방법 논문

해 부 및 마우스 뇌 개발의 코로나 슬라이스 준비

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DOI:

10.3791/56356

⸱

2017년 11월 16일

 ,  ,  , 
1Department of Pathophysiology, Second Military Medical University, 2Department of Cell Biology, Second Military Medical University

이 논문에서

요약

우리는 뇌 하 수 체 동맥 해 부 개발 쥐에서 뇌 코로나 섹션을 준비 하는 프로토콜을 제시.

초록

뇌 하 수 체 또는 hypophysis 항상성에 필수적인 호르몬을 분 비 하는 중요 일 분 비 기관 이다. 그것은 별도 배아 기원과 기능을 가진 두 개의 동맥 이루어져 있다-는 neurohypophysis와는 adenohypophysis. 개발 마우스 뇌 하 수 체는 길쭉한 타원형 모양으로 섬세 하 고 작은. 마우스 뇌 하 수 체의 단일 조각에 adenohypophysis 및 neurohypophysis를 표시 하는 코로나 섹션 선호 된다.

이 프로토콜의 목표 달성 마우스 개발에서 잘 보존 된 조직 구조와 적절 한 뇌 코로나 섹션 것입니다. 이 프로토콜에서 우리 자세히 해 부 제대로 개발 하는 쥐에서 뇌 하 수 체 분 비를 처리 하는 방법을 설명 합니다. 첫째, 쥐 해 부 하기 전에 포름알데히드의 transcardial 관류에 의해 고정 됩니다. 다음 세 가지 다른 해 기술 쥐의 나이 따라 그대로 뇌 하 수 체 땀 샘을 얻을에 적용 됩니다. 태아 쥐 세 일 최대 배아 일 (전자) 17.5-18.5와 신생아, trigeminal 신경, 동맥, 설상 골을 포함 하 여 전체 sella 지구는 해 부. 강아지에 대 한 세 출생 후 일 (P) 5 월 14 일, 뇌 하 수 체 땀 샘 삼차 신경으로는 전체적으로 해 부. 마우스 3 주 이상, 뇌 하 수 체 분 비는 신중 하 게 해 부 무료 주변 조직에서. 우리는 또한 코로나 섹션 만족을 얻기 위해 주변 조직 랜드마크로 서 사용 하 여 적절 한 방향에서 뇌 하 수 체 땀 샘을 포함 하는 방법을 표시 합니다. 이 메서드는 마우스 개발에 뇌 하 수 체 동맥의 조직학 및 발달 기능 분석에 유용 합니다.

서론

뇌 하 수 체 또는 hypophysis 항상성1,2에 필수적인 호르몬을 분 비 하는 중요 일 분 비 기관 이다. 해부학, 뇌 하 수 체는 neurohypophysis와는 adenohypophysis 구성 된 ' 2-에-하나 ' 구조 이다. 이 부분 매우 다르게 다른 배아 기원과 기능 있다. neurohypophysis 신경 ectoderm에서 파생 되 고 옥 시 토 신과 antidiuretic 호르몬을 secretes. adenohypophysis Rathke의 주머니에서 유래 되며 성장 호르몬, 갑 상선-자극 호르몬, 여 포-자극 호르몬, 황 호르몬, prolactin adrenocorticotropic 호르몬 등 호르몬의 출시에 대 한 책임 및 melanocyte-자극 호르몬3,,45.

뇌 하 수 체 마우스 두개골의 설상 골 (sella turcica)의 등 쪽 표면에 그리고 연약한 줄기로는 뇌의 바닥에 연결. 삼차 신경 및 anteriorly 광학 chiasm6,7옆으로 포위 된다. 선 그것의 긴 축 머리의 수직으로 길쭉한 타원형 모양이 있다. 그것의 등 쪽 표면에는 neurohypophysis와는 adenohypophysis 수 쉽게 수 구분, 등 쪽 중간 지역 및 옆으로 및 ventrally 후자의 확장 점령 전와. 출생 후 개발 하는 동안 뇌 하 수 체의 크기 출생8,9후 첫 번째 달에서 급속 하 게 증가 한다. 그럼에도 불구 하 고, 마우스 뇌 하 수 체는 여전히 매우 작습니다 1.9 mg의 평균 무게와 긴 축 직경 3 m m의 크기에 성인10, 21 (P21), 출생 후 하루에 2-2.5 mm P0에만 1-1.5 m m의 긴 축 직경에.

