분 PDMS 윗부분의 구성 된 미세 칩의 (A) 분해 보기. 4 개의 백 금 철사 전극 (E1 ~ 4) 삽입 하 고 옆 채널에 고정 됩니다. 맨 위 채널에 막 위에, hCMEC/D3 뇌 내 피 세포 BBB 복제를 경작 했다. (B) 플라스틱 접시에 고정 칩 조립. Elsevier에서 재발급된와 적용할된 권한입니다. 16 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 대표 임피던스 데이터 및 TEER의 결정.
(A) 회로도 임피던스 스펙트럼 표시 임피던스 크기 (Ω) 및 주파수 (Hz), 셀 (파선) 없이 셀 (실선)와 칩에 전기 임피던스 분광학에 대 한 일반적인 대 위상 변화 (°) 4 개 주요 지역, 각각에 의해 지배: 전극, 문화 매체 저항, 셀 장벽 저항 및 셀 막 커패시턴스에 더블 레이어 커패시턴스. "관심 영역" 셀 계층의 기여 정량된 (빨간색 화살표)을 수 있습니다 나타냅니다. (B) 상위 채널 저항 R1 과 R3, 하단 채널 저항 R2 와 R4 와 막 및 EC 장벽 저항 Rm칩의 등가 저항 회로. (C) 도식 크로스 섹션 맨 위 채널에 경작 된 내 피 세포 (EC)를 보여주는. (D) BBB의 도식 평면도 칩 전극의 구성과 0.25 m m2 는 임피던스 측정의 문화 영역을 보여주는. (E) 빈 칩의 대표적인 임피던스 스펙트럼 세포 배양으로 가득합니다. (F) 대표 임피던스 스펙트럼을 hCMEC/d 3에서 칩의 뇌 내 피 세포 3 일에 대 한 문화를 했다. (G) 4 전극의 모든 6 개의 조합 사이 측정 된 저항에서 TEER 계산 공식. Elsevier에서 재발급된와 적용할된 권한입니다. 16 제발 더 큰 적이 있는 보려면 여기를 클릭 하십시오.이 그림의 한 이온

그림 3: 대표 TEER BBB-온-칩 개발.
4 BBBs-에-칩의 3 일의 문화 기간 동안 22 ± 1.3 Ω cm2 (평균 ± SEM) 고원 도달 의미 (SEM)의 (A) 평균 TEER ± 표준 오차 비교를 위해, 빈 칩의 데이터 포함, 세포 변형 및 칩의 TEER 값에 비해 같은 기간에 한계 편차와 편차 0 Ω c m2 에서 표시 됩니다. (B) 형광 현미경 검사 법의 스테인드 핵 endothelium, PDMS와는 삽입에 표시 된 위치에 막에의 지속적인 단층을 밝혔다. (C) 면역 형광 꽉 접합 단백질 Zonula Occludens-1, BBB-특정 꽉 접속점 세포 사이 측정된 TEER을 야기할 나타내는의 존재를 공개 했다. Elsevier에서 재발급된와 적용할된 권한입니다. 16 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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