대량 절연 및 인간의 혈액 우연 Schistosoma Mansoni 의 Intramolluscan 단계의 생체 외에서 재배

요약

이 문서에서는 대규모 axenic 분리와 인간의 혈액 요 행 Schistosoma mansoni 의 free-swimming miracidia의 컬렉션에 대 한 프로토콜 및 생체 외에서 문화에 대 한 소개에 대 한 그들의 후속 처리.

초록

인간의 혈액 마리가, Schistosoma 종, 달팽이 중급 및 포유류 최종 호스트, 내 성적, 성적 발달 단계를 각각 포함 하는 복잡 한 수명 주기 있다. 격리 하 고 생체 외에서 문화 조건 하에서 다른 라이프 사이클 단계를 유지 하는 능력은 크게 기생충 성장, 개발 및 호스트 통제 세포, 생화학 및 분자 메커니즘의 조사를 촉진 상호 작용입니다. 전송 schistosomiasis의 성별이 없는 재생산 및 달팽이 호스트; 내에서 여러 개의 애벌레 단계 개발 필요 기본 및 보조 sporocysts 통해 infective miracidium에서 cercarial 막바지에 그것은 인 간에 게 감염입니다. 이 문서에서 우리는 대량 해칭 및 감염 된 마우스, 그리고 생체 외에서 문화에 그들의 연속적인 소개의 간은에서 얻은 달걀에서 Schistosoma mansoni miracidia의 격리에 대 한 단계별 프로토콜 제시. 자세한 프로토콜에 종사 schistosome 연구의이 중요 한 분야를 확대 하는 새로운 연구를 격려 할 것 이다 예상 됩니다.

서론

인간의 혈액 마리가 Schistosoma 종, schistosomiasis, 한 약된 230 백만 사람들 전세계¹afflicting 소홀히 열 대 질병의 원인이 되는 에이전트입니다. 가장 광범위 한 종, Schistosoma mansoni, 지리적으로 남아메리카, 카리브 제도, 중동, 사하라 사막 이남의 아프리카²에 배포 됩니다. S. mansoni, 다른 schistosomes의 수명 주기는 복잡 하다, 포유류 확실 한 호스트 및 의무 중간 호스트 역할 속 Biomphalaria 의 민물 달팽이.

S. mansoni 남성과 여성의 성인 웜은 쌍 창 자 점 막의 작은 venules에 박 혀 되 embryonated 계란 (ova)의 출시에 따른 포유류 호스트 재현의 후부 mesenteric 정 맥에서 생활 합니다. 계란 다음 혈관 벽을 통해 휴식 점 막 조직을 통해 마이그레이션 하 고 결국 대변으로 무효 처리는 어디 장 루멘을 입력 합니다. Ova는 민물 및 free-swimming 애벌레 (miracidia) 해치를 입력, 그들은 해야 합니다, 짧은 순서로 찾아 감염의 수명 주....

프로토콜

모든 동물 보호 및 실험 절차 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 위스콘신-매디슨 대학 의정서에 의해 승인 되었다 아니. V005717입니다. 다음 프로토콜 포함 인간 병원 체에 대 한 Biosafety 수준 2 (BSL2) 시설에서 근무 없음이 프로토콜에 묘사 된 schistosome 단계는 인간이 나 다른 포유류를 감염 있습니다. 위험 그룹 2 (RG2) 인간 병원 체를 처리 하는 기관의 정책을 따릅니다.

참고: 우리가 사용 하 여 감염¹⁰, 그들의 더 높은 민감도 때문 (6 주 된) 여성 스위스-웹스터 쥐 그로 인하여 더 큰 계란 부담 저조한. 터 커 외. 이 모델 시스템¹¹에 사용 되는 마우스 및 달팽이 감염 프로토콜을 설명 합니다. 테이블의 자료 의 특정 장비, 재료, 시 약 및 동물 소스가 실험 프로토콜을 수행 하는 데 필요한 모든 나열 합니다.

1. 감염 된 간을의 처리

1. CO₂ 질 (분당 챔버의 볼륨의 10-30%의 속도)에 의해 감염 된 6-7 주 후, 마우스를 안락사. 호흡 및 심장 박동의 정지에 대 한 마우스를....

결과

Miracidia의 대부분은 일반적으로 것 이다 되었습니다 수집 처음 두 "추수"에. CBSS +에서 고립 된 miracidia의 부 화 (그림 4A-C) miracidium sporocyst 변환 프로세스를 트리거합니다. 첫 번째 시간 문화에 다음 전송 우물 CBSS +, miracidia 중지 수영 (그림 4A)의 대다수를 포함 하. 문화에 6 h, miracidia 적극적으로 그들의 ciliated 표 피 판 (그림 4B)를 흘리 고 과정에 있습니다. 이 발산 과정 일치, 애벌레 형성 그들의 외부 syncytial tegumental 덮개 대로 그들은 기본 sporocysts를 변환 합니다. 기생충의 대부분 CBSS + (그림 4C

토론

S. mansoni, 절연 및 여기에 설명 된 대로 조작의 Miracidia만 달팽이 중간 호스트를 감염 시킬 수 있습니다 그리고 그러므로 애벌레 발달의이 단계 동안 인간의 생물 학적 변하지 않습니다. 그러나, 감염을 피하기 위해 사고 노출/달팽이의 배려는 감염 Biomphalaria 달팽이 종 수 있습니다 존재 또는 유지 하는 지역에서 다른 위치에 miracidial 격리를 수행 하기 위해가지고 한다. BSL2 공간으로, 등록 된 별도 룸이 좋습니다. 또한, 모든 세척 간 및 애벌레 절연 처리에 사용 되는 솔루션 살 균 제 (예를들면, 1% 표 백제) 전에 대우 되어야 한다.