마우스 뇌 하 수 체의 단일 조각에 adenohypophysis 및 neurohypophysis를 표시 하는 코로나 섹션 선호 된다. 그러나, 몇 가지 기술은 개발 하는 그것의 매우 작은 크기와 뚜렷한 해부학 쥐에서 뇌 하 수 체 땀 샘의 코로나 섹션 만족을 얻을 해야 합니다. 이 비디오 자료 마우스 뇌 하 수 체 동맥 해 부 다른 개발 단계에서 뇌 코로나 섹션을 준비 하는 방법을 보여 줍니다.

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프로토콜

C57BL/6 마우스 특정 병원 체 자유로운 조건에서 사육 된다. 동물 관리 및 두 번째 군사 의학 대학에서 윤리 위원회에 의해 승인 지침 준수는 모든 동물 실험 방법.

1. 해 부의 출생 후 개발 뇌

  1. 수행 마 취: 저체온증을 유발 하 얼음에 신생아 쥐 (P0-P5) 장소. 쥐 나이의 5 일 보다 오래 된, 대 한 마 취를 유도 하기 위해 5% 우 레 탄 (몸 무게의 30 µ L/g)을 intraperitoneally 주사. 꼬리/발가락 pinches 응답을 평가 합니다. 마우스는 유해 자극에 반응 하는 후에 진행.
  2. 부드럽게 녹화는 forepaws에 의해 (얼굴 위쪽으로 뒤에 누워) 부정사 위치에 마우스를 확보 하 고 되 고 수 있는 작업 표면에 hindpaws (즉, 스티로폼) 화학 증기 두건 안쪽 고정.
  3. Transcardial 관류 수행.
    1. 마우스 흉 곽을 마음 (및 기타 흉부 장기) 노출 수술가 위로 잘라.
    2. 무딘 집게와 뛰는 심장을 장악 하 고 좌 심 실에 26 G (0.45 m m) 바늘을 삽입. 버퍼링 heparinized 인산 염 분 가득한 10 mL 주사기 바늘 연결 (PBS; 5 mg/mL 나트륨 아 질산염 및 10 U/mL 헤 파 린 보충, pH 7.4, 따뜻하게 사용 하기 전에 37 ° C). 즉시 오른쪽 아 트리 움 잘가 위로 자르고 오른쪽 아 트리 움 종료 액체는 분명 때까지 따뜻한 PBS 가진 시체를 perfuse 시작.
      참고: 대략 5-10 mL PBS 신생아 쥐에 대 한 필요와 성인 쥐에 대 한 10-20 mL PBS.
    3. 바늘 그 자리에 유지 하 고 다른 주사기 4 %paraformaldehyde (PFA; pH 7.4)으로 가득 변경 합니다. 10 mL과 대 한 정착 액의 20 mL perfuse 신생아와 P21 마우스, 각각.
      주의: PFA 독성이 있다. 그것은 피부 및 호흡기 자극, 눈 손상 일으킬 수 있습니다. 장갑을 착용 하 고 화학 후드 작업.
  4. PFA-고정 마우스 목을 벨 및 두개골 뼈가 위로 자르면.
    1. 는 부드럽게 리프트는 두개골의 기지에서 hindbrain 작은 집게. Sella turcica의 첫 징후, 정지 해제 하지만 보류 hindbrain, 뇌 줄기 및 좋은 위 두뇌의 기지에 연결 하는 신경 섬유 절단. 이 단계는 뇌 하 수 체는 뇌와 멀리 리프트 되지 않습니다 보장 하기 위해 중요 하다.
    2. 다음 두뇌 운동 계속 하 고 뇌를 완전히 노출 하는 뇌를 제거 합니다. 뇌 하 수 체, 측면 trigeminal 신경를 포함 하 여 전체 sella 지역 잘라 고 설상 뼈가 (약 3 x 5 m m 2) 위 아래.
  5. 35 m m 음식 또는 찬 4 %2 mL를 포함 하는 6-잘 접시의 한 잘 해 부 조직 넣어 PFA (pH 7.4). P0-p 7 pituitaries, P14 pituitaries, P21-P28 pituitaries, 및 성인 pituitaries 3 h 1.5 h에 대 한 1 시간 40 분 동안 4 ° C에서 조직 수정.
  6. 뇌 하 수 체의 추가 분리
    1. 씻어 10 mL PBS, 5 변화, 15 분 함께 고정된 조직. 그 주변 조직 함께 신생아 뇌와 설상 뼈 아래 탈수에 직접 처리할 수 있습니다. 그러나 5 일 보다 오래 된 쥐에서 뇌 하 수 체 동맥 해리 될는, 스테레오 현미경 더.
    2. 1 mL PBS를 포함 하는 35 mm 접시에 고정된 조직을 넣어. P5-P14 pituitaries에 대 한 신경 및 미세 집게와가 위, 뼈 사이 연결 막 제거 하 고 신중 하 게 전체 하지만 sella turcica 떠나 함께 측면 trigeminal 신경 뇌 하 수 체를 분리 합니다. 절연된 선 및 신경으로 연결 막으로 연결 되는 " H "-같은 모양 ( 그림 1B).
    3. 위한 P21 및 성인 pituitaries, 신경 및 뇌 하 수 체는 주위 연결 막 제거 하 고 주변 조직에서 선 무료. 렌즈 청소 티슈 페이퍼와 뇌 조직을 포장 하 고 포함 카세트에 넣어.
      참고: 작은 뇌 하 수 체 렌즈 청소 티슈 페이퍼 감싸기 표본의 어떤 잠재적인 손실을 방지 하 고 다음 파라핀 포함 절차에서 조직의 무결성을 유지 도움이 됩니다. 곳을 알아내는 포함 절차에서 작은 병에서 처리 하는 경우는 뇌 하 수 체를 포장 하는 데 필요한 되지 않을 수 있습니다.

