방법 논문

양적 Confocal 반사 현미경을 통해 3D 매트릭스에 포유류 세포 분열

DOI:

10.3791/56364

⸱

2017년 11월 29일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Johns Hopkins University, 2Johns Hopkins Physical Sciences - Oncology Center, Johns Hopkins University, 3Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University, 4Departments of Oncology and Pathology and Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 효율적으로 세포 분열의 동기화를 통합 하 여 3D 콜라겐 매트릭스에 포유류 세포 분열을 연구 부문 이벤트 라이브 셀 이미징 기법, 시간 해결 confocal 반사 현미경을 사용 하 여 3D 매트릭스에서의 모니터링 그리고 양적 이미징 분석입니다.

초록

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어떻게 포유류의 세포 연구 규제는 3d 환경 크게 그것의 생리 적인 관련성 및 치료의 중요성에도 불구 하 고 미개척 남아. 탐험의 부족에 대 한 가능한 이유는 실험 제한 및 비효율적인 3D 문화에서의 세포 연구를 렌더링 하는 기술적 과제 이다. 여기는 포유류 세포 분열 및 세포-매트릭스 상호 작용 3D 콜라겐 매트릭스에 효율적으로 공부 하는 영상 기반 방법에 설명 합니다. 형광 H2B 표시 셀 티 미 딘 및 nocodazole 처리, 기계적인 동요-오프 기술에 의해 다음의 조합을 사용 하 여 동기화 됩니다. 동기화 된 셀 다음 3D 콜라겐 매트릭스에 포함 됩니다. 세포 분열은 라이브 셀 현미경을 사용 하 여 모니터링 됩니다. 변형 콜라겐 섬유의 세포 분열, 세포-매트릭스 상호 작용은, 전후 동안 모니터링할 수 있습니다 그리고 양적 confocal 반사 현미경을 사용 하 여 계량. 포유류 세포 분열 및 세포-매트릭스 순수 관련 3D 환경에서 상호 작용을 공부 하는 효율적이 고 일반적인 접근 방식을 제공 합니다. 이 방법은 정상 조직과 질병 개발의 분자 기초에 새로운 통찰력을 제공 뿐만 아니라 또한 새로운 진단 및 치료 접근의 디자인에 대 한 수 있습니다.

서론

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세포 유사 분열의 규제 조직 및 장기 개발에 중요 한 역할 세포 인생에서 중요 한 이벤트입니다. 비정상적인 유사 분열은 자연 유전 변이, 인간의 노화 과정과 암1,2,3,,45의 진행에 연루 됩니다. 정상 세포와 비교 하는 종양 세포의 증식의 증가 속도 사실 셀 동작 종양의 종류 및 환자 중 에서도 상당히 이질적인에 불구 하 고 암의 특징 중 하나입니다. 유망한 임상 결과도 불구 하 고 일부 새로 개발 된 antimitotic 약물 임상 시험6,7,,89,10 에에서 효과가 표시 되지 않은 11. 실험 및 전 임상 모델의 관련성 고려 될 수 있다. 많은....

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프로토콜

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제공 하는 프로토콜의는 홈 우드 기관 검토 위원회 (HIRB) 지침을 따릅니다.

1. 안정적인 표현의 H2B mCherry 마커로 세포 유사 분열에 대 한

  1. 인간 미 발달 신장 293T에서에서 lentiviral 입자 (HEK 293T)의 세포
    1. HEK 293T 세포 세포 배양 매체 (Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 포함 된 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 그리고 1%에에서 106 셀/접시 x 5의 밀도에서 10 cm 세포 문화 접시에 접시 페니실린-스 (펜/Strep)). 37 ° C와 5% 이산화탄소 (CO2)에서 24 h에 대 한 품 어. Transfection 당일 셀의 원하는 confluency 약 70-80% 이다.
      참고: HEK 293T 세포는 여기 사용 됩니다 나중 transduce MDA-MB-231 셀을 안정적으로 H2B mCherry 표현 셀 라인을 생성 하려면 바이러스 입자를 생산 하는 데 사용 됩니다. 셀은 접시에 걸쳐 고르게 분포 하 고 있는지 확인 합니다. 셀의 추가 삭제 플레이트, 현명 하 고 부드럽게 이동 뒤로 앞 접시 분....

