디지털 홀로그램 현미경 (DHM)를 사용 하 여 낮은 농도에서 미생물 측정

Summary

디지털 홀로그램 현미경 (DHM) 이미징 샘플 50-100 X 초점 비교 해상도, 명시 야 현미경 보다 두꺼운 수행 후 처리를 허용 하는 체적 기술입니다. 여기 DHM 사용 됩니다 식별, 계산, 그리고 미생물에서 매우 낮은 밀도 추적과 광학 밀도 측정, 판 수, 및 직접 카운트와 비교.

Abstract

정확 하 게 감지 하 고 스파스 세균 샘플 세 의료 진단, 및 로봇 식 임무를 다른 행 성과 태양계의 위성에 의해 생활 탐지에 대 한 음식, 음료, 제약 공업, 많은 응용 프로그램 있다. 현재, 스파스 세균 샘플은 문화 도금 또는 epifluorescence 현미경 검사 법에 의해 계산 됩니다. 문화 접시 필요 오래 부 화 시간 (주 일) 하며 epifluorescence 현미경 광범위 한 얼룩 및 샘플의 농도. 여기, 꺼짐-축 디지털 홀로그램 현미경 (DHM)를 사용 하 여 매우 희석 문화 (100-10⁴ 셀/mL)에 박테리아를 열거 하는 방법을 보여 줍니다. 첫째, 사용자 지정 DHM의 건설 건물 저가 악기에 자세한 지침과 함께 설명 되어 있습니다. 홀로 그래피의 원리를 설명 하 고 통계 모델 동영상 해야 얼마나 오래 추정 하는 데 사용은 악기의 광학 성능 특성 및 세균 솔루션 (표 2)의 농도에 따라 셀을 검출 하 . 10 셀의 비디오 검색⁵, 10⁴, 10³및 100 셀/mL 유엔 재건된 홀로그램을 사용 하 여 실시간으로에서 설명 된다. 진폭 및 위상 이미지의 개조는 오픈 소스 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 보여 줍니다.

Introduction

매우 희석 샘플에 정확한 세균의 결정은 많은 응용 프로그램에서 중요 한: 몇 가지 예는 물과 식품 품질 분석^1,,23; 혈액, 중추 신 경계, 또는 래^4,5;에 병원 균의 검출 메 마른 물⁶;를 포함 하 여 제약 제품의 생산 그리고 오픈 바다와 퇴적 물^7,,89같은 oligotrophic 환경에서 환경 지역 사회 분석. 또한 목성과 토성, 특히 유로 파^10,11 , Enceladus^12,13, 의 얼음 위성에 가능한 현존 미생물 생명의 검출에 대 한 관심 증가

Protocol

1. 성장과 열거형의 박테리아

참고: 이것은 적절 한 매체 ³⁶에서 자란 거의 모든 세균성 긴장에 적용 됩니다. 우리의 예제에서 우리는 세 사용: Serratia marcescens 일반적인, 쉽게 식별 연구소 스트레인;로 그리고 작은, 높게 운동 환경 부담, Shewanella oneidensis 미스터-1. 비교의 비 운동 세포, 비 운동 Shewanella 돌연변이, Δ 대 운동 FlgM, 또한 사용 된다 비교 ³⁷. 모든 변종 lysogeny 국물 (파운드)에서 재배 됩니다.

준비

살 균 파운드 매체 (증류수의 리터 당: 10 g bacto tryptone, 10 g NaCl bacto 효 모 5 g, 필터 또는 오토 클레이 브). 표준 100mm 직경 파운드-한 천 격판덮개 (동일한 매체 플러스 리터 당 15 g 한 천 제조 법, 오토 클레이 브 (121 ° C, 20 분) 소독을 때 충분히 처리할 멋진 부)를 준비 합니다. 냉장고에 매체 및 접시를 저장.
1. 실험 전날 씨앗의 5-6 mL " 마스터 " 살 균 그리고 biosafety 기법을 사용 ....

Results

결과 DHM로 매우 낮은 수준에서 생활 하 고 죽은 박테리아를 감지 하는 능력을 표시 해야 합니다. 계산 하는 박테리아의 수는 Petroff 하우저 세 실과 접시 수를 사용 하 여 얻은 결과와 일관 되어야 합니다. 표준 통계 방법을 다양 한 세균성 농도에서 다른 검출 방법의 정확성에 대 한 정보를 제공합니다.

그림 1 에서는 세포의 직접 열거형에 사용 되는 세 실의 미세 뿐만 아니라 사용 Petroff 하우서 세 챔버. 그림 2A 보여줍니다 충분 한 허용 된 전형적인 풍부한 문화 접시 S. marcescens 식민지 (상 온에서 16 시간) 성장에 대 한 시간. 그림 2B 사용 하는 모든 .......

Discussion

홀로그램의 수치 재건: 홀로그램의 숫자 재건, 각도 스펙트럼 방법 (ASM) 사용 됩니다. 이 DHM의 그린의 기능으로 홀로그램의 회선을 포함 한다. 특정 초점면에서 이미지의 복잡 한 wavefront 푸리에 회선 정리를 다음과 같이 채용 하 여 계산할 수 있다:

(1)

어디 는 푸리에 변환 연산자 홀로그램 매트릭스와 은 그린의 기능으로 ......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Yeast	BD Biosciences	212750
Bacto Tryptone	BD Biosciences	211705
염화나트륨	Sigma-Aldrich	7710	다양한 구매 옵션
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
10cm 페트리 접시	VWR	10053-704
15 mL 배양 튜브	Falcon ( Corning Life Sciences)352002		Loose-capped
Petroff-Hauser chamber	Electron Microscopy Sciences	3920
10 mL syringes	BD Biosciences	309604	Luer-Lok tip not necessary
Male Luer to 1/16" barbed fitting	McMaster-Carr	51525K291
오토클레이브 가능 1/16" 흐름용 ID PVC 튜빙	Nalgene	8000-0004	길이별로 판매, 그에 따라 구매
주사기 펌프	Harvard Apparatus	PHD 2000
Sample Chamber	Custom	n/a	See Materials Section
Holographic Microscope	Custom	n/a	See Wallace et al.
오픈 소스 소프트웨어	Custom	https://github.com/bmorris3/shampoo