해 부 및 마우스 뇌 개발의 코로나 슬라이스 준비

Summary

우리는 뇌 하 수 체 동맥 해 부 개발 쥐에서 뇌 코로나 섹션을 준비 하는 프로토콜을 제시.

Abstract

뇌 하 수 체 또는 hypophysis 항상성에 필수적인 호르몬을 분 비 하는 중요 일 분 비 기관 이다. 그것은 별도 배아 기원과 기능을 가진 두 개의 동맥 이루어져 있다-는 neurohypophysis와는 adenohypophysis. 개발 마우스 뇌 하 수 체는 길쭉한 타원형 모양으로 섬세 하 고 작은. 마우스 뇌 하 수 체의 단일 조각에 adenohypophysis 및 neurohypophysis를 표시 하는 코로나 섹션 선호 된다.

이 프로토콜의 목표 달성 마우스 개발에서 잘 보존 된 조직 구조와 적절 한 뇌 코로나 섹션 것입니다. 이 프로토콜에서 우리 자세히 해 부 제대로 개발 하는 쥐에서 뇌 하 수 체 분 비를 처리 하는 방법을 설명 합니다. 첫째, 쥐 해 부 하기 전에 포름알데히드의 transcardial 관류에 의해 고정 됩니다. 다음 세 가지 다른 해 기술 쥐의 나이 따라 그대로 뇌 하 수 체 땀 샘을 얻을에 적용 됩니다. 태아 쥐 세 일 최대 배아 일 (전자) 17.5-18.5와 신생아, trigeminal 신경, 동맥, 설상 골을 포함 하 여 전체 sella 지구는 해 부. 강아지에 대 한 세 출생 후 일 (P) 5 월 14 일, 뇌 하 수 체 땀 샘 삼차 신경으로는 전체적으로 해 부. 마우스 3 주 이상, 뇌 하 수 체 분 비는 신중 하 게 해 부 무료 주변 조직에서. 우리는 또한 코로나 섹션 만족을 얻기 위해 주변 조직 랜드마크로 서 사용 하 여 적절 한 방향에서 뇌 하 수 체 땀 샘을 포함 하는 방법을 표시 합니다. 이 메서드는 마우스 개발에 뇌 하 수 체 동맥의 조직학 및 발달 기능 분석에 유용 합니다.

Introduction

뇌 하 수 체 또는 hypophysis 항상성^1,2에 필수적인 호르몬을 분 비 하는 중요 일 분 비 기관 이다. 해부학, 뇌 하 수 체는 neurohypophysis와는 adenohypophysis 구성 된 ' 2-에-하나 ' 구조 이다. 이 부분 매우 다르게 다른 배아 기원과 기능 있다. neurohypophysis 신경 ectoderm에서 파생 되 고 옥 시 토 신과 antidiuretic 호르몬을 secretes. adenohypophysis Rathke의 주머니에서 유래 되며 성장 호르몬, 갑 상선-자극 호르몬, 여 포-자극 호르몬, 황 호르몬, prolactin adrenocorticotropic 호르몬 등 호르몬의 출시에 대 한 책임 및 melanocyte-자극 호르몬^3,,45.

뇌 하 수 체 마우스 두개골의 설상 골 (sella turcica)의 등 쪽 표면에 그리고 연약한 줄기로는 뇌의 바닥에 연결. 삼차 신경 및 anteriorly 광학 chiasm

Protocol

C57BL/6 마우스 특정 병원 체 자유로운 조건에서 사육 된다. 동물 관리 및 두 번째 군사 의학 대학에서 윤리 위원회에 의해 승인 지침 준수는 모든 동물 실험 방법.

1. 해 부의 출생 후 개발 뇌

1. 수행 마 취: 저체온증을 유발 하 얼음에 신생아 쥐 (P0-P5) 장소. 쥐 나이의 5 일 보다 오래 된, 대 한 마 취를 유도 하기 위해 5% 우 레 탄 (몸 무게의 30 µ L/g)을 intraperitoneally 주사. 꼬리/발가락 pinches 응답을 평가 합니다. 마우스는 유해 자극에 반응 하는 후에 진행.
2. 부드럽게 녹화는 forepaws에 의해 (얼굴 위쪽으로 뒤에 누워) 부정사 위치에 마우스를 확보 하 고 되 고 수 있는 작업 표면에 hindpaws (즉, 스티로폼) 화학 증기 두건 안쪽 고정.
3. Transcardial 관류 수행.
   1. 마우스 흉 곽을 마음 (및 기타 흉부 장기) 노출 수술가 위로 잘라.
   2. 무딘 집게와 뛰는 심장을 장악 하 고 좌 심 실에 26 G (0.45 m m) 바늘을 삽입. 버퍼링 heparinized 인산 염 분 가득한 10 mL 주사기 바늘 연결 (PBS; 5 mg/mL 나....