2. 소스 및 단면화 파라핀

  1. 탈수 15 분에 대 한 50%, 65%, 75%, 및 95% 에탄올 솔루션 카세트 포함에 표본. 그 후 탈수 순수 에탄올, P0-으로 각 3 분의 3 변화 땀 샘 P4, P5-P14 땀 샘, 그리고 5 분으로 각 4 분 P21 및 이전에 대 한. 크 실 렌와 명확한 3 변경, P0-으로 각 3 분 땀 샘 P4, P5-P14 땀 샘, 그리고 5 분으로 각 4 분 P21 및 이전 합니다. P0-P4 땀 샘에 녹은 파라핀 왁 스, 3 변화, 7 분 침투 그리고 8 분 두 번 6 분 한 번 P5 및 오래 된 샘.
    참고: 조직 처리에 대 한 최적의 조정할 수 있다 경험. 높은 품질 섹션을 얻으려면, 부족 또는 이상 탈수를 피해 야 한다. 크 실 렌을 사용 하 여 조직 삭제에 대 한 마찬가지입니다.
  2. 방향을 포함 하는 때
    1. 콘솔 시스템을 포함 하는 조직에 카세트에서 표본 제거 고 그것 기본 몰드 반 녹은 파라핀 왁 스로 가득 합니다. 포함 뇌 하 수 체의 올바른 방향 코로나 섹션을 만족 시키기 위해 필수적 이다.
    2. 위한 P21 및 성인 뇌 하 수 체 동맥, 뇌 하 수 체의 짧은 축 기준 형 (단면)의 하단 표면에 수직으로 위치. 설상 뼈와 삼차 신경 해부학 랜드마크로 서 P0-p 4와 P5-P14 pituitaries에 대 한 각각 사용 합니다. 동양 그들의 trigeminal 신경 또는 횡단 lamina 기본 몰드의 하단 표면에 수직인 설상 뼈의 표본.
    3. 부드럽게 잡고 조직 원하는 위치에 따뜻하게 잘 집게로 왁 스 냉각 접시에 반 고체 될 때까지. 녹은 파라핀 왁 스 몰드를 가기. 왁 스가 완전히 경화 될 때까지 냉각 파라핀 블록 허용.
      참고: 같은 방법으로 신생아 뇌 하 수 체는 뇌 하 수 체 배아 일 18.5에서 (E18.5)을 치료 수 있습니다. pituitaries 하지만 (Rathke ' s 파우치) E16.5 전체 머리 포함 해야 하 고 기본 몰드의 하단 표면에 수직 (미가 입)에서 화살 축 중심 보다 젊은.
  3. 10-20 분 동안-20 ° C에 파라핀 블록을 진정 하 고 다음 컷에 얇은 조각 (4 µ m 두께 선호)는 톰으로. 만족을 코로나 섹션, 정밀한 단면 중 파라핀 블록의 위치를 조정 합니다. 다음 절차에서 분할의 분리를 방지 하기 위해 polylysine 코팅 유리 슬라이드에 조직의 조각을 마운트.
    참고: 또는, 표본 수 탈수 있을 15%에서 30% (W/V) 자당 솔루션 (PBS) 그들은 동일한 방향 메서드를 사용 하는 곳을 알아내는 포함 화합물에 포함 하 고 신속 하 게 드라이 아이스에 냉동 바닥에 침 몰 될 때까지 4 ° C에서. 다음 8-10 µ m는 cryostat를 사용 하 여 조각으로 냉동된 조직 블록을 잘라. 그러나 곳을 알아내는-섹션의 형태, 파라핀 섹션을 열 등 한 자주는.