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결과

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이 문서의 목표 3 차원 행렬에 포유류 세포 분열 과정을 공부 하 고 동안 그리고 세포 분열 후 세포와 3 차원 기질 간의 상호 작용을 계량 하는 영상 기반 방법을 제시 하는입니다. 촉진 하기 위해 세포 유사 분열의 이미징, 우리 통합 H2B mCherry lentiviral 변환을 사용 하 여 MDA-MB-231 셀. 형광 단백질 활용 된 H2B interphase 셀, mitotic 세포를 구별 하 고 세포 유사 분열19,,2026동안 여러 단계를 정의 하 mitotic 표식으로 사용 됩니다. 이 메서드를 사용 하 여 안정적으로 H2B-mCherry 3D 콜라겐 매트릭스 (그림 1A)에서 표현 하는 MDA-MB-231 셀의 전체 부문 과정을 모니터 .......

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토론

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3d에서 세포 분열의 이전 연구 실험 제한 및 기술 과제18,19효율적인 아니었다. 3D 콜라겐 매트릭스에 포유류 세포 분열의 효율적인 연구를 위한 중요 한 단계는: (1) 셀;에 mitotic 마커 형광 표시 관 (2) 세포 분열;의 동기화 (3) 부문 이벤트 라이브 셀 이미징 기법, 시간 해결 confocal 반사 현미경 검사 법, 양적 이미지 분석을 사용 하 여 3D 매트릭스에서의 모니터링.

2D 기판에 mitotic 세포는 그들의 형태에 따라 interphase 셀에서 구별 될 수 있다, 즉, mitotic 세포는 원형 interphase 세포 밖으로 확산 하 고 기판에 단단히 부착 기판에 간신히 연결. 그러나 3 차원 행렬에서, 세포 형태학 mitotic 세포에 대 한 신뢰할 수 있는 마커 간신히 밖으로 확산 하는 일부 셀부터 이며 매트릭스

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공개 사항

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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

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이 작품은 NIH에 의해 지원 되었다 R01CA174388 및 U54CA143868를 부여. 저자는 PURA 수상 웨이 통 첸의 지원에 대 한 존스 홉킨스 대학에서 인정 하 고 싶습니다. 이 자료는 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 보조금 번호 1232825 아래에서 지 원하는 작업을 기반으로 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인간 배아 신장 293TATCC
MDA-MB-231물리 과학 종양학 센터, NIH
DMEMCorning10-013-CV
DMEM 분말ThermoFisher Scientific12100-046
소 태아 혈청HycloneSH30910.03
페니실린-스트렙토마이신 100X시그마-알드리치P0781
Fugene HDPromegaE2311
리포펙타민 2000Life technologies11668-07
렌티바이러스 벡터에서 H2B-mCherry 인코딩플라미드 Addgene plasmid 21217
ThymidineSigma-AldrichT1895
NocodazoleSigma-AldrichM1404
Opti-MEMLife Technologies31985-070
중탄산나트륨GibcoBRL11810-025
HEPESSigma-Aldrich113375-100
콜라겐코닝354236
NaOHJT Bake3722-01
Millex-HV 주사기 필터 장치, 0.45-μ m, PVDF, 33mmMilliporeSLHVM33RS
Nikon TE2000E 형광 현미경NikonTE2000E
Cascade 1K CCD 카메라Roper Scientific
NIS-Elements AR 이미징 소프트웨어Nikon
Nikon A1 컨포칼 현미경NikonA1
스

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ly, D. H., Lockhart, D. J., Lerner, R. A., Schultz, P. G. Mitotic misregulation and human aging. Science. 287 (5462), 2486-2492 (2000).
  2. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
  3. Brinkley, B. R.

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재인쇄 및 허가

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태그

3DH2B mCherry

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