그것은에서 간은의 외과 제거 감염 마우스 및 혼합 균질 전에 그들의 후속 처리 생물 안전 캐비닛 (BSC) 무 균 조건 하에서 수행 됩니다 주목 해야한다. 그러나, (대량 샘플 조작의 용이성) 실용적인 이유로 다른 모든 절차 수행 됩니다 소독된 벤치탑 살 균.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Chernin의 균형 잡힌 소금 용액 (CBSS+)			1L의 용액
>2.8 g 염화나트륨	Fisher Scientific	S271-3	염화칼슘을 제외한 소금을 용해하고, 그리고
염화칼륨 0.15g	Sigma-Aldrich	P5405	설탕 800 mL ddH2O
0.07 g 인산나트륨, 이염기 무수	Fisher Scientific	S374-500	염화칼슘을 200
0.45g 마그네슘 황산염 헵타하이드레이트	Sigma-Aldrich	M1880	mL ddH2O
0.53 g 칼슘 클로라이드 디하이드레이트	Mallinckrodt	4160	천천히 소금/설탕 졸에 칼슘 졸른을 첨가하십시오.
0.05g 중탄산 나트륨	Fisher Scientific	S233-3	지속적으로 혼합
1 g 포도	MP Biomedicals	152527	pH 7.2로 조정하고 필터를 사용하여 살균합니다.
1 g 트레할로스	시그마-알드리치	T0167	0.22 &마이크로; m 일회용 병탑 필터
10 mL 100X 페니실린/스트렙토마이신	Hyclone	SV30010	필터링된 페니실린과 스트렙토마이신 soln 를 추가합니다. 이전 사용
Incomplete Bge  medium(Ibge)			900 mL 용액의 경우
>220 mL Schneider' s 초파리 배지 변형	Lonza	04-351Q	믹스 슈나이더 배지 680 mL ddH2O
4.5 g 락트 알부민 효소 분해물	Sigma-Aldrich	L9010	락 알부민 가수 분해물 및 갈락토스
1.3 g 갈락토스	Sigma-Aldrich	G0625	pH 7.2로 조정하고 0.22 µ를 사용하여 필터 살균; m 사전 멸균된 일회용 병탑 필터
완전한 Bge 매체 (cBge)			100 mL의 용액
>90 mL 불완전한 Bge 매체			FBS를 가열비활성화하려면: 해동된 FBS를 incubate
9 mL 열 inact. 태아 소 혈청 (FBS) (Optima)	Atlanta Biologicals	S12450	수조 60°C; C 1시간 동안 부드럽게
1 mL 100X 페니실린/스트렙토마이신	Hyclone	SV30010	매 10분마다 병을 휘젓습니다 15-mL 튜브에 FBS 열 비활성화; 및 -20°C. 에 보관하십시오. 매체 + FBS 및 필터를 혼합하여 0.22 µ를 사용하여 멸균합니다. M 사전 살균  일회용 보틀탑 필터  사용 전에 페니실린과 스트렙토마이신을 추가하십시오
Pond water (stock solution)			1L의 stock solution
>12.5 g 칼슘 카보네이	Fisher Scientific	C64-500	모든 염을 ddH2O
1.25 g 마그네슘 카보네이트 1L	Fisher Scientific	M27-500	주의하십시오. 염이 완전히
1.25 g  나트륨 염화	Fisher Scientific	S271-3	용해.  세게 흔들어 중단시키세요
0.25 g  칼륨 클로라이드	Sigma-Aldrich	P5405	염을 만들기 전에 솔른
<강한>연못 물 (작동 용액)			<강한>1.5L 용액
>0.8 mL 주식 용액 연못 물 (사용 전 쉐이크) in			ddH2O
1500 mL의 ddH2O			고압멸균으로 연못 물을 살균합니다(느린  주기)
100X 페니실린/스트렙토마이신 1.5mL;	Hyclone	SV30010	사용 전 페니실린과 스트렙토마이신을 추가합니다
Saline (1.2% NaCl)			1.5L of solution
18 g sodium chloride를 ddH2O	Fisher Scientific	S271-3	오토클레이브 식염수
1.5mL에 추가하여 100X 페니실린/스트렙토마이신 1.5mL	Hyclone	SV30010	사용 전에 페니실린과 스트렙토마이신을 추가하십시오
<강력한>추가 장비 및 재료:
7-L 마우스 안락사 챔버			승인 IACUC 프로토콜 번호 V001551
Mice	Taconic Biosciences		Swiss-Webster, 암컷, 6-wk, murine
CO2 탱크 및 조절기			병원균이 없는
24웰 조직 배양 플레이트	TPP	92424
1-L 부피 플라스크
광원(150W)	Chiu Tech Corp	모델 F0-150
원심분리기, 냉장, 스윙 버킷	Eppendorf	모델 5810R
원심분리기 병 (250 mL)	Nalgene
15-mL 원심분리 튜브, 멸균	Corning	430053
멸균 일회용 이송 피펫	피셔 사이언티픽	1371120
0.22 &마이크로; M 사전 멸균된 일회용 병탑 필터	EMD Millipore	SCGPS05RE
스테인리스 스틸 블렌더	Waring Commercial	Model 51BL31
블렌더 컵, 100 mL 용량	Waring 상업용
반전 복합 현미경	Nikon Instruments	이클립스 TE300

은 당 트 에 혼합하십시오. 물 에 스톡을 혼합하여 를 살균합니다