셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

Summary

이 연구 보고서의 세포 침입과 마이그레이션 분석에 대 한 두 가지 방법: Boyden 챔버 분석 결과 및 체 외에서 비디오 현미경-기반 상처 치유 분석 결과. 이 두 실험에 대 한 프로토콜 설명, 그리고 그들의 장점과 단점 비교 됩니다.

Abstract

종양 세포의 침입과 마이그레이션 능력 암 진행 및 재발 주 기여자입니다. 많은 연구는 새로운 치료 전략을 개발 하는 것을 목적으로, 암 세포 전파 하는 방법을 이해 하려면 마이그레이션 및 내 습 능력 탐험 있다. 이러한 능력의 세포질과 분자 기초의 분석 세포 이동성의 특성화 및 골격 및 세포 microenvironment의 물리 화학적 특성을 주도하 고 있다. 몇 년 동안, Boyden 챔버 분석 결과 스크래치 상처 분석 결과 표준 기술을 공부 셀 침공 및 마이그레이션 되었습니다 합니다. 그러나,이 두 기술에는 제한이 있습니다. Boyden 챔버 분석 결과 어렵고 시간 소모, 그리고 스크래치 상처 분석 결과 낮은 재현성. 현미경 검사 법에 특히 현대 기술의 개발은 스크래치 상처 분석 결과의 재현성을 증가 했다. 강력한 분석 시스템을 사용 하 여, 세포 이동과 내 습의 자동 및 실시간 분석을 제공 하는 "인큐베이터" 비디오 현미경을 사용할 수 있습니다. 이 문서의 목표는 보고 하 고 셀 침공 및 마이그레이션 공부 하는 데 사용 하는 두 분석 비교: Boyden 챔버 분석 결과는 최적화 된 생체 외에서 비디오 현미경-기반 스크래치 상처 분석 결과.

Introduction

셀 침공 및 마이그레이션 저항 처리¹ 의 주요 원인, 암 세포의 보급에 참여 하 고 locoregional 또는 전이성 재발 암 치료²후 발생할 수 있습니다. 상피 엽 전환 (응급) 셀 침공-마이그레이션은 암에서 세포에서 전환 상피는 엽 형의 초기 과정입니다. E-Cadherin 상피 형³의 extracellular 마커 이며 N cadherin vimentin의 증가 식 엽 형⁴의 특징입니다. 또한 마이그레이션 매트릭스 metalloproteases⁵의 행동을 통해 기질 (ECM)을 침략 암 세포의 내장 용량에 의존 한다.

이 침공-마이그레이션 메커니즘, 머리와 목 암⁶특히 여러 위치에서 암에 대 한 설명 하고있다. 많은 연구원은 암 세포가이 지식 새로운 치료 전략으로 이어질 것입니다 희망에서 보급 하는 방법을 더 잘 이해 하려면 마이그레이션 및 내 습 프로세스에 집중 했다. 그것은 중요 이러한 연구 신뢰성 및 재현성 분석 실험을 사용 하 여 수행 됩니다.

체 외에서 세포 운동 성의 분석 전하실 수 있습니다. 몇 년 전 개발, Boyden 챔버 분석 결과 침공-마이그레이션 분석⁷에 대 한 표준으로 간주 됩니다. 그러나, 그것은 시간이 소요 이며 자주 정확 하지 않다. 두 번째 테스트는 상처 치유 분석 결과⁸, 세포 단층 배양에 스크래치를 하 고 세포 내 습 및 마이그레이션 고정된 시간 간격의 이미지를 캡처입니다. 이 기술은 두 개의 연속 된 테스트의 결과 사이 큰 변이 때문에 넓게 강평 되었다. 그러나, 현미경에서 특히 현대 기술의 응용 프로그램 스크래치 상처 분석 결과의 재현성을 개선 했다. 비디오 현미경 인큐베이터에서 쉽게 도입 될 수 있는 고 셀 이동의 실시간 이미지를 생성할 수 있습니다. 이 소자는 현미경 데이터를 기록 하 고 시간이 지남에 상처 셀 합류의 자동 분석을 제공. 이 문서의 목표는 Boyden 챔버 분석 결과 최적화 된 스크래치 상처 분석 결과 설명 하 고 장점과 각 방식의 약점을 논의 하기 위해.