3. H & E 얼룩이 지 고 면역 형광 라벨

  1. 따뜻한 열에 슬라이드 55 ° C에서 차단 및 크 실 렌, 2 변화, 4 분 각 dewax. 95% 에탄올 두 번와 75% 에탄올 두 번, 3 분 샘플을 탈수. 세척 통에 5 분 증류수와 슬라이드.
  2. H에 대 한 & 전자 얼룩, 얼룩 졸업생 되며 솔루션 6 분에 대 한 섹션, runn에 씻어ing 수돗물 2 분 45 s, 및 2 분 동안 물에 씻어 다시 0.2% 암모니아 물으로 구분 합니다. 1 분 2 분에 오신으로 얼룩 순차적으로 탈수, 취소, 그리고 탑재 다음 섹션 95% 에탄올을 탈수.
    1. 면역 형광 라벨 3% H 2 O 2와 0.01% 할머니 3 생 peroxidases을 비활성화를 실 온에서 20 분을 포함 하는 메탄올을 가진 섹션을 취급 합니다. 검색 끓는 2 분 품에 대 한 압력 밥 솥에서 검색 버퍼 (1 mM EDTA와 1 mM Tris HCl, pH 7.4)에 섹션 37에서 30 분 동안 차단 버퍼 (PBS에 5% 염소 혈 청) 섹션 항 ° c.
    2. 토끼 반대로 성장 호르몬 (GH) 항 체 (1:2, 000) 또는 토끼 (GFAP) 안티 폐해 fibrillary 산 성 단백질 항 체 (1:2, 000) 섹션 4에서 하룻밤 블로킹 버퍼에 희석을 품 어 ° c.
    3. 37 35 분 이차 항 체 (염소-토끼 IgG-HRP, 블로킹 버퍼에 1:300) 섹션을 품 어 ° c.
    4. 실 온에서 15 분 동안 Biotinyl Tyramide (0.3% H 2 O 2를 포함 하는 Tris 버퍼 식 염 수에 1:50)를 사용 하 여 신호를 증폭 및 시각화 Streptavidin Alexa594 또는 488 (차단 버퍼, 30 분, 37 ° C에 1:300).
    5. Counterstain 실 온에서 5 분 동안 DAPI (PBS에 50 mg/L)와 핵.
      참고: 그것은 수 없습니다 Tyramide 신호 증폭 (TSA) 시스템을 사용 하 여 신호를 증폭 하는 데 필요한. 또는, 형광 활용 된 이차 항 체는 신호를 시각화 하기 위해 사용할 수 있습니다.
  4. 형광 현미경을 사용 하 여 취득 이미지 갖춘 DAPI, 텍사스, 빨강과 FITC 필터 세트 × 4/0.13 × 40/0.75 목표 5.0 메가 픽셀 카메라. 사용 하 여 360, 488, 594 nm 레이저 파장 이미징 DAPI, 알 렉 사 488-, 및 알 렉 사 594 스테인드 섹션, 각각. 레이저 파워 최적화 (0.8은 일반적으로 사용 되었다) 및 각 채널에 대해 원하는 수준으로 노출 시간. 이미지 수집 소프트웨어 제어 아래 이미지 및 이후 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 형광 이미지 오버레이.