Results

이 프로토콜 개발 쥐에서 뇌 하 수 체 동맥 해 부 하는 메서드를 제공 합니다. 신생아 마우스, 뇌 하 수 체, 삼차 신경 및 아래를 포함 하는 전체 sella 지역 설상 뼈 두개골의 기지에서 밖으로 해 부 했다. 작고 섬세 한 뇌 하 수 체 (그림 1A) 과정에서 그대로 남아. 5 일 보다 오래 된 마우스 측면 trigeminal 신경에 연결 된 뇌 하 수 체 분 비 했다 다음 격리. 마우스 잘 보존 되었다 p 7에서 고립 된 뇌 (그림 1B)의 총 구조. P21 마우스에 대 한 뇌의 크기는 신생아 마우스에 비해 현저 하 게 증가 되었다. 뇌 하 수 체의 주변 조직 (그림 1C)을 제거 하는 동안 성공적으로 보이지 않는 피해와 절연 했다.

Discussion

Murine pituitaries 개발, 그것은 그들의 작고 연약한 기능 및 독특한 해 부 특성^6,8적절 한 코로나 섹션을 기술적으로 어려운 되었습니다. 일부 연구 그룹 따라서 배아와 신생아 뇌^11,12의 형태를 분석 하 중반 화살 섹션을 선택 했다. 하지만 뇌 하 수 체의 중반 화살 섹션 앞쪽, 중간, 수 이며 또한 단일 조각에서 후부 엽 코로나 섹션은 매우 선호 이러한 3 개의 돌출부의 최대 보기를 표시할 수 있습니다. 특히, 볼륨의 결정 등 뇌와 apoptotic의 수를 계산 및 셀, 확산의 지역 정량화 연구 코로나 섹션 그들의 대표자에서 중반 화살 섹션 보다 우량 하다. 여기, 우리는 하 부 뇌 하 수 체 땀 샘 고 마우스 개발에서 뇌 코로나 섹션을 준비 하는 방법 제시.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tools/Equipment
Surgical scissors-straight	JinZhong	J21010	은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다
고급 가위-strainght	JinZhong	WA1010	은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다
둔기 집게	JinZhong	JD1020	은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다
Fine forceps	뇌하수체 분리용	Dumont	RS-5015
26G(0.45mm) 바늘	HongDa		경막 관류용
주사기(1mL)	BD	300841	다른 공급업체에서 구매 가능
주사기(10mL)	BD		는 다른 공급업체에서 구매 가능
35mm 접시	Corning	430165	다른 공급업체에서 구매 가능
렌즈 청소지	ShuangQuan		은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다
해부학 현미경	OLYMPUS	SZX-ILLB2-200	은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다
임베딩 카세트	Thermo Fisher	22-272423	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다
조직 임베딩 콘솔 시스템	KEDEE	KD-BM11	은 다른 공급업체
Microtome	Thermo Fisher	HM315R	은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다
Superfrost-Plus 슬라이드	Thermo Fisher	22-037-246	은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다
커버 유리	Thermo Fisher	12-543	은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다
. 형광 현미경	OLYMPUS	BH2-RFCA	는 다른 공급업체
>이름	Company	카탈로그 번호	Comments
Reagents
Urethane	BBI	EB0448
NaCl	Sigma	S9625	for PBS
KCl	Sigma	P9541	PBS용
Na2HPO4.12H2O	시그마	71650	PBS
K2HPO4	시그마	P2222	PBS
NaNO2	시그마	237213
헤파린 나트륨 주입	SPH	H31022051	관류 식염수
파라포름알데히드(PFA)	시그마	P6148
에탄올	SCR	10009218
Xylene	SCR	10023418
파라핀	써모 피셔	8330
Hematoxylin	시그마	H9627	H& E 염색
Eosin Y	시그마	E4009	H& E 염색
토끼 반대로 성장 호르몬 (GH)	immunostaining	국가 호르몬
	뇌하수체 프로그램
immunostaining	GFAP 항체	시그마	G9269
,	immunostaining	잭슨	111-035-003
	NEN 생명 과학 제품	면역염색을 위한	NEL700
, 알렉사 플루어 594	써모 피셔	S32356	염색
방지 FITC 알렉사 플루어 488	써모 피셔	A11090	염색을 위한