Protocol

참고: ECM의 포함 없이 Boyden 챔버와 스크래치 분석 실험 이라고 마이그레이션 분석 결과, 그리고 ECM과 같은 분석을 침공 분석 결과 라고.

1. Boyden 챔버 분석 결과

참고:이 프로토콜은 재발 머리와 목 편평 상피 세포 암 (HNSCC) 후 두 암에서 파생 되 고 존에서 얻은 SQ20B의 셀 라인에 맞게 작은 (보스턴, 메사추세츠, 미국).

주 1

1. 시드 셀
   1. 시드 2 10⁶ SQ20B 175 cm² 플라스 크 하루 전에 72 h에에서 문화 매체 (CM)의 12 mL에서 세포 고 80% 셀 합류에 성장 하는 세포.
      1. SQ20B 셀에 대 한 CM을 준비, 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 0.04 mg/mL 날린, 100 U/mL 페니실린과 0.1 g/L 스 Dulbecco의 수정된이 글 매체 (DMEM)을 보충.
   2. 층 류 흐름 후드 셀 trypsinize. 매체를 제거 하 고 세척 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 셀 trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (0.5 g/L)의 2.5 mL을 추가. 37 ° C에서 5 분에 대 한 셀을 품 어 한 다음 37 ° c.로 예 열 하는 CM의 12.5 mL을 추가 하 여 반응을 중지합니다 셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.
   3. 평가를 각 상태에 대 한 6 10⁵ 셀의 셀 밀도에서 25 cm² 플라스 크에 세포 씨앗 CM의 3 ml에서 24 h에 대 한 셀을 품 어.

주 2

2. 셀 기아와 코팅된 챔버의 준비
   1. FBS 대신 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 사용 하 여 낮은 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 매체의 3 mL와 함께 각 플라스 크에 매체를 대체 하 여 세포를 굶 어. 인큐베이터에서 24 h에 대 한 셀을 굶 어.
      1. 기아 CM (s-CM) 준비, 0.1 %BSA, 0.04 mg/mL 날린, 100 U/mL 페니실린과 0.1 g/L 스 DMEM 보충.
   2. 마이그레이션 분석 결과 대 한 단계로 1.3 이동 합니다.
   3. 침공 분석 결과 대 한 3 년 전에 12 h 500 μ s-CM의 각 코팅된 챔버를 추가 하 여 코팅된 Boyden 챔버를 준비 합니다. 상업적으로 준비 된 코팅된 Boyden 챔버를 사용 하 고 사용 하기 전에 4 ° C에서 그들을 유지. 동반자 접시에 각 Boyden 챔버를 놓고 하룻밤 37 ° c 배양 기에서 그것을 설정 합니다.

3 일

3. Boyden 챔버에 시드 셀
   1. 동반자 플레이트를 사용 하 여 준비 하는 chemoattractant. 각 채우기와 10 %FBS, 0.04 mg/mL 날린, 100 U/mL 페니실린, 0.1 g/L 스 완전 한 매체의 750 μ와 24-잘 동반자 판의 잘.
      1. 각 셀 라인 및 각 치료 상태에 대 한 chemoattractant를 적응. Chemoattractant CM (ca-CM)를 준비 하려면 10 %FCS, 0.4 mg/mL 날린, 100 U/mL 페니실린과 0.1 g/L 스 DMEM 보충.
   2. 거품을 피하기 위해 돌보는 prefilled 동반자 접시에 상단 챔버를 전송 합니다.
   3. 침공 분석 결과 대 한 조심 스럽게 각 Boyden 상공에서 450 μ M의 제거.
   4. 층 류 흐름 후드 셀 trypsinize. 매체를 제거, 살 균 PBS로 세포 세척, trypsin EDTA (0.5 g/L)의 0.5 mL을 추가 및 다음 37 ° c.에 5 분에 대 한 셀을 품 어 CM 37 ° c 예 열을 추가 하 여 반응을 중지합니다 셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.
   5. 6 10⁴ 셀/mL의 최종 희석 주는 0.1 %BSA 매체의 500 μ에 시드 3 10⁴ SQ20B 셀.
      참고: 셀 농도 각 셀 라인에 대 한 적응 한다.
   6. 24 h에 대 한 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.

4 일

4. 셀 고정 및 얼룩
   1. 셀 라인에 배 시간 전에 셀을 수정 합니다. 24 시간 전에 SQ20B 셀을 수정 합니다.
   2. 각 삽입 동반자 접시에서 제거 하 고 조심 스럽게 면봉을 사용 하 여 상단 챔버에서 셀을 제거. 그것은 특히 위 약 실에 있는 모든 셀을 제거 하는 것이 중요입니다.
   3. 수정 및 얼룩 얼룩 키트 제공을 사용 하 여 5 월 Grunwald Giemsa 채색⁹ 를 개별적으로 삽입 합니다. 또는 30 분 고정을 위한 또 다른 동반자 접시에 4 %paraformaldehyde 사용.
   4. 각 약 실 건조 실험실 후드 빈 24 잘 동반자 플레이트 삽입 하십시오.

5 일째

5. 현미경 분석
   1. 20 단계 대조 현미경에 삽입과 함께 동반자 플레이트를 삽입 하 고 막의 아래 부분에 마이그레이션된 각 셀을 계산. 상단, 하단에서 목표를 이동 하 여 오른쪽 초점 위치를 최적화 하 고 막의 하단 부분에 위치를 중지.
   2. 마이그레이션된 세포의 숫자와 시드 셀 사이의 비율을 계산 합니다. 3 중에서 각 치료 상태에 대 한 각 계산을 반복 합니다.

2. 스크래치 상처 분석 결과: 셀 마이그레이션

참고: 지침 셀의 각 유형에 적응 해야 합니다.

주 1

1. 시드 셀
   1. 시드 2 x 10⁶ SQ20B 175 cm² 플라스 크 하루 전에 72 h에에서 CM의 12 mL에서 세포 고 80% 셀 합류에 성장 하는 세포.
   2. 층 류 흐름 후드 셀 trypsinize. 매체를 제거 살 균 PBS로 세포 세척, trypsin EDTA (0.5 g/L)의 2.5 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 5 분에 대 한 셀을 품 어 37 ° c.로 예 열 하는 CM의 12.5 mL을 추가 하 여 반응을 중지합니다 셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.
   3. 각 잘에서 100 μ 당 4 10⁴ 셀의 최종 밀도 주는 4 x 10⁵/mL의 셀 밀도에서 prediluted 샘플을 생성 합니다. 이 농도 각 셀 라인에 맞게 조정 해야 합니다 그리고 1 x 10⁴ 6 10⁴ 셀의 범위에서 해야 한다.
   4. 2.1.2 단계에서 준비 하는 솔루션의 입금 100 μ에 의해 96 잘 접시의 각 음에 시드 셀.
   5. 우물의 바닥에는 셀을 균등 하 게 분산을 5 분 동안 실 온에서 접시를 남겨 주세요.
   6. 인큐베이터에 접시를 놓고 12 ~ 16 h (최대) 37 ° c.에 대 한 플레이트에 셀 수

주 2

2. 스크래치 상처 분석 결과
   1. 인큐베이터에서 2.1 단계에서 준비 된 접시를 제거 합니다.
   2. 후드, 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 부상 장치를 사용 하 여 상처를 확인 합니다.
   3. 즉시 각 잘 사용 하는 피 펫을 상처를 건드리지 않도록 돌보는 적응 원추형 팁에서 매체를 제거 합니다.
   4. 포부를 반복 하 고 각 잘 37 ° C로 예 열 하는 CM의 100 μ를 사용 하 여 두 번 셀을 씻어.
   5. CM 세척 단계 후 적응 원추형 팁을 피 펫을 사용 하 여 제거 합니다.
   6. 각 잘 각 치료 조건에 대 한 특정 매체의 100 μ 추가.
   7. 우물에서 모든 거품을 만들지 않도록 하려고 합니다. 반대로 pipetting 기술은 여기 도움이 될 수 있습니다. 또는, 주사기 바늘으로 거품을 제거 합니다.
   8. 비디오 현미경의 적응 랙에 접시를 놓습니다.
   9. 이미지 품질을 개선 하기 위해 접시의 더 낮은 측에 응축을 피하기 위해 첫 번째 검사 전에 적어도 15 분 동안 따뜻한 접시 허용.
   10. 프로그램 잘 당 하나의 이미지에 비디오 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 검사의 일정. 2 h 간격 침공 마이그레이션 실험 필요 하다. 실험의 목표는 비디오를 생성 하는, 최대 30 분의 간격이 좋습니다.
   11. 실험의 끝에, 신중 하 게 부상 장치를 세척 하 고 각 제조 업체에 의해 표시 된 4 개의 세척 단계를 따르십시오.

3, 4, 및 5 일

3. 비디오 현미경을 사용 하 여 마이그레이션 분석
   1. 24 h 및 최대 5 일의 최소, 모니터링 하 고 셀 마이그레이션을 확인 합니다.
   2. 각 셀 형식에 맞게 적절 한 셀 마스크를 사용 하 여 셀 마이그레이션 분석. 각 셀 라인에 맞게 셀 마스크를 얻기 위해 특정 셀 이미지 컬렉션을 사용 하 여 소프트웨어에서 정의 처리 하는 셀을 생성 합니다.
   3. 곡선을 추적 하 고 데이터를 분석 하 고 결과 비교 하 여 사용할 수 있는 스프레드시트를 내보낼.

3. 스크래치 상처 분석 결과: 셀 침공

참고: 지침 셀의 각 유형에 적응 해야 합니다.

주 1

1. 시드 셀
   1. 동일한 프로토콜을 사용 하 여 셀 시드의 단계 2.1에에서 설명 된 대로.

주 2

2. ECM을 준비
   1. 4 ° c.에 사용 하기 전에 적어도 12 h에 대 한 행렬에 서 리 없애다 없음 집계 표시는 다는 것을 확인 하십시오. 집계 표시 되는 경우는 집계 사라질 때까지 오랜 기간 동안 4 ° C에서 매트릭스를 유지. 얼음에 매트릭스를 유지. Precooled 피 펫 팁을 사용 합니다.
      참고: 매트릭스 응고 됩니다 하지 않을 경우 4 ° c.에 유지
   2. 5 분 동안 얼음에 microcentrifuge 튜브를 진정.
   3. 받아 CM 냉장고에서 4 ° C에 냉각 그리고 300 μ g/mL의 최종 농도를 precooled microcentrifuge 관에 행렬을 희석.
   4. Prediluted 매트릭스 microcentrifuge 튜브 4 ° c.에 냉장고에 반환
      참고: 냉각 랙 microcentrifuge 튜브에 대 한 적응은 실험을 통해 4 ° C에서 튜브를 유지 도움이 됩니다.

주 2

3. 스크래치 상처 분석 결과 및 ECM의 치료
   1. 인큐베이터에서 3.1 단계에서 준비 된 접시를 제거 합니다.
   2. 후드, 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 부상 장치를 사용 하 여 상처를 확인 합니다.
   3. 즉시 각 잘 사용 하는 피 펫을 상처를 건드리지 않도록 돌보는 적응 원추형 팁에서 매체를 제거 합니다.
   4. 열망 절차를 반복 하 고 37 ° c.로 예 열 하는 CM의 100 μ를 사용 하 여 두 번 셀을 씻어
   5. 두 번째 세척 후 5 분 동안 그것의 온도 equilibrate에 4 ° C 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
   6. 원추형 팁, 가장자리에서 신중 하 게 플라스틱을 상처를 만지지 마십시오 돌보는 포부 피펫으로 각 잘에서 차가운 매체를 제거 합니다.
   7. Prediluted 매트릭스의 50 μ를 4 ° c.에 precooled 원추형 팁을 사용 하 여 각 영역 추가
   8. 30 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
      참고: 37 ° C에서 prewarmed 지원 랙 96 잘 접시의 온난화 가속 도움이 됩니다.
   9. 인큐베이터에서 접시를 제거 하 고 각 치료 조건에 대해 표시 된 대로 각 잘 적응된 CM의 100 μ 추가.
   10. 우물에서 모든 거품을 만들지 않도록 하려고 합니다. 반대로 pipetting 기술은 여기 도움이 될 수 있습니다. 또는, 주사기 바늘으로 거품을 제거 합니다.
   11. 비디오 현미경에 맞게 선반으로 접시를 놓습니다.
   12. 이미지 품질을 개선 하기 위해 접시의 더 낮은 측에 응축을 피하기 위해 첫 번째 검사 전에 적어도 15 분 동안 따뜻한 접시 허용.
   13. 프로그램 스캔, 비디오 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 스크래치 상처 스캔 모드에서 잘 당 하나의 이미지에서의 일정. 2 h 간격 침공 마이그레이션 실험에 대 한 필요합니다. 실험의 목표는 비디오를 생성 하는, 최대 30 분의 간격이 좋습니다.
   14. 실험의 끝에, 신중 하 게 부상 장치를 세척 하 고 각 제조 업체에 의해 표시 된 4 개의 세척 단계를 따르십시오.

3, 4, 및 5 일

4. 비디오 현미경을 사용 하 여 셀의 분석입니다.
   1. 2.3 단계를 반복 합니다.

Results

우리 보고 여기 셀 침공 및 마이그레이션 분석을 두 가지 방법. 그림 1 는 Boyden 챔버 실험을 보여준다. 셀은 CM에 시드와 삽입 chemoattractant 매체와 동반자 접시에 배치 됩니다. 막 코팅 수 (마이그레이션 분석 결과) 또는 코팅 (침공 분석 결과). 셀은 s c M에 상단 챔버로 시드. 낮은 챔버는 chemoattractant으로 CM으로 가득 합니다. 셀 2 배 시간 전에 고정 됩니다.

그림 2 는 셀 고정 후 Boyden 멤브레인을 보여준다. 그림 2A 는 차선의 결과, 막의 상부에 셀 클러스터를 보여 줍니다. 그림 2B 셀 ...

Discussion

우리 보고 여기 두 다른 modalities 셀 침공 및 마이그레이션 과정을 공부 합니다. 이 프로세스의 분석은 암 줄기 세포^10,11이라고 하는 암 세포의 부분 모집단의 증가 운동에 의해 설명 될 수 있는 전이성 재발에 관련 된 요소를 이해 해야 합니다.

Boyden 챔버 실험은 가장 자주 사용 되는 기술을 탐구 하 세포 내 습 및 마이그레이션. 이 기술은 높은 실험의 전문성에 의존 하지만이 방법의 장점 중 하나는 재현성 이다. 셀 계산 수동 이며 경험 사이 다를 수 있습니다. 많은 중요 한 단계 표준화 하 고 뒤에 각 셀 라인에 적절 한 chemoattractant 및 기아 매체의 사용을 보장 하는 등 주의 해야 합니다. 면봉으로 위 막에서 세포를 제거 하는 것이 또한 최적의 결과 보장 하 고 그림 2A에 표시 된 차선...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
태아 송아지 혈청 골드	GE 헬스케어	A15-151
하이드로코르티손 수용성	시그마-알드리치	H0396-100MG
페니실린/스트렙토마이신 100 X	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 너트 믹스 (1X) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	용액은 매우 불안정하기 때문에 사용 직전에 준비해야 합니다
Z1 쿨터 입자	Beckman Coulter	6605698
광학 현미경	Olympus	CKX31
SQ20B 세포주	존 리틀의 선물 s	Laboratory-Wound
Maker	Essen Bioscience	4494	안전하고 건조한 장소에 보관
96웰 ImageLock Plate	Essen Bioscience	4379
CoolBox 96F 시스템(CoolSink 포함) 96F	Essen Bioscience	1500-0078-A00
CoolBox(M30 시스템 포함	Essen Bioscience	1500-0078-A00
Boyden Insert	Dominique Dutcher	353097
Boyden 코팅 인서트	Dominique Dutcher	354483	-20 ° C
Companion 24웰 플레이트	Dominique Dutcher	353504
BD Matrigel 표준	BD BioScience	BD 354234	-20°C에 보관
RAL 555 염색 키트	RAL 진단	361550	안전하고 건조한 장소에 보관
Microcentrifuge 튜브	Eppendorf	33511