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결과

이 프로토콜 개발 쥐에서 뇌 하 수 체 동맥 해 부 하는 메서드를 제공 합니다. 신생아 마우스, 뇌 하 수 체, 삼차 신경 및 아래를 포함 하는 전체 sella 지역 설상 뼈 두개골의 기지에서 밖으로 해 부 했다. 작고 섬세 한 뇌 하 수 체 (그림 1A) 과정에서 그대로 남아. 5 일 보다 오래 된 마우스 측면 trigeminal 신경에 연결 된 뇌 하 수 체 분 비 했다 다음 격리. 마우스 잘 보존 되었다 p 7에서 고립 된 뇌 (그림 1B)의 총 구조. P21 마우스에 대 한 뇌의 크기는 신생아 마우스에 비해 현저 하 게 증가 되었다. 뇌 하 수 체의 주변 조직 (그림 1C)을 제거 하는 동안 성공적으로 보이지 않는 피해와 절연 했다.

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토론

Murine pituitaries 개발, 그것은 그들의 작고 연약한 기능 및 독특한 해 부 특성6,8적절 한 코로나 섹션을 기술적으로 어려운 되었습니다. 일부 연구 그룹 따라서 배아와 신생아 뇌11,12의 형태를 분석 하 중반 화살 섹션을 선택 했다. 하지만 뇌 하 수 체의 중반 화살 섹션 앞쪽, 중간, 수 이며 또한 단일 조각에서 후부 엽 코로나 섹션은 매우 선호 이러한 3 개의 돌출부의 최대 보기를 표시할 수 있습니다. 특히, 볼륨의 결정 등 뇌와 apoptotic의 수를 계산 및 셀, 확산의 지역 정량화 연구 코로나 섹션 그들의 대표자에서 중반 화살 섹션 보다 우량 하다. 여기, 우리는 하 부 뇌 하 수 체 땀 샘 고 마우스 개발에서 뇌 코로나 섹션을 준비 하는 방법 제시.

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (31201086, 31470759 및 31671219) 및 상하이 자연 과학 재단 (12ZR1436900)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Tools/Equipment
Surgical scissors-straightJinZhongJ21010은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다
고급 가위-strainghtJinZhongWA1010은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다
둔기 집게JinZhongJD1020은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다
Fine forceps뇌하수체 분리용DumontRS-5015
26G(0.45mm) 바늘HongDa경막 관류용
주사기(1mL)BD300841다른 공급업체에서 구매 가능
주사기(10mL)BD는 다른 공급업체에서 구매 가능
35mm 접시Corning430165다른 공급업체에서 구매 가능
렌즈 청소지ShuangQuan은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다
해부학 현미경OLYMPUSSZX-ILLB2-200은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다
임베딩 카세트Thermo Fisher22-272423다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다
조직 임베딩 콘솔 시스템KEDEEKD-BM11은 다른 공급업체
MicrotomeThermo FisherHM315R은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다
Superfrost-Plus 슬라이드Thermo Fisher22-037-246은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다
커버 유리Thermo Fisher12-543은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다
. 형광 현미경OLYMPUSBH2-RFCA는 다른 공급업체
>이름Company카탈로그 번호Comments
Reagents
UrethaneBBIEB0448
NaClSigmaS9625for PBS
KClSigmaP9541PBS용
Na2HPO4.12H2O시그마71650PBS
K2HPO4시그마P2222PBS
NaNO2시그마237213
헤파린 나트륨 주입SPHH31022051관류 식염수
파라포름알데히드(PFA)시그마P6148
에탄올SCR10009218
XyleneSCR10023418
파라핀써모 피셔8330
Hematoxylin시그마H9627H& E 염색
Eosin Y시그마E4009H& E 염색
토끼 반대로 성장 호르몬 (GH)immunostaining국가 호르몬
뇌하수체 프로그램
immunostainingGFAP 항체시그마G9269
,immunostaining잭슨111-035-003
NEN 생명 과학 제품면역염색을 위한NEL700
, 알렉사 플루어 594써모 피셔S32356염색
방지 FITC 알렉사 플루어 488써모 피셔A11090염색을 위한
. . . 은 에서 구입할 수 있습니다.. . 항체를 위한 염소 반대로 토끼 IgG를 위한 토끼 반대로 쥐TSA 체계를 위한 HRP 스트렙타비딘 면역 면